一种复合菌剂及其对芘-重金属复合污染环境的修复的制作方法

一种复合菌剂及其对芘
‑
重金属复合污染环境的修复
技术领域
1.本发明属于环境中多环芳烃
‑
重金属复合污染环境生物修复技术领域，涉及一种由假单胞菌属 (pseudomonas sp.)yh
‑
1和红球菌属(rhodococcus sp.)yh
‑
3构成的复合菌剂，具体包括复合菌剂的制 备方法及其在多环芳烃芘
‑
重金属复合污染环境生物修复领域的应用。


背景技术：

2.随着工业化发展进程的不断加快，环境污染问题越发复杂和严重。多环芳烃和重金属是环境中两种 典型的持久性污染物，常常同时存在于环境中，相互作用形成复合污染，对生态环境造成严重影响，同时 也对人类健康构成重大危害。
3.火山爆发、森林火灾等自然过程和废水灌溉、石油或煤炭生产加工等人为活动造成的污染环境中， 经常能同时检测到多环芳烃和一些重金属如铅、铜、铬等。复合污染环境中多环芳烃和重金属之间的相互 作用增加了修复的难度，因此，仅针对单一污染物进行修复往往不能达到污染环境修复的要求。
4.多环芳烃和重金属的修复方法主要有物理法、化学法和生物法。物理和化学修复法存在其缺点，如 修复成本较高、易产生二次污染等。近些年，生物修复技术因具有环境友好、操作性强、成本低等优点而 成为环境领域研究的热点。微生物是环境中丰富可持续的资源，在环境污染修复方面具有巨大的潜力，许 多微生物能够降解多环芳烃或具有重金属抗性，然而，目前对于能够修复多环芳烃
‑
重金属复合污染环境的 微生物报道较少，并且一种菌株通常只能降解一种污染物，且环境适应性差，降解效果不理想。所以，对 于多环芳烃
‑
重金属复合污染环境的修复，单一菌株往往修复效果不理想或不能实现。
5.因此，研究一种成本低、环境友好、效率高的复合微生物菌剂对于多环芳烃
‑
重金属复合污染环境 的修复具有重要意义。


技术实现要素：

6.针对上述研究背景，本发明提供了一种复合微生物菌剂，由假单胞菌属(pseudomonas sp.)yh
‑
1 和红球菌属(rhodococcus sp.)yh
‑
3构成，所述复合菌剂具有降解芘和耐重金属铬的特性，能够很好的应 用于重金属
‑
多环芳烃复合污染环境的修复中。
7.本发明采用如下技术方案：
8.本发明提供的复合菌剂由假单胞菌yh
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1(pseudomonas sp.yh
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1)和红球菌yh
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3(rhodococcus sp. yh
‑
3)复合而成，2株菌均保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国，武汉，武汉大学)，保藏编号 分别为：cctcc no:m 2021160；cctcc no:m 2021161，保藏日期为2021年1月27日。
9.本发明的两株菌yh
‑
1(pseudomonas sp.)和yh
‑
3(rhodococcus sp.)均从胜利油田长期受石油污 染的土壤中筛选而得，经研究发现，复配菌可有效提高多环芳烃芘的降解率，同时对重金属铬具有良好的 抗性和吸附转化效果。
10.复合菌剂的制备方法步骤：
11.将接种量为1％的yh
‑
1、yh
‑
3分别独立的接种到液体lb培养基中，30℃、160rpm条件下振荡培 养8～10h后，再将yh
‑
1和yh
‑
3按照1:1(v:v)进行混合后于30℃、160rpm条件下再培养5～8h得到 复配菌混合发酵液，将混合发酵液离心后去掉上清液，再经过磷酸盐缓冲液清洗3次后收集菌体，最后将 收集的菌体于
‑
20℃冰箱过夜预冻后经真空冷冻干燥即得复合菌剂。
12.活化及发酵过程所用液体lb培养基组成成分包括：
13.酵母粉5.0g，蛋白胨10.0g，nacl 10.0g，蒸馏水1000ml；
14.所述活化培养基使用前调ph为7.0～7.5，121℃下灭菌30min后使用。
15.本发明的有益效果主要包括以下几个方面：
16.1.所述假单胞菌株(pseudomonas sp.)yh
‑
1和红球菌(rhodococcus sp.)yh
‑
3，协同性能较好， 形成高效的代谢降解体系，较单一菌株相比，可以明显提高芘的降解效果；
17.2.复配菌在降解芘的同时对重金属铬具有良好的抗性和吸附转化效果；
18.3.本发明利用复配菌处理多环芳烃
‑
重金属复合污染环境的方法操作简单易行，成本低，环境友好， 具有广阔的应用前景。
附图说明
19.图1中的(a)为筛选得到的假单胞菌(pseudomonas sp.)yh
‑
1在固体lb培养基上的生长状态；
20.图1中的(b)为筛选得到的红球菌(rhodococcus sp.)yh
‑
3在固体lb培养基上的生长状态；
21.图2为菌株yh
‑
1和yh
‑
3及其复配后对芘的降解效果图；
22.图3中的(a)和(b)为加入重金属铬时复配菌的能谱图；
23.图3中的(c)和(d)为加入重金属铬时复配菌细胞表面各元素的mapping图；
24.图4中的(a)和(b)为加入重金属铬时复配菌的tem图；
25.图4中的(c)为加入重金属铬时复配菌的tem能谱图；
26.图5为复配菌吸附重金属铬前后的ftir图；
27.图6中的(a)是复配菌吸附重金属cr
6
后的xps图，(b)是复配菌吸附重金属cr
6
后的xrd图。
具体实施方式
28.为了使本技术领域的人员更好的理解本发明中的技术方案，下面将结合本技术中具体的实施例，对 本技术的具体技术方案进行详细的说明。应当指出，所描述的实施例并不是本技术的全部实施例。下述实 施例中所用实验材料若无特殊说明，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
29.实施例1.菌株筛选
30.材料和方法
31.土壤样品：胜利油田长期受石油污染场地的土壤。
32.筛选培养基
33.无机盐培养基：(nh4)2so41.0 g，k2hpo41.0 g，kh2po41.0 g，无水cacl20.01 g，mgso4·
7h2o 0.2 g，nacl 8.0g，fecl3痕量，蒸馏水1000ml，调ph为7.2～7.5，121℃灭菌30min后使用。
34.芘降解菌筛选培养基：在无机盐培养基的基础上加入一定量的芘
‑
丙酮溶液。
35.重金属筛选培养基：lb液体培养基中加入20g/l的琼脂粉制成lb固体培养基，然后加入不同浓 度的重金属铬溶液。
36.菌株筛选
37.称取一定量的原油污染土壤加入到已灭菌的lb液体培养基中富集培养48h。取一定量的芘
‑
丙酮溶 液加入到无机盐培养基中振荡过夜，待丙酮挥发完全后接入5ml富集培养液，振荡培养7d，然后再取5ml 培养液加入到新鲜的培养基中，采用以上方法转接培养5次，芘的浓度依次增加(20、30、50、80、100mg/l)。 取最后一次驯化培养液稀释后涂布于含有不同浓度芘的lb固体培养基上，培养2
‑
3d后，挑取芘耐受性较 好的菌落反复划线分离直到得到单一的芘降解菌，将得到的芘降解菌在含有不同浓度重金属铬的lb固体 平板上进行划线，37℃恒温培养箱中培养2
‑
3d，得到重金属铬耐受性较好的芘降解菌。
38.菌株鉴定
39.采用16s rrna分子生物学鉴定技术对所筛菌株进行测定，根据测序结果确定其菌属并构建系统发 育树。
40.筛选结果
41.如表1，通过筛选共得到2株耐重金属铬的芘降解菌yh
‑
1和yh
‑
3。
42.菌株yh
‑
1和yh
‑
3对重金属铬的耐受性较好。
43.实施例2.菌株复配
44.材料与方法
45.菌株：经过筛选得到2株对芘降解率较高且具有重金属铬抗性的菌株yh
‑
1和yh
‑
3。
46.培养基
47.lb液体培养基、芘
‑
无机盐培养基
48.测定方法：配制芘
‑
无机盐培养基，加入重金属铬(培养基中芘的浓度为50mg/l；重金属铬的含量 为30mg/l)，灭菌备用；
49.设置4个处理组，分别接种对应的菌株发酵液10％(v:v)，试验处理如下：
50.处理1：只接种菌株yh
‑
1；
51.处理2：只接种菌株yh
‑
3；
52.处理3：接种菌株yh
‑
1和yh
‑
3(1:1)；
53.处理4：不接种菌株的芘
‑
无机盐培养基，为空白对照组。
54.所有处理在30℃，160r/min条件下振荡培养5d。
55.采用超声萃取
‑
紫外分光光度法和气相色谱
‑
质谱法测定培养后芘的剩余量，计算
芘的降解率。
56.实验结果
57.处理1芘的浓度为35.19mg/l，芘的降解率为29.63％；
58.处理2芘的浓度为39.34mg/l，芘的降解率为21.32％；
59.处理3芘的浓度为28.67mg/l，芘的降解率为42.67％；
60.结论：
61.由上述结果可以看出，经过5d的降解实验，yh
‑
1对芘的降解率为29.63％，yh
‑
3对芘的降解率为 21.32％，yh
‑
1和yh
‑
3以1:1比例复配后对芘的降解率为42.67％，复配菌对芘的降解率均高于单菌，由 此可看出yh
‑
1和yh
‑
3在对芘的降解过程中具有协同作用，这2株菌复配后对芘的降解率有明显的提高。
62.实施例3.复配菌对重金属铬的吸附转化
63.试验设置：
64.配制芘
‑
无机盐培养基，加入重金属铬(培养基中重金属铬的含量为30mg/l)，灭菌备用；
65.在配置好的含有重金属铬的芘
‑
无机盐培养基中接入10％(v:v)的复配菌的混合发酵液。
66.所有的处理在30℃，160r/min条件下培养5d。
67.将培养后的培养基离心后上清液透过0.45μm的滤膜，分离菌体和培养基，分别测定总铬和cr
6
的 含量。
68.重金属总铬的含量采用电感耦合等离子体光谱法(icp)进行测定，cr
6
的含量采用二苯碳酰二肼 分光光度法进行测定。
69.实验结果：
70.芘的浓度为50mg/l，重金属cr
6
的浓度为30mg/l；
71.结果：
72.表1 cr
6
的吸附转化效果
73.结论：
74.由上表可知，在芘存在的条件下，复配菌对重金属铬具有吸附转化的作用。cr
6
的初始浓度为30 mg/l，30℃，160r/min，经过5d的振荡培养后，上清液中总铬的含量为9.41mg/l，cr
6
的含量为7.00mg/l， 说明复配菌可以吸附cr
6
并可以将部分高毒性的cr
6
转化为低毒性的cr
3
，复配菌对cr
6
的吸附转化率为 68.63％，由此可知，复配菌对cr
6
具有良好的修复效果。
75.实施例4.复配菌对重金属铬的吸附转化机理
76.材料和方法
77.菌种：复配菌
78.培养基
79.芘
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无机盐培养基
80.方法：sem
‑
eds、tem、ftir、xrd和xps测定分析
81.配制芘
‑
无机盐培养基，加入重金属铬(培养基中重金属铬的含量为30mg/l)，灭菌备用；
82.配制芘
‑
无机盐培养基，不加重金属，灭菌备用；
83.在处理好的培养基中分别接入10％(v:v)的复配菌混合发酵液。
84.所有处理在30℃，160r/min条件下培养5d。
85.将培养5d的含有重金属cr
6
的芘
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无机盐培养基离心后收集菌体，用磷酸盐缓冲液(pbs)洗涤3 次弃去上清液收集菌体，一部分用2.5％的戊二醛固定菌体并放于4℃冰箱过夜后送至指南针公司进行 sem
‑
eds、tem及能普测定，另一部分菌体真空冷冻干燥后制成菌粉送至指南针公司进行ftir、xrd 和xps测定分析。
86.结论：
87.sem
‑
eds测定结果显示，复配菌菌体细胞吸附了重金属cr
6
；tem及能谱测定结果显示菌株细 胞内存在少量的重金属铬，说明金属离子可以跨膜进入菌株细胞内；xrd和xps测定结果分析复配菌可 以将cr
6
还原为cr
3
，其还原产物为cr(oh)3。