梨类纤维素合成酶基因PbrCSLD5及其应用的制作方法

梨类纤维素合成酶基因pbrcsld5及其应用
技术领域
1.本发明属于植物基因工程领域，涉及梨类纤维素合成酶基因pbrcsld5及其应用，具体涉及从
‘
砀山酥梨’中分离、克隆得到一个具有调控梨花粉管细胞壁纤维素合成酶合成的基因pbrcsld5。


背景技术：

2.梨是蔷薇科(rosaceae)桃亚科(amygdaloideae)梨属(pyrus l.)的多年生木本植物，是我国第三大果树树种，栽培历史悠久，种植面积广泛(滕元文,2017)。在开花植物中，花粉管是有性繁殖过程中负责将雄配子传递给雌配子体的重要器官(hulskamp et al.,1995；lord and russell,2002)。花粉管细胞壁是维持花粉管细胞形态的重要因素之一(edlund et al.,2004)。花粉管细胞壁由纤维素、半纤维素、果胶、多糖和葡萄糖等组成，这些组成成分都拥有各自的分布和功能。研究表明，花粉管细胞壁的生物合成参与了花粉管生长的调节，纤维素作为细胞壁的重要组成部分，对花粉管的生长起重要作用。
3.纤维素是由纤维素合酶(cellulose synthase,cesa)复合物(cellulose synthase complexes,cscs)合成的，这些复合物在高尔基体中组装，然后运送到质膜，在质膜中合成纤维素(kimura et al.,1999；richmond and somerville,2000；taylor,2008)。已知烟草、拟南芥花粉管细胞壁纤维素含量分别为：5
‑
10％、30％，且分布在花粉管的尖端和柄部(amor et al.,1995；schlupmann et al.,1994)。
4.在植物中，存在着蛋白序列结构相似的纤维素合酶超家族(cellulose synthase superfamily)。纤维素合酶超家族包括cesa和纤维素合酶类似基因家族(csl:csla/b/c/d/e/f/g/h/j)(yin et al.,2009)，均属于糖基转移酶gt2家族，编码的蛋白质都具有糖基转移酶活性。在植物体细胞中发现几个csl基因编码半纤维素多糖的多糖合成酶，如atcsla基因参与了甘露聚糖的形成(dhugga et al.,2004；liepman et al.,2005)、atcslc基因编码的酶催化木葡聚糖骨架的伸长(cocuron et al.,2007)、cslf和cslh基因负责β
‑
(1
‑
3,1
‑
4)
‑
d
‑
葡聚糖的合成(burton et al.,2006；doblin et al.,2009)。在拟南芥花粉管以及根中，csld基因的突变体表现出根毛、花粉管极性生长受抑制(bernal et al.,2008)。但是到目前为止，尽管许多cesa基因已经被报道参与体细胞中纤维素的合成，在花粉管中负责纤维素合成的cesa/csl基因仍然鲜有报道。
5.本研究通过寻找梨花粉管中参与纤维素合成的主要基因，进一步探索其参与花粉管细胞壁纤维素合成的作用、发掘调控纤维素合成基因的转录因子以及花粉管中纤维素合成和沉积方式等，以便更好地了解纤维素在梨花粉管细胞壁发育过程中扮演的角色，为进一步理解梨花粉管细胞壁的形成提供依据。


技术实现要素：

6.本发明目的是提供一个调控梨花粉管细胞壁纤维素合成的纤维素合成酶基因pbrcsld5。
7.本发明另一目的是提供该基因的应用。
8.本发明的目的可以采用以下技术方案来实现：
9.一种分离自
‘
砀山酥梨’具有调控梨花粉管细胞壁纤维素合成功能的纤维素合成酶基因pbrcsld5，其核苷酸序列如seq id no.1所示，包含3381bp的开放阅读框；该基因编码1127个氨基酸，其编码的氨基酸序列如seq id no.2所示，等电点为5.84。
10.克隆上述基因pbrcsld5全长的引物对，该引物对由seq id no.3和seq id no.4组成，其核苷酸序列如下所示：
11.正向引物：5'
‑
atggcaacttcccagaatagaga
‑
3'(seq id no.3)
12.反向引物：5'
‑
tcacggaaattggaacccg
‑
3'(seq id no.4)。
13.含有上述纤维素合成酶基因pbrcsld5的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或宿主菌。
14.上述的重组表达载体，是以pcambia1301为出发载体，所述纤维素合成酶基因pbrcsld5的插入位点为xbai和bamhi。
15.上述纤维素合成酶基因pbrcsld5在调控花粉管细胞壁纤维素合成中的应用。研究表明，敲低pbrcsld5基因表达量会降低纤维素的含量，过表达pbrcsld5基因能够促进纤维素的合成。
16.上述的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或宿主菌在促进花粉管细胞壁纤维素合成中的应用。
17.本发明的有益效果：
18.通过对梨中花粉管不同生长时期转录组数据分析，申请者发现pbrcsld5特异在花粉管中表达，且在花粉管生长后期表达量快速上升，表明pbrcsld5在花粉管生长过程中起重要作用。用反义寡聚核苷酸实验(antisense oligodeoxynucleotide，as
‑
odn)敲低pbrcsld5基因表达量，并通过实时定量荧光pcr检验是否敲低pbrcsld5表达量后，使用细胞壁纤维素专一染料(fast scarlet 4b)s4b对odn处理后花粉管细胞壁纤维素染色，观察纤维素含量变化。通过农杆菌介导遗传转化方法在拟南芥中过表达pbrcsld5基因，获得转基因植株，经生物学功能验证，表明本发明克隆的pbrcsld5基因具有控制梨花粉管细胞壁纤维素合成。
附图说明
19.图1为梨pbrcsld5基因分离克隆。
20.图2为敲除pbrcsld5使梨花粉管中纤维素含量降低；
21.其中，a.qpcr分析表明，在反义寡核苷酸(as
‑
odn)处理下，花粉管pbrcsld5的表达量显著降低。b.对照、cyotfectin、s
‑
odn
‑
pbrcsld5和as
‑
odn
‑
pbrcsld5处理下花粉管中纤维素含量的测定。c.s4b对照、cyotfectin、s
‑
odn
‑
pbrcsld5和as
‑
odn
‑
pbrcsld5处理下花粉管的染色。bar＝20μm。d.不同处理下花粉管顶端(从花粉管顶端到花粉管柄面积为10μm)s4b荧光强度的分析。
22.图3为转基因拟南芥鉴定。
23.图4为转基因拟南芥花粉管细胞壁纤维素染色分析。
具体实施方式
24.以下结合具体实施例对本发明做出详细的描述。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。
25.实施例1：梨pbrcsld5基因分离克隆与超表达载体构建
26.取3μg
‘
砀山酥梨’花粉rna，用one
‑
step gdna removal and cdna synthesiskit(transgen,china)进行反转录，方法参照说明书。根据pcambia
‑
1301载体的多克隆位点和pbrcsld5基因的编码区序列上的酶切位点分析，首先以
‘
砀山酥梨’花粉cdna为模板，以seq id no.3和seq id no.4为引物，克隆得到基因pbrcsld5全长。选择xba i和bamh i作为内切酶。按照一般设计引物的原则用snapgene软件设计出带有酶切位点的引物seq id no.5和seq idno.6。50μl的反应体系中包括：200ng pbrcsld5q全长dna，1
×
缓冲液(transstart fastpfu buffer)，10mm dntp，1u taq聚合酶(transstart fastpfu dna polymerase)(前述缓冲液和taq聚合酶购自trans公司)，500nm上述引物。pcr反应在eppendorf扩增仪上按以下程序完成：95℃，预变性2分钟，95℃变性20秒，60℃退火20秒，72℃延伸1分钟，35个热循环，72℃延伸10分钟，4℃保存。产生一条单一pcr条带产物。结果如图1所示。
27.pcr产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测后，用小量胶回收试剂盒(购自康为世纪，按照该试剂盒提供的操作说明书操作)回收dna片段。pcambia1301载体的双酶切体系总体积为50μl，其中含有经过质粒提取获得的pcambia1301载体质粒10μl，10
×
buffer(购自neb公司)5μl，xba i 1μl，bamh i 1μl及水33μl。于37℃酶切3小时后回收。经过限制性内切酶消化过的表达载体pcambia1301与pbrcsld5基因使用重组酶exnase ii(购自vazyme公司)于37℃连接30分钟。反应总体积20μl，其中含有5
×
ce ii buffer 4μl，exnase ii 2μl，pbrcsld5基因的pcr回收产物2μl，pcambia1301载体的双酶切回收产物6μl及水6μl。取连接产物10μl转化大肠杆菌感受态dh5α，在含有50mg/l卡那霉素的lb固体平板中筛选出阳性克隆，抽提质粒进行酶切及pcr鉴定，重组质粒样品送生物公司测序。测序结果表明，pbrcsld5基因全长为3381bp，其核苷酸序列为seq id no.1所示，能编码1127个氨基酸残基的蛋白，序列为seq id no.2所示。我们将重组载体命名为lat52
‑
pbrcsld5
‑
gfp，应用冻融法将重组载体导入到农杆菌gv3101中。
28.实施例2：梨花粉管odn实验及纤维素含量和基因表达量检测
29.(1)梨花粉管odn实验
30.使用rna折叠web服务器(https://rna.tbi.univie.ac.at/cgi
‑
bin/rnawebsuite/rnafold.cgi)设计pbrcsld5的odn序列，并使用snap gene 2.4.3(https://www.snapgene.com)评估候选的as
‑
odn序列与靶区的匹配。用磷代寡核苷酸合成候选as
‑
odn序列和相应的sense
‑
odn序列，其中as
‑
odn
‑
pbrcsld5对应的引物序列为seq id no.9，s
‑
odn
‑
pbrcsld5对应的引物序列为seq id no.10。odn引物需要进行硫代修饰，并通过高效液相色谱进行纯化。将odn序列与lipofectamine 3000转染试剂(thermo fisher scientific)的混合物在25℃的培养基中孵育15min后开始实验。将该混合物加入花粉管培养液中(预培养1h)，保持终浓度为20μm odn。花粉管在25℃，120rpm下培养2h。400g离心后获得花粉管，保存于
‑
80℃用于rna分离。实验重复了三次。
31.as
‑
odn
‑
pbrcsld5：ccccgttcccacgtacacgg(seq id no.9)
32.s
‑
odn
‑
pbrcsld5：ccgtgtacgtgggaacgggg(seq id no.10)。
33.(2)纤维素含量测定
34.取梨花花粉加入花粉培养液中，在23
‑
25℃，100
‑
130rpm的摇床中培养3
‑
4h，离心收集，液氮快速冷冻。采集到的花粉在液氮环境中充分研磨，分别用80％乙醇、100％乙醇、甲醇
‑
氯仿(1:1，v:v)和丙酮清洗磨粒。每次洗涤后，通过离心收集沉淀。产生的不溶性细胞壁馏分在通风柜中干燥2天并称重。将称量好的干物质加入0.1m乙酸钠，在80℃下放置20分钟。离心上清，采用updegraff法测定纤维素含量(updegraff,1969)。简单地说，细胞壁材料被三氟乙酸(tfa)水解，updegraff试剂(乙酸:硝酸:水，8:1:2,v/v/v)水解剩余的木质素、果胶和半纤维素，产生结晶纤维素。用72％的硫酸将结晶纤维素水解为葡萄糖。用浓硫酸中新鲜制备的蒽酮试剂(2mg.ml
‑1)显色，用比色法测定葡萄糖含量，用葡萄糖溶液(0.1mg.ml
‑1)绘制标准曲线，计算花粉管细胞壁结晶纤维素含量。图2
‑
b为纤维素含量测定结果，结果表明与对照相比，odn处理之后纤维素含量明显降低，表明pbrcsld5该基因通过控制纤维素合成酶的合成进而影响纤维素的合成。
35.(3)基因表达量检测
36.提取odn处理之后的花粉rna,并通过分光光度计和琼脂糖胶检测提取样品的质量。取3μg提取的总rna，用one
‑
step gdna removal and cdna synthesis kit(transgen,china)进行反转录，方法参照说明书。荧光定量pcr所用引物为基因特异引物对：seq id no.7和seqid no.8；以pbrubp为内参基因，荧光定量试剂盒购自roche公司。real
‑
timepcr所用仪器为roche 480定量pcr仪，反应体系为：2
×
sybr greeni master mix 10μl，上下游引物(10μm)0.4μl，2μlcdna，7.2μlpcr级别的水。反应条件为95℃变性5min；95℃预变性5s，60℃退火10s，72℃延伸30s重复50个循环。图2
‑
a为基因表达量的检测，结果表明与对照相比，odn处理之后该基因的表达量降低。证明odn引物有效，达到预期效果。
37.实施例3：拟南芥的遗传转化及转化植株分子鉴定
38.用含有pbrcsld5过量表达载体的农杆菌，通过沾花法侵染col
‑
0拟南芥(clough and bent,1998)。具体方法如下：
39.1、用含有50mg/l k 和100mg/l r 的固体lb培养基划线活化农杆菌，在28℃的培养箱中培养36小时；
40.2、用灭菌的牙签或枪头挑取线上的单克隆，放入100ml锥形瓶中，加入30ml含有50mg/l k 和100mg/l r 的液体lb培养基，在28℃的摇床中200rpm培养12小时；
41.3、用50ml离心管5000rpm离心20分钟收集菌体；
42.4、将菌体重悬在同等体积的转化介质【1/2ms；5％蔗糖(w/v，g/100ml)；10μg/l 6
‑
ba；用koh调ph到5.7；0.025％表面活性剂(v/v)】中；
43.5、将待转化的拟南芥剪去角果和已开放的花；
44.6、把拟南芥花序浸泡在含有菌体的转化介质中，用真空抽滤泵抽真空到380mm汞柱，浸泡5分钟；
45.7、放置在22℃的培养室中避光24小时，之后放在22℃、长日照(16小时光照/8小时黑暗)条件下培养。
46.取潮霉素抗性两周大的拟南芥t1代阳性植株，取拟南芥叶片提取dna后，用pcr检测pbrcsld5表达量，引物为seq id no.7和seq id no.8。检测阳性苗用于后续实验。t3代纯
合子种子与野生型种子经过消毒一起播到了发芽培养基【ms；3％蔗糖(w/v，g/100ml)；0.75％琼脂(w/v，g/100ml)】上。种子发芽后将幼苗移到营养土中，放在22℃、长日照(16小时光照/8小时黑暗)条件下培养。图3为t3代转基因拟南芥鉴定。鉴定结果表明pbrcsld5已稳定转入拟南芥中。
47.实施例4：花粉培养基的配置
48.梨花粉基础培养基成分如下：0.55mm ca(no3)2，1.60mm h3bo3，1.60mm mgso4，1.00mm kno3，440.00mm蔗糖和5.00mm mes，ph用tris调至6.0
‑
6.2。花粉于25℃，120rpm的摇床中培养。
49.拟南芥花粉基础培养基成分如下：0.01％(g/100ml)h3bo3，5mm kcl，1mm mgso4，5mm cacl2，10％(g/100ml)蔗糖，ph用naoh调至7.5
‑
7.6。使用固体培养基时，需加入1.5％(g/100ml)低熔点琼脂糖。
50.实施例5：花粉管细胞壁纤维素染色
51.收集
‘
砀山酥梨’梨花粉的开花期，收集花粉添加到花粉培养基中，孵化在23
‑
25℃，100
‑
130转3
‑
4h，并收集花粉通过离心(3000转3分钟)使用4％多聚甲醛固定至少30分钟,用pbs洗涤3次(3000转3分钟)。使用pontamine fast scarlet 4b(s4b；sigma)，最终浓度为0.01％，至少染色5分钟，用pbs洗涤3次(3000rpm,3min)，染好花粉管。拟南芥花粉管的染色与梨花粉管类似。图2
‑
c和d为odn处理之后对正常培养的花粉管细胞壁纤维素进行染色，结果表明与对照相比，纤维素染色荧光强度降低，即纤维素含量降低，与测量纤维素含量结果一致。
52.实施例6：转基因拟南芥相关指标的测定
53.按照实施例5方法对转基因的拟南芥花粉染色，激光共聚焦显微镜观察纤维素分布情况。图4为t3代lat52:pbrcsld5
‑
gfp过表达拟南芥花粉管染色观察纤维素分布，发现过表达pbrcsld5会导致花粉管内纤维素的沉积和异常分布。
54.seq id no.1
55.atggcaacttcccagaatagagaaccgtcgaagaaggcgataaaaagccctgggggttctggtagctctcaaggcaaaactaattcgagtggccaaactgttaagtttgcgcgaaggacttcaagtggacgatatgtgagtctgtcaagagaagaccttgatatgtccggggaaatatctggggactatatgaactacacagttcatattccacccaccccggataaccagcccatggacacatccgtggctgtcaaggcagaggagcaatatgtttcgaattctttatttaccggagggttcaatagcgtgacacgtgcacatctcatggataaggtgattgattcggaggtgactcatcctcagatggctggagccaaaggctctgcatgcatgatgcctgcttgtgatggtaaggtgatgaaggatgagagaggagttgatataaccccttgtgattgcaggttcaaaatctgtagagattgctatttggatgcacagaaggacactggcctttgtccaggctgcaaggagcaatacagagtaggagacgaatatgatgagccatcggattacaacagtggaacgctgcaattgcctggtcctgacggaaaaagggataacatgtctgtgatgaagaggaaccaaacgggagaatttgatcacaataggtggttgtttgagaccaaggggacttatggtgttggcaatgctttcaatccccaagatgacgggtatggtgatggcggtggtgatggcttcccagggggctcgctggatgcagatgacaagccctggaagcccctcagcaggatattgccaatcccggctgccattatcagcccctacagattaatcgtgctatcattctttctgcattggagaatagtcaatccaaacaatgatgcaagatggctgtggctcatgtcgattatctgcgaaatatggttcgccttctcttggattcttgatcagactccaaagtttttccccattaatcgtcagaccgatcttgaagtcctccacgacaagtttgatatgccatcaccatccaatccaacgggccggtctgacctccctggcattgatttctatgtatcgactgctgatcctgacaaagagccacctctcaccactgccaatacca
tcctttcaatcctagccgttgattacccggttgaaaagatagcgtgctacatctctgatgatggaggtgccctcctcaccttcgaggcaatggcggaggctgctagttttgcggacttgtgggtccccttctgccggaagcacgacattgagccgaggaatccagacagttacttcgcgttgaaagttgacccaacaaagaacaagagtagtctggactttgtgaaggataggaggaagatcaagagggagtatgatgagttcaaggtgaggatcaacgggcttccggattcaatcaggaggcggtctgatgctttccatgccagggaggaaatgaagcagttgaagaatatgagggagaatggaactgaccctttggagcaagtcaaagtccccaaggctacatggatggctgatggcacacattggcctggtacttgggcggttccttcctatgaccacgccaaaggtgaccattccggaattcttcaggtgatgttgaagcctcctagtcctgactcactattgggaagtgccgatgatgacaaactcatagatttcacagatgtggatatacgcctgccgatgtttgtctacatgtcacgagaaaagcggccgggctatgatcacaacaagaaagctggcgccatgaatgcgctggtgagagcatccgccatcttgtcaaacggccctttcattctcaaccttgactgtgatcactacatcaacaactgcaaagctatccgtgaagggatgtgcttcatgatggacagaggcggtgaaaacatctgctacattcagtttcctcagagattcgaaggaattgatccctctgatcgctatgccaatcacaacaccgtgtttttcgacggcaatatgcgtgcgcttgatggtttgcagggtccgatgtacgtgggaacggggaccatgttccggcggtttgccttgtacggttttgatccaccaaatcctgacaagctgccggtgaagaaggatactgagacaccaggagagcctttgacacagtcgaacacagaacctttgacagcctgtgactttgacgcggatcttgacaccaatctacttcccaagcgttttggaaattcgacaatgctggcggaatccataccggttgctgagtaccaaggccgacccctagctgatcatcccgcagtgaaatttggacggcctccaggcattctcagagctcctcgtgatccgctagatgccacaaatgttgctgaagccgtgtcttccatttcttgctggtacgaggacaagaccgaatggggagaccgtgtggggtggatttacgggtcggtgacagaagacgtggtgacagggtacagaatgcacaaccgaggatggcgctcggtgtactgcgttaccaagcgtgacgcatttcgaggttcagctcccattaatctcactgatcgacttcaccaagtgctccgttgggcaacaggttctgtcgaaattttcttctctcggaacaatgccctcctcgcctcaatgcgcctcaaattactacagcgccttgcctacgtcaatgtcggtgtctaccctttcacctcgatctttctcatcgtgtactgcttcctcccagcactctcgctcttcactggacagttcatcgtggctaatctcaacatcacgtttttgatctacttgctaaccatcaccatatgcctcattgctctggccctcctggaggtgaggtggtcgggggtcgcgttggaagactggtggcgaaacgagcagttttggctcatctccggaaccagcgctcacttggctgctgtggtgcaagggcttctaaaagtgatggcagggattgaaatttcctttaccttgacagccaagtcagctggagaggacaatgatgatatatatgccgacctctaccttgtgaagtggacttccctcatgatccctccaattgtgattggaatggtgaacataatagccataatcgtcgcattttcaagggaggtttatgctctgaatcctcagtgggcgaggtttatcggcggtgccttcttcagcttttgggttttggctcacttgtatccttttgccaagggtttgatgggaagaagaaggaagacgcctaccattgtgtttgtttggtcaggtctcattgccattacactttccttgctctgggtcgccattaacccgccagcccctggtgttgtcgctggtgctgcaggaggcgggttccaatttccgtga
56.seq id no.2
57.matsqnrepskkaikspggsgssqgktnssgqtvkfarrtssgryvslsredldmsgeisgdymnytvhipptpdnqpmdtsvavkaeeqyvsnslftggfnsvtrahlmdkvidsevthpqmagakgsacmmpacdgkvmkdergvditpcdcrfkicrdcyldaqkdtglcpgckeqyrvgdeydepsdynsgtlqlpgpdgkrdnmsvmkrnqtgefdhnrwlfetkgtygvgnafnpqddgygdgggdgfpggsldaddkpwkplsrilpipaaiispyrlivlsfflhwrivnpnndarwlwlmsiiceiwfafswildqtpkffpinrqtdlevlhdkfdmpspsnptgrsdlpgidfyvstadpdkepplttantilsilavdypvekiacyisddggalltfeamaeaasfadlwvpfcrkhdieprnpdsyfalkvdptknkssldfvkdrrkikreydefkvringlpdsirrrsdafhareemkqlknmrengtdpleqvkvpkatwmadgthwpgtwavpsydhakgdhsgilqvmlkppspdsllgsadddklidftdvdirlpmfvymsrekrpgydhnkkagamn
alvrasailsngpfilnldcdhyinnckairegmcfmmdrggenicyiqfpqrfegidpsdryanhntvffdgnmraldglqgpmyvgtgtmfrrfalygfdppnpdklpvkkdtetpgepltqsntepltacdfdadldtnllpkrfgnstmlaesipvaeyqgrpladhpavkfgrppgilraprdpldatnvaeavssiscwyedktewgdrvgwiygsvtedvvtgyrmhnrgwrsvycvtkrdafrgsapinltdrlhqvlrwatgsveiffsrnnallasmrlkllqrlayvnvgvypftsiflivycflpalslftgqfivanlnitfliylltiticlialallevrwsgvaledwwrneqfwlisgtsahlaavvqgllkvmagieisftltaksagednddiyadlylvkwtslmippivigmvniiaiivafsrevyalnpqwarfiggaffsfwvlahlypfakglmgrrrktptivfvwsgliaitlsllwvainppapgvvagaagggfqfp*
58.seq id no.3
59.atggcaacttcccagaatagaga
60.seq id no.4
61.tcacggaaattggaacccg
62.seq id no.5
63.aaaaattccaatttatctagaatggcaacttcccagaatagaga
64.seq id no.6
65.gcccttgctcaccatggatcctcacggaaattggaacccg
66.seq id no.7
67.gggcggttccttcctatga
68.seq id no.8
69.atgaagcacatcccttcacg
70.seq id no.9
71.ccccgttcccacgtacacgg
72.seq id no.10
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