一种大鼠软骨永生化细胞系的构建方法与流程

技术特征：
1.一种大鼠软骨永生化细胞系的构建方法，其特征在于，包括以下具体步骤：（1）用含有0.2wt%的ii型胶原酶消化大鼠关节软骨，提取并培养大鼠软骨细胞；（2）将p3代大鼠软骨细胞培养至对数期生长期，接种到6孔板，37℃培养过夜，接种细胞数量应保证第二天进行病毒感染的时候细胞汇合率在50%以上；（3）病毒转染：取moi值=10的病毒浓缩液和8 μg/ml 聚凝胺，加入已含有1 ml完全培养液的ep管中，混匀，得病毒稀释液；吸去步骤（2）培养板中的原培养基，沿壁加入病毒稀释液，勿吹起细胞；在水平方向轻轻拍打培养板，使每个孔中的溶液都混合均匀，然后把培养板放回37℃培养箱孵育；（4）感染6 h后，补充1 ml完全培养基，37℃过夜培养；（5）感染24 h后，吸去含病毒培养基，加入2 ml新鲜培养基，继续培养；（6）感染48
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72 h后， q
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pcr检测sv40lt基因和htert基因的表达情况。2.根据权利要求1所述的一种大鼠软骨永生化细胞系的构建方法，其特征在于：步骤（3）中病毒浓缩液的制备方法为：将sv40lt和htert基因cds区全片段接入pcdh
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cmv
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mcs
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ef1
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puro载体中，构建慢病毒穿梭载体pcdh
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cmv
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sv40lt
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ef1
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puro和pcdh
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cmv
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htert
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ef1
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puro；后利用lipo3000转染试剂，将慢病毒穿梭载体与pmdlg/prre、prsv
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rev、pmd2.g共转至293ft细胞中，在转染48 h和72h收集细胞上清液并用0.45 μm 滤器过滤，滤液经离心去除细胞碎片，上清液继续经超滤管浓缩和纯化至sv40lt过表达慢病毒滴度为：2.0
×
108tu/ml，htert过表达慢病毒滴度为：2.5
×
108tu/ml，获得病毒浓缩液。3.根据权利要求1所述的一种大鼠软骨永生化细胞系的构建方法，其特征在于：步骤（6）中 q
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pcr检测sv40lt基因和htert基因的引物序列如下：sv40lt
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f:5
’‑
ggctacactgtttgttgccc
‑3’
；sv40lt
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r:5
’‑
aagttcagcctgtccaaggg
‑3’
；htert
‑
f:5
’‑
aggtgtccctgagtatggct
‑3’
；htert
‑
r:5
’‑
gagtagtcgctctgcacctc
‑3’
；gapdh
‑
f:5
’‑
gtgccagcctcgtctcatag
‑3’
；gapdh
‑
r:5
’‑
ctttgtcacaagagaaggcag
‑3’
。

技术总结
本发明提供一种大鼠软骨永生化细胞系的构建方法，属于生物技术领域。本发明的方法构建hTERT和SV40LT慢病毒穿梭载体；通过体外感染大鼠原代软骨细胞，获得体外永生化的大鼠软骨细胞，为骨性关节炎的体外药效研究提供基础。础。


技术研发人员：陈加守 林丽花 邱德辉 谢翔峰
受保护的技术使用者：福州载基生物科技有限公司
技术研发日：2021.07.12
技术公布日：2021/10/23