一种大鼠软骨永生化细胞系的构建方法与流程

h和72 h收集细胞上清液并用0.45 μm 滤器过滤，滤液经离心去除细胞碎片，上清液继续经超滤管浓缩和纯化至sv40lt过表达慢病毒滴度为：2.0
×
108tu/ml，htert过表达慢病毒滴度为：2.5
×
108tu/ml，获得病毒浓缩液。
8.上述步骤（6）中 q
‑
pcr检测sv40lt基因和htert基因的引物序列如下：sv40lt
‑
f:5
’‑
ggctacactgtttgttgccc
‑3’
；sv40lt
‑
r:5
’‑
aagttcagcctgtccaaggg
‑3’
；htert
‑
f:5
’‑
aggtgtccctgagtatggct
‑3’
；htert
‑
r:5
’‑
gagtagtcgctctgcacctc
‑3’
；gapdh
‑
f:5
’‑
gtgccagcctcgtctcatag
‑3’
；gapdh
‑
r:5
’‑
ctttgtcacaagagaaggcag
‑3’
。
9.本发明的优点在于：本发明构建htert和sv40lt重组慢病毒穿梭载体，通过体外感染大鼠原代软骨细胞，获得体外永生化的大鼠软骨细胞，为骨性关节炎的体外药效研究提供基础。
10.附图说明：图1慢病穿梭载体pcdh
‑
cmv
‑
sv40lt
‑
ef1
‑
puro的质粒图谱。
11.图2慢病穿梭载体pcdh
‑
cmv
‑
htert
‑
ef1
‑
puro的质粒图谱。
12.图3 sv40lt/htert双标大鼠软骨永生化细胞镜下观察（p30代）。
13.图4 ii型胶原法和阿利新蓝法染色法鉴定大鼠软骨细胞及永生化细胞。
14.图5 q
‑
pcr检测大鼠软骨细胞中sv40lt和htert的过表达水平。
15.图6 β
‑
半乳糖苷酶染色法检测大鼠软骨衰老细胞。
具体实施方式
16.为了更好地理解本发明，下面结合附图和实施例对本发明做进一步阐述，但并不是对本发明的限制。下述实施例中所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
17.实施例1 软骨细胞的分离培养4周龄sd大鼠4只，无菌条件下切取关节软骨，剪成1 mm3的大小，pbs洗涤3次，吸干pbs残液，加入含有0.2wt%的ii型胶原酶消化液的培养皿，放入37℃的培养箱中，每隔2 h吸取上清液，1000 r/min的离心5min，弃消化液，收集细胞沉淀，更换消化液，重复4次。用5 ml dmem培养液（10 vol%小牛血清、链霉素100 mg/l和青霉素100 u/ml）重悬细胞，全部接种于50 ml培养瓶中（原代），待细胞铺满培养瓶底部80%后，加入0.5
‑
1 ml 0.25%胰酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液中，瓶口旋紧，放在倒置显微镜下观察细胞。随着时间的推移，原贴壁的细胞逐渐趋于圆形，在还未飘起时将胰酶弃去，加入10 ml dmem培养液终止消化。用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，分到另外两到三瓶中，旋紧瓶口，置于37℃下继续培养（f1代）。第二天观察贴壁生长情况。3天细胞可铺满培养瓶底部80%，细胞传至p3代。
18.实施例2 软骨细胞鉴定（1）ii型胶原鉴定取对数期生长的f3代软骨细胞，按1
×
105个/ml接种于含有盖玻片的六孔板中，加入10vol�s （胎牛血清）dmem培养基进行培养，待细胞爬满盖玻片后，按下述方法进行处理：
（1）pbs洗细胞爬片1遍，2 min；（2）4%多聚甲醛处理30 min（多聚甲醛室温，否则细胞会皱缩）；（3）pbs洗2遍，每遍2 min；（4）0.15% txiton x
‑
100 室温处理10 min；（5）pbs洗2遍，每遍2 min；（6）加入适量的内源性过氧化物酶阻断剂，室温孵育10分钟；（7）pbs洗2遍，每遍2 min；（8）用1%牛血清白蛋白（bsa）配制一抗：ii型胶原蛋白（collagen ii）（1:200），37℃孵育2 h 或4℃过夜孵育；（9）pbs洗2遍，每遍2 min；（10）滴加反应增强液，室温处理20 min；（11）pbs洗2遍，每遍2 min；（12）滴加增强酶标山羊抗兔igg聚合物，室温处理20 min；（13）pbs洗2遍，每遍2 min；（14）dab显色液室温处理5
‑
8 min。
19.（2）阿利新蓝法染色取对数期生长的f3代软骨细胞，按1
×
105个/ml接种于含有盖玻片的六孔板中，加入10�s dmem培养基进行培养，待细胞爬满盖玻片后，按下述方法进行处理：1、 4%多聚甲醛固定30 min，pbs洗涤。
20.2、 加入阿利新蓝（alcian）酸化液浸泡3 min。
21.3、 加入alcian染色液染色30 min。
22.4、 pbs洗涤5 min。实施例3 大鼠软骨永生化细胞构建（1）实验材料实验试剂：仪器与设备：
载体系统：第三代慢病毒包装系统：包括pmdlg/prre（#zve1894，载基生物），prsv
‑
rev（#zve1049，载基生物），pmd2.g（#zve1890，载基生物）三种辅助质粒。
23.包装细胞株：293ft细胞（#zcl1032，载基生物），为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为dmem（含10 % fbs 1%双抗（青链霉素混合液（100
×
），其中青霉素10000 u/ml，链霉素10 mg/ml））。贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。
24.（2）慢病毒包装实验步骤：重组质粒载体构建：由生物公司直接化学合成sv40lt和htert基因cds区片段；sv40lt基因片段（2133 bp）和htert基因片段（3405 bp）；后利用如下引物进行pcr扩增获得目的基因，然后重组到目的载体pcdh
‑
cmv
‑
mcs
‑
ef1
‑
puro（pcdh
‑
cmv
‑
mcs
‑
ef1
‑
puro i酶切载体）中构建重组质粒，重组质粒经测序和双酶切鉴定（ecori
‑
bamhi，xbai
‑
ecori），最终获得目的基因慢病毒穿梭载体pcdh
‑
cmv
‑
sv40lt
‑
ef1
‑
puro和pcdh
‑
cmv
‑
htert
‑
ef1
‑
puro，慢病毒穿梭载体图谱见图1和图2。
25.质粒载体抽提：构建好的慢病毒穿梭载体pcdh
‑
cmv
‑
sv40lt
‑
ef1
‑
puro、pcdh
‑
cmv
‑
htert
‑
ef1
‑
puro及辅助质粒（pmdlg/prre，prsv
‑
rev，pmd2.g）利用无内毒素质粒大提试剂盒进行大量抽提，浓度要求大于1 μg/μl，a260/a280在1.8～2.0之间。
26.细胞株的培养要点细胞状态对于慢病毒包装至关重要，因此需要保证良好的细胞状态和较少的传代次数。
27.293ft细胞会随着传代次数的增加，出现生长状态下降现象。因此，293ft细胞需经常更换新的细胞，更换频率约4~8周。
28.细胞消化要充分，成团生长的细胞会影响转染效率。
29.慢病毒包装流程第一天：细胞铺板293ft 细胞种于10cm
‑
dish中，中板密度为第二天转染前细胞密度达到80%，置于37
°
c，5 % co2的培养箱中。
30.第二天：质粒转染1、转染试剂：lipo30002、质粒共转体系：
3、转染用培养基：转染前1 h，更换不含双抗，含10�s的dmem培养基。
31.4、转染后6 h，更换含10 % fbs的新鲜培养基。
32.第四天：病毒上清收集1、转染后48 h，收集细胞上清液，并根据细胞生长状况适当补充新鲜细胞培养基，72 h再次收集一次病毒上清。
33.2、将收集的病毒上清液用0.45 μm 滤器过滤, 4℃储存备用；第五天：病毒浓缩和纯化1、超速离心法沉淀病毒：将收集的病毒上清，4
°
c ，3000 rpm ，离心20 min，去除细胞碎片；然后收集病毒原液上清置于beckman超速离心管中，4
°
c，25000 rpm沉淀2 h，去上清，加入4 ml pbs溶解；2、超滤管浓缩和纯化：将上述溶解液加入预先消毒处理的超滤浓缩管中进一步浓缩和纯化，4000
×ꢀ
g，离心10
‑
15 min，获得小于1 ml的病毒浓缩液。用pbs补足至4 ml，再次离心1次，最后浓缩液加入适量病毒保存液稀释至1.2 ml，获得慢病毒浓缩液；3、病毒保存：按照200 μl/管分装病毒，贴上标签，
‑
80
°
c冰箱保存，备用。
34.、慢病毒滴度检测4.1 检测流程1、细胞准备：将生长状态良好的293ft细胞消化后，按3.0
×
105/孔, 加入6孔板中，设2复孔，置于37
°
c，5 % co
2 培养箱中培养；2、慢病毒感染：贴壁培养16 h，按4 μl 病毒液/孔加入慢病毒浓缩液，感染72h；3、采用全式金easypure
®ꢀ
genomic dna kit试剂盒进行细胞基因组提取；4、标准品制备和稀释：以含病毒特征序列和宿主细胞单拷贝基因序列的质粒标准品，10倍梯度稀释质粒标准品（104~109）；5、q
‑
pcr上机检测：取上述待测样品（基因组）稀释至5
‑
50 ng/μl，分别取2 μl待测样品及梯度稀释的标准品进行上机检测，引物同表1。
35.q
‑
pcr反应
6、计算慢病毒滴度6、计算慢病毒滴度4.2 滴度检测结果实施例4 稳转株构建实验步骤1. 最佳moi值 moi值（感染复数）是指每个细胞感染的病毒颗粒数。一般选定的moi值需要使宿主细胞达到80%以上感染，并且细胞没有出现明显毒性反应。由于慢病毒对不同细胞的亲嗜性不同，导致对不同细胞的感染效率不同。即使是同一种细胞，由于不同实验室的细胞来源、代数和细胞状态的影响，最佳moi值也不一致。因此，实验前应确定最佳moi值范围，可以通过查询文献或预实验确定，大多数细胞的最佳moi值在10~40范围。
36.本实验moi值：102. polybrene（聚凝胺）浓度摸索常用的感染增强剂，是一种多聚阳离子聚合物，能与细胞表面的阴离子结合，显著提高慢病毒感染效率（2
‑
10倍），使用过程中可以用pbs或培养基进行稀释。
37.polybrene对细胞具有一定毒性。不同细胞的敏感度不同，使用前应对polybrene浓度进行摸索，摸索范围1~10 μg/ml；常用的使用浓度是5~10 μg/ml。
38.本实验polybrene浓度：8 μg/ml3. 病毒感染贴壁细胞1）病毒准备：提前从
‑
80℃冰箱中取出病毒原液，放冰上融化，使用前离心；2）将p3代大鼠软骨细胞培养至对数期生长，接种到6孔板，37℃培养过夜，接种细胞数量因细胞的状态不同而略有区别，应保证第二天进行病毒感染的时候细胞汇合率在50%；3）稀释病毒：取moi值=10的病毒浓缩液和8 μg/ml 聚凝胺，加入已含有1 ml完全培养液的ep管中，混匀；
4）感染前，吸去培养板中的原培养基，沿壁加入上述稀释后的病毒稀释液，勿吹起细胞；5）在水平方向轻轻拍打培养板，使每个孔中的溶液都混合均匀，然后把培养板放回37℃培养箱孵育；6）感染6 h后，补充1 ml完全培养基，37℃过夜培养；7）感染24 h后，吸去含病毒培养基，加入2 ml新鲜培养基，继续培养；8）感染48
‑
72 h后，在荧光显微镜下观察荧光表达情况。对于生长缓慢的细胞，可以适当延长观察时间，2天换一次液；9）puromycin（嘌呤霉素）抗性筛选：对于携带puromycin抗性的病毒，一般在感染48
‑
72 h后，需要加入puromycin进行筛选。筛选浓度在1~10 μg/ml，不同的细胞所需的puromycin浓度不同，实验前需要对puromycin筛选浓度进行摸索，一般为在3天左右使正常细胞全部死亡的最低浓度；本实验puromycin筛选浓度：10 μg/ml4. 大鼠软骨永生化细胞镜下观察和鉴定方法同实施例2。结果如图3、图4所示，结果表明， sv40lt/htert双标大鼠软骨永生化细胞（p30代）在100倍和200倍镜下观察，细胞生长状态良好，单层生长，彼此不相接触，三角形、长梭形或多角形，胞体丰满，胞浆均匀，白色“类软骨样”物质。进而对永生化细胞进行ii型胶原法和阿利新蓝法染色法鉴定，结果可见永生化软骨细胞胞浆被染成棕黄色，胞核不着色，胞外基质中也有棕黄色颗粒出现，与p3代的正常软骨细胞染色结果一致；阿利新蓝法染色法鉴定结果显示，永生化软骨细胞（p30代）胞浆和胞膜呈深蓝色，说明培养的软骨细胞分泌和合成蛋白聚糖，细胞核呈淡蓝色，细胞形态完好，与p3代的正常软骨细胞染色结果一致。
39.检测结果待构建的大鼠软骨稳转细胞和空载转染的大鼠软骨细胞生长至80%时，分别收集细胞，提取细胞总rna并合成cdna,使用sv40lt和htert特定引物进行定量pcr扩增，gapdh作为内参基因（表1）。根据 2
‑
δδct 法对数据进行相对定量分析，计算公式如下（x表示任意一个样本）：。结果如图5所示，结果表明相比于空载转染的大鼠软骨细胞，大鼠软骨稳转细胞中sv40lt和htert表达水平均上调。
40.表1 real
‑
time pcr引物6、大鼠软骨衰老细胞检测
β
‑
半乳糖苷酶(sa
‑
β
‑
gal)染色：（1）对于 6 孔板中培养的细胞，吸除细胞培养液，用 pbs 或 hbss 洗涤 1 次，加入 1 ml β
‑
半乳糖苷酶染色固定液， 室温固定 15min。对于其它类型的培养板，固定液及后续溶液的用量参照此比例进行操作。
41.（2） 吸除细胞固定液，用 pbs 或 hbss 洗涤细胞 3 次，每次 3 min。
42.（3）吸除 pbs 或 hbss，每孔加入 1 ml 染色工作液。使用聚丙烯(polypropylene)容器，不能使用聚苯乙烯(polystyrene) 容器配制染色工作液。 染色工作液配方如下：（4） 37℃孵育过夜，可以用 parafilm 或保鲜膜封住 6 孔板防止蒸发。 注意：37℃孵育不能在二氧化碳培养箱中进行。
43.（5） 普通光学显微镜下观察。如不能及时观察计数，可以去除染色工作液，加入 2 ml pbs，4℃可以保存数天；或者加上封片液封片后，4℃可以保存较长时间。结果如图6所示，结果显示正常软骨细胞（p3代）和永生化软骨细胞（p30代）均不表达sa
‑
β
‑
gal，表明永生化细胞p30未出现衰老现象。
44.需要说明的是，尽管在本文中已经对上述各实施例进行了描述，但并非因此限制本发明的专利保护范围。因此，基于本发明的创新理念，对本文所述实施例进行的变更和修改，或利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，直接或间接地将以上技术方案运用在其他相关的技术领域，均包括在本发明的专利保护范围之内。