PDX建模佐剂及其应用的制作方法

pdx建模佐剂及其应用
技术领域
1.本发明涉及抗肿瘤药物研发领域，特别是涉及一种pdx建模佐剂及其应用。


背景技术：

2.癌症一直以来都是危害人类健康的重大困扰，许多癌症早期患者无明显症状，直到晚期或者转移时才能被发现，治疗结果往往令人失望。尽管肿瘤的基础研究、临床研究及转化医学取得了不少的成绩，但新治疗方法并未给患者带来理想的治疗方案和预后效果。为了更深入地研究肿瘤发展以及寻找更好的药物治疗方法，研究肿瘤的模型特别是动物模型将具有非常重要的价值。
3.传统的异种移植肿瘤模型为人源肿瘤细胞系异种移植(cell derived xenograft,cdx)，即将人类肿瘤细胞在体外筛选，经过体外传代培养，建立稳定细胞株，然后接种至免疫缺陷小鼠皮下、肾包膜下或原位移植而建立的模型，这种模型的建立以及在肿瘤研究中的应用已有漫长历史。早在20世纪90年代早期，美国国立癌症研究所(national cancer institute,nci)就依据来源于9种不同类型肿瘤(脑、结肠癌、白血病、肺、黑素瘤、卵巢癌、肾癌、乳腺癌和前列腺癌)的60位癌症患者肿瘤细胞系，引入了一种“disease
‑
oriented”的药物筛选策略，简单来说，就是先用人肿瘤细胞系进行高通量体外药物筛选，再用cdx模型进行体内验证。但是，研究者逐渐发现人源肿瘤细胞系经长期体外培养后，其肿瘤细胞生物学行为及基因谱表达水平、肿瘤异质性都与原始肿瘤组织存在较大的差异，从而在预测临床药效方面不甚理想。有研究表明，经此模型鉴定筛选的药物仅约1/3在二期临床试验中验证有效。其原因在于，连续传代的肿瘤细胞株适应了外界培养皿的环境，缺乏肿瘤微环境，这些细胞株种植到免疫缺陷小鼠后形成的肿瘤与小鼠具有同质性，丢失了原代肿瘤的特性，因此不能客观地反应原代肿瘤的情况。
4.而人源肿瘤异体移植模型(pdx模型)是目前在抗肿瘤药物研发领域广泛应用的一种替身模型。该模型是将癌症患者自身的肿瘤组织移植到免疫缺陷动物上，使其在继续生长、传代，从而生产大量携带该患者肿瘤的荷瘤动物。由于pdx模型保持了患者肿瘤的病理、分子特征及异质性，其对抗肿瘤药物的敏感性与供体患者肿瘤相同。相较于传统的细胞系移植模型(cell
‑
derived xenograft,cdx)，pdx模型未经过体外培养，较好地保持了原发肿瘤的遗传特性和异质性，实验结果临床预见性更好，可以说是现阶段最优秀的肿瘤动物模型。pdx模型可以进行传代扩增，研究表明传代的肿瘤组织能够和初始肿瘤组织保持高度的一致性，为药物筛查和病人患病机制研究提供了很好的条件。因此，检测准备于临床中应用的备选治疗方案在pdx模型上的药效能够预测这些治疗方案在肿瘤患者临床治疗中的药效，从而为医生选择合适的治疗方案提供可靠参考。目前，pdx模型对于患者临床用药的一致性已经得到广泛认可。
5.然而，目前pdx模型建模方法上普遍使用的依然是瘤块接种小鼠皮下的方法，该方法成功率有限，往往造成大量建模不成功的情况，常见生长缓慢、边生长边坏死、生长不稳定、无法快速生长扩大等问题，不仅产生较大的成本支出，同时也无法满足患者个体化医疗
模型建模的需求。因此，pdx模型建模成功率低、周期长，是造成目前精准医疗实验不成功的主要原因。


技术实现要素：

6.基于此，有必要提供一种可提高建模成功率和建模速度的pdx建模佐剂。
7.一种pdx建模佐剂，包括转化生长因子β、表皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子、胰岛素、氢化可的松、y
‑
27632、胎牛血清和溶剂。
8.在其中一个实施例中，所述pdx建模佐剂中，所述转化生长因子β的浓度为100ng/ml～1μg/ml，所述表皮细胞生长因子的浓度为10ng/ml～0.1μg/ml，所述碱性成纤维细胞生长因子的浓度为10ng/ml～0.1μg/ml，所述血管内皮生长因子的浓度为10ng/ml～0.1μg/ml，所述胰岛素的浓度为50μg/ml～0.5mg/ml，所述氢化可的松的浓度为50μg/ml～0.5mg/ml，所述y
‑
27632的浓度为10μm～50μm，所述胎牛血清的体积百分比为5％～15％。
9.在其中一个实施例中，所述pdx建模佐剂中，所述转化生长因子β的浓度为100ng/ml～200ng/ml，所述表皮细胞生长因子的浓度为10ng/ml～20ng/ml，所述碱性成纤维细胞生长因子的浓度为10ng/ml～20ng/ml，所述血管内皮生长因子的浓度为10ng/ml～20ng/ml，所述胰岛素的浓度为50μg/ml～100μg/ml，所述氢化可的松的浓度为50μg/ml～100μg/ml，所述y
‑
27632的浓度为10μm～20μm，所述胎牛血清的体积百分比为5％～10％。
10.在其中一个实施例中，所述pdx建模佐剂中，所述转化生长因子β的浓度为100ng/ml，所述表皮细胞生长因子的浓度为10ng/ml，所述碱性成纤维细胞生长因子的浓度为10ng/ml，所述血管内皮生长因子的浓度为10ng/ml，所述胰岛素的浓度为50μg/ml，所述氢化可的松的浓度为50μg/ml，所述y
‑
27632的浓度为10μm，所述胎牛血清的体积百分比为5％。
11.在其中一个实施例中，所述pdx建模佐剂中还包括浓度为1x～5x的青霉素
‑
链霉素双抗。
12.在其中一个实施例中，所述pdx建模佐剂中，所述青霉素
‑
链霉素双抗的浓度为1x～2x。
13.在其中一个实施例中，所述溶剂为磷酸缓冲液、1640培养基和dmem培养基中的一种或多种。
14.本发明还提供了如上所述的pdx建模佐剂在制备pdx动物模型中的应用。
15.在其中一个实施例中，制备所述pdx动物模型中所使用的动物为免疫缺陷小鼠。
16.本发明还提供了一种pdx动物模型的制备方法，包括以下步骤：将如上所述的pdx建模佐剂与肿瘤细胞混合，然后接种于免疫缺陷动物体内。
17.通过研究发现，造成pdx模型建模成功率较低的主要问题之一是人肿瘤细胞接种于免疫缺陷动物皮下后，在短时间内营养不足，无法适应免疫缺陷动物体内环境所致。因此，改善免疫缺陷动物接种位置的环境，是提高pdx模型接种成功率的一个主要途径。在肿瘤组织或细胞接种于免疫缺陷动物后，肿瘤细胞分泌的促血管生成因子会吸引宿主血管网的生成，从而获得宿主的血液供应，以获取充足的营养。然而，由于血管网建立需要一定的时间，肿瘤细胞生长又造成了对营养物质及血氧供应的较高需求，往往来不及等到血管网建立，肿瘤内部的细胞便由于供养不足而凋亡、钙化或坏死，造成原代pdx模型生长缓慢或
死亡。此外，由于外源性物质接种导致的局部炎性反应能够大量招募小鼠巨噬细胞，大量巨噬细胞浸润会干扰肿瘤细胞生长，从而引起pdx模型建模成功率下降，因此，局部抗炎药物的应用可能有助于提高肿瘤建模的成功率。
18.本发明的pdx建模佐剂为提高pdx模型接种成功率，加速肿瘤生长以适应实验需求，组合多种促血管生成因子和营养物质，能够解决pdx模型早期血管网建立困难的问题，并且结合局部抗炎药物氢化可的松、促干细胞生长的化合物rock抑制剂y
‑
27632，有助于保证肿瘤干细胞的存活，降低肿瘤细胞凋亡，从而避免肿瘤移植物陷入边生长边凋亡的情况，破解肿瘤的生长阻滞，进而改善了pdx模型建模成功率，加快了肿瘤异体移植模型生长速度。
附图说明
19.图1为实施例1中采用不同佐剂pdx模型小鼠的平均成瘤时间；
20.图2为实施例2中采用不同佐剂pdx模型小鼠的体重变化曲线；
21.图3为实施例2中采用不同佐剂pdx模型小鼠的肿瘤生长曲线；
22.图4为实施例3中采用不同佐剂pdx模型小鼠的体重变化曲线；
23.图5为实施例3中采用不同佐剂pdx模型小鼠的肿瘤生长曲线；
24.图6为实施例4中采用不同佐剂pdx模型小鼠的体重变化曲线；
25.图7为实施例4中采用不同佐剂pdx模型小鼠的肿瘤生长曲线；
26.图8为实施例5中采用不同佐剂psx模型小鼠的体重变化曲线；
27.图9为实施例5中采用不同佐剂pdx模型小鼠的肿瘤生长曲线；
28.图10为实施例6中采用不同佐剂psx模型小鼠的体重变化曲线；
29.图11为实施例6中采用不同佐剂pdx模型小鼠的肿瘤生长曲线。
具体实施方式
30.为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，并给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
31.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
32.本发明一实施例的pdx建模佐剂，其包括转化生长因子β(tgfb)、表皮细胞生长因子(egf)、碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)、血管内皮生长因子(vfgf)、胰岛素、氢化可的松、y
‑
27632、胎牛血清和溶剂。
33.通过研究发现，造成pdx模型建模成功率较低的主要问题之一是人肿瘤细胞接种于免疫缺陷动物皮下后，在短时间内营养不足，无法适应免疫缺陷动物体内环境所致。因此，改善免疫缺陷动物接种位置的环境，是提高pdx模型接种成功率的一个主要途径。在肿瘤组织或细胞接种于免疫缺陷动物后，肿瘤细胞分泌的促血管生成因子会吸引宿主血管网的生成，从而获得宿主的血液供应，以获取充足的营养。然而，由于血管网建立需要一定的
时间，肿瘤细胞生长又造成了对营养物质及血氧供应的较高需求，往往来不及等到血管网建立，肿瘤内部的细胞便由于供养不足而凋亡、钙化或坏死，造成原代pdx模型生长缓慢或死亡。此外，由于外源性物质接种导致的局部炎性反应能够大量招募小鼠巨噬细胞，大量巨噬细胞浸润会干扰肿瘤细胞生长，从而引起pdx模型建模成功率下降，因此，局部抗炎药物的应用可能有助于提高肿瘤建模的成功率。
34.本发明的pdx建模佐剂为提高pdx模型接种成功率，加速肿瘤生长以适应实验需求，组合多种促血管生成因子和营养物质，能够解决pdx模型早期血管网建立困难的问题，并且结合局部抗炎药物氢化可的松、促干细胞生长的化合物rock抑制剂y
‑
27632，有助于保证肿瘤干细胞的存活，降低肿瘤细胞凋亡，从而避免肿瘤移植物陷入边生长边凋亡的情况，破解肿瘤的生长阻滞，进而改善了pdx模型建模成功率，加快了肿瘤异体移植模型生长速度。
35.在一个具体示例中，pdx建模佐剂中，转化生长因子β的浓度为100ng/ml～1μg/ml，表皮细胞生长因子的浓度为10ng/ml～0.1μg/ml，碱性成纤维细胞生长因子的浓度为10ng/ml～0.1μg/ml，血管内皮生长因子的浓度为10ng/ml～0.1μg/ml，胰岛素的浓度为50μg/ml～0.5mg/ml，氢化可的松的浓度为50μg/ml～0.5mg/ml，y
‑
27632的浓度为10μm～50μm，胎牛血清的体积百分比为5％～15％。
36.在一个具体示例中，pdx建模佐剂中，转化生长因子β的浓度为100ng/ml～200ng/ml，表皮细胞生长因子的浓度为10ng/ml～20ng/ml，碱性成纤维细胞生长因子的浓度为10ng/ml～20ng/ml，血管内皮生长因子的浓度为10ng/ml～20ng/ml，胰岛素的浓度为50μg/ml～100μg/ml，氢化可的松的浓度为50μg/ml～100μg/ml，y
‑
27632的浓度为10μm～20μm，胎牛血清的体积百分比为5％～10％。
37.在一个具体示例中，pdx建模佐剂中，转化生长因子β的浓度为100ng/ml，表皮细胞生长因子的浓度为10ng/ml，碱性成纤维细胞生长因子的浓度为10ng/ml、血管内皮生长因子的浓度为10ng/ml，胰岛素的浓度为50μg/ml，氢化可的松的浓度为50μg/ml，y
‑
27632的浓度为10μm，胎牛血清的体积百分比为5％。
38.在一个具体示例中，pdx建模佐剂中还包括浓度为1x～5x青霉素
‑
链霉素双抗。优选地，pdx建模佐剂中，青霉素
‑
链霉素双抗的浓度为1x～2x。
39.在一个具体示例中，上述溶剂为磷酸缓冲液、1640培养基和dmem培养基中的一种或多种。
40.本发明还提供了上述pdx建模佐剂在制备pdx动物模型中的应用。在一个具体示例中，制备pdx动物模型中所使用的动物为免疫缺陷小鼠，但不限于此。
41.本发明一实施例的pdx动物模型的制备方法，包括以下步骤：将如上所述的pdx建模佐剂与肿瘤细胞悬液混合，然后接种于免疫缺陷动物体内。
42.综上，本发明的pdx建模佐剂为提高pdx模型接种成功率，加速肿瘤生长以适应实验需求，组合多种促血管生成因子和营养物质，能够解决pdx模型早期血管网建立困难的问题，并且结合局部抗炎药物氢化可的松、促干细胞生长的化合物rock抑制剂y
‑
27632，有助于保证肿瘤干细胞的存活，降低肿瘤细胞凋亡，从而避免肿瘤移植物陷入边生长边凋亡的情况，破解肿瘤的生长阻滞，进而改善了pdx模型建模成功率，加快了肿瘤异体移植模型生长速度。
43.以下为具体实施例。
44.实施例1
45.将肿瘤细胞消化为单细胞后，计数，并用dmem重悬。将肿瘤细胞用dmem培养基重悬后，细胞悬液添加matrigel(v:v＝1：1)，添加佐剂(细胞悬液：佐剂(v:v)＝10:1)之后立即于冰上运至实验设施进行接种，接种细胞总量5
×
10e5～1
×
10e7细胞/只。接种时对照组和实验组采用不同的佐剂，配方如下所示：
[0046][0047]
如图1所示，对自2020年11月起至2021年5月建立的pdx模型建模情况进行跟踪分析显示，在未使用该佐剂接种的12个pdx模型中，平均成瘤时间为92
±
9天，在使用该佐剂接种的24个pdx模型中，平均成瘤时间为27
±
4天，两者存在显著差异，表明该佐剂能够显著加快患者肿瘤建立pdx模型的速度。
[0048]
实施例2
[0049]
将建成的pdx模型肿瘤从荷瘤鼠上收集后，经细胞消化处理转接至下一代动物上。即将肿瘤消化为单细胞后，计数，并用dmem重悬。将肿瘤细胞用dmem培养基重悬后，细胞悬液添加matrigel(v:v＝1：1)，与佐剂混合后立即于冰上运至实验设施进行接种，接种细胞总量5
×
10e5～1
×
10e7细胞/只。接种时细胞等分为2组，分别采用不同的佐剂，配方如下所示：
[0050][0051]
结果如图2所示，未发现小鼠体重发生显著变化，而肿瘤体积达到500mm3的时间如图3所示提前3天，说明该佐剂具有加快pdx模型生长作用，且对动物健康无不良影响。
[0052]
实施例3
[0053]
将建成的pdx模型液氮冻存后复苏，在细胞复苏后按照前述方法分别添加不同佐剂并进行接种，配方如下所示：
[0054][0055][0056]
结果如图4所示，与对照组相比，实验组的体重未见显著差异。如图5所示，至接种后25天时，实验组肿瘤平均体积达到1510.3
±
487.53mm3，显著大于对照组的846
±
139.1mm3，说明添加该佐剂可以显著加快pdx模型复苏过程，且对动物健康无不良影响。
[0057]
实施例4
[0058]
将建成的pdx模型液氮冻存后复苏，在细胞复苏后按照前述方法分别添加不同佐剂并进行接种，接种9组动物，每组3只，测试不同的组分对肿瘤生长的影响，分析混合佐剂与单一组分的促肿瘤差异。佐剂配方如下所示：
[0059][0060]
接种31天后，结束实验，结果如图6所示，各组均未发现体重显著变化。肿瘤体积从第2周开始每周两次检测，肿瘤生长曲线如图7所示，各组成瘤情况如下表所示。
[0061][0062]
以上结果显示，各个组分均有一定的促进肿瘤生长效果，而通过联合使用，配制成佐剂，可以发挥明显更强的促进肿瘤生长的作用。
[0063]
实施例5
[0064]
在研究佐剂配方时，我们也发现并非任意的细胞因子均可促进pdx模型成瘤，部分细胞因子对pdx模型成瘤甚至有反作用。例如azd
‑
5069，由astrazeneca公司研发，可口服，能够选择性拮抗趋化因子受体(cxcr2)，具有可逆性和时间温度依赖性，ic50为0.79nmol/l。该药物能够拮抗cxcr2，从而阻止肿瘤细胞吸引趋化性巨噬细胞。在正常患者体内，该阻截作用降低肿瘤趋化性巨噬细胞的浸润同时，导致抑制性t细胞增加及抑制血管生成，从而有一定抑制肿瘤生长作用。但在免疫缺陷动物中，由于缺乏t细胞存在，因此理论上azd5069无法实现其抑瘤作用，反而可以降低接种位置趋化性吸引巨噬细胞的能力，降低局部炎症反应。然而，在实际实验中该作用并未体现。再例如il
‑
10(白细胞介素10)，il
‑
10是明确的
免疫抑制分子，它能抑制apc的天然免疫功能和获得性免疫功能，造成免疫抑制。il
‑
10也是某些肿瘤细胞的生长因子，大量研究已证实许多恶性肿瘤组织或细胞均可产生il
‑
10，如恶性黑色素瘤、结直肠癌、卵巢癌、肺癌、脑胶质瘤等。白细胞介素10影响许多造血细胞的体外生长和分化，并且能够抑制巨噬细胞以及t细胞的功能。在il
‑
10缺陷小鼠中，虽然淋巴细胞发育和抗体反应正常，但大多数动物生长迟缓和贫血，并患有慢性小肠结肠炎。
[0065]
将肿瘤细胞消化为单细胞后，计数，并用dmem重悬。将肿瘤细胞用dmem培养基重悬后，细胞悬液添加matrigel(v:v＝1：1)，与佐剂混合后立即于冰上运至实验设施进行接种，接种细胞总量5
×
10e5～1
×
10e7细胞/只。接种时对照组和实验组采用不同的佐剂，配方如下所示：
[0066][0067]
结果如图8和图9所示，在构建pdx模型时添加il
‑
10或azd
‑
5069的情况下，第31天时未显示促进肿瘤生长的效果，测试组的肿瘤体积反而小于对照组的肿瘤体积。由此可见，并非有利于肿瘤细胞的生长因子均能够促进pdx模型成瘤，以提高建模成功率和建模速度。
[0068]
综上所述，本发明的pdx建模佐剂能够显著加快建模、传代及复苏过程中pdx模型的增长，从而减少因模型生长不稳定导致的实验失败情况，降低实验成本，改善pdx模型的使用性能。本发明的佐剂配方不仅能够补充pdx建模中肿瘤细胞所需的细胞因子，解除肿瘤细胞生长阻滞，同时添加了抑制局部免疫反应、降低宿主免疫攻击的相关组分，以及维持肿瘤干细胞存活、降低凋亡的组分，从而能够更好的支持pdx模型生长，解决了pdx模型生长周期长、肿瘤生长不稳定的问题，对于改善相关模型建模有积极意义。
[0069]
实施例6
[0070]
将肿瘤细胞消化为单细胞后，计数，并用dmem重悬。将肿瘤细胞用dmem培养基重悬后，细胞悬液添加matrigel(v:v＝1：1)，与佐剂混合后立即于冰上运至实验设施进行接种，接种细胞总量5
×
10e5～1
×
10e7细胞/只。接种时分别采用不同的佐剂，配方如下所示：
[0071][0072]
结果如图10和图11所示，在构建pdx模型时与最优配比相比，更高剂量的佐剂添加并未显示出显著的促肿瘤生长效果，而低于本发明提出的浓度范围添加佐剂，肿瘤生长显著低于按照最优配比添加佐剂组。更高剂量的佐剂将带来不必要的实验成本，而更低剂量无法充分发挥添加佐剂的作用，由此可见，实验组1为目前选择的佐剂剂量为最优剂量。
[0073]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0074]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。