一种太子参多糖及其制备方法与流程

1.本发明涉及多糖制备的技术领域，尤其涉及一种太子参多糖及其制备方法。


背景技术：

2.太子参又名“孩儿参”，具有益气、健脾润肺之功效，临床常用于食欲不振、病后康复、止咳等不适症，常作为滋补佳品。相对于人参、西洋参而言，太子参药性温和，更适宜于儿童食用。太子参多糖是太子参中主要的活性物质之一，研究表明，太子参多糖有多种健康保护作用，比如调节免疫、抗氧化、抗疲劳、抗肿瘤、降血糖等。
3.目前，有很多关于制备太子参多糖的方法。然而，这些制备方法存在一定的弊端：一方面采用传统熬制、浸泡等方式得到的太子参浸提液，其原料特有的土腥味、中药味仍十分突出，对产品的风味、口感有负面影响，不易被消费者接受；另一方面活性成分的含量及纯度不明，成分复杂，不利于产品质量的控制。因此，提供一种可掩盖太子参固有土腥味、中药味等不良风味且纯度极高的太子参多糖是目前急需解决的问题。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于为克服现有技术中存在的上述缺陷，提供一种可掩盖太子参固有土腥味、中药味等不良风味且纯度高的太子参多糖及其制备方法。
5.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
6.本发明提供了一种太子参多糖的制备方法，包括如下步骤：
7.(1)将太子参烘干破碎，得太子参粉；
8.(2)对所得太子参粉顺次进行水提、浓缩，得浓缩液；
9.(3)对所得浓缩液进行醇沉，将所得沉淀冷冻干燥后得太子参粗多糖；
10.(4)对所得太子参粗多糖顺次进行纯化、洗脱、透析、浓缩和冷冻干燥，得太子参多糖。
11.优选的，所述步骤(1)太子参粉的粒径为40～60目。
12.优选的，所述步骤(2)中，所述水提是指在太子参粉中加入8～10倍水进行提取，水提的温度为80～120℃，水提的时间为100～140min，水提的次数为2～4次；
13.所述浓缩为浓缩至原体积的1/11～1/9。
14.优选的，所述步骤(3)中，所述醇沉是采用乙醇进行沉淀，所述乙醇的体积分数为75～85％，所述醇沉的温度为3～5℃，醇沉的时间为12～18h；
15.所述冷冻干燥的温度为
‑
40～
‑
20℃，冷冻干燥的时间为48～72h。
16.优选的，所述步骤(4)中，所述纯化是采用deae cellulose
‑
52离子交换柱纯化多糖，所述纯化条件为采用tris
‑
hcl缓冲液上样，所述tris
‑
hcl缓冲液的ph为7.5～7.7，所述上样的浓度为1～2mg/ml太子参粗多糖；
17.所述洗脱是指顺次用含0、0.1、0.2、0.3mol/lnacl的盐溶液等体积洗脱，收集第一个单一洗脱峰，所述洗脱的流速为1.5～2.5ml/min；
18.所述透析是指用450～550da的透析袋进行透析；
19.所述浓缩为浓缩至原体积的1/11～1/9；
20.所述冷冻干燥的温度为
‑
40～
‑
20℃，冷冻干燥的时间为48～72h。
21.本发明还提供了一种太子参多糖。
22.与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
23.本发明方法可有效掩盖太子参固有土腥味、中药味等不良风味且纯度高。经研究验证，本发明制得的太子参多糖还可通过调整小鼠体重生长，修复组织病理损伤，缓解机体炎症表达水平，综合表现出太子参多糖具备调节小鼠体内免疫的能力。
附图说明
24.图1为空白组的raw264.7小鼠巨噬细胞形态图；
25.图2为模型组的lps诱导损伤的raw264.7小鼠巨噬细胞形态图；
26.图3为实施例2所得太子参多糖80μg/ml剂量组对lps诱导损伤的raw264.7细胞形态的影响图；
27.图4为实施例2所得太子参多糖160μg/ml剂量组对lps诱导损伤的raw264.7细胞形态的影响图；
28.图5为实施例2所得太子参多糖320μg/ml剂量组对lps诱导损伤的raw264.7细胞形态的影响图；
29.图6为实施例2所得太子参多糖640μg/ml剂量组对lps诱导损伤的raw264.7细胞形态的影响图；
30.图7为不同处理组的小鼠体重增重情况比较图(注：与空白组比较，*p<0.05，**p<0.01；与模型组比较，#p<0.05，##p<0.01)；
31.图8为空白组的小鼠肝组织切片图(200x)；
32.图9为模型组的小鼠肝组织切片图(200x)；
33.图10为实施例2所得太子参多糖低剂量组的小鼠肝组织切片图(200x)；
34.图11为实施例2所得太子参多糖中剂量组的小鼠肝组织切片图(200x)；
35.图12为实施例2所得太子参多糖高剂量组的小鼠肝组织切片图(200x)；
36.图13为空白组的小鼠肾组织切片图(200x)；
37.图14为模型组的小鼠肾组织切片图(200x)；
38.图15为实施例2所得太子参多糖低剂量组的小鼠肾组织切片图(200x)；
39.图16为实施例2所得太子参多糖中剂量组的小鼠肾组织切片图(200x)；
40.图17为实施例2所得太子参多糖高剂量组的小鼠肾组织切片图(200x)；
41.图18为不同处理组的小鼠血清中免疫因子的含量图(注：与空白组比较，*p<0.05，**p<0.01；与模型组比较，#p<0.05，##p<0.01)。
具体实施方式
42.本发明提供了一种太子参多糖的制备方法，包括如下步骤：
43.(1)将太子参烘干破碎，得太子参粉；
44.(2)对所得太子参粉顺次进行水提、浓缩，得浓缩液；
45.(3)对所得浓缩液进行醇沉，将所得沉淀冷冻干燥后得太子参粗多糖；
46.(4)对所得太子参粗多糖顺次进行纯化、洗脱、透析、浓缩和冷冻干燥，得太子参多糖。
47.在本发明中，所述步骤(1)太子参粉的粒径优选为40～60目，进一步优选为50目。
48.在本发明中，所述步骤(2)中，所述水提是指在太子参粉中优选加入8～10倍水进行提取，进一步优选为9倍水进行提取，所述水提的温度优选为80～120℃，进一步优选为90～110℃，更进一步优选为100℃，水提的时间优选为100～140min，进一步优选为110～130min，更进一步优选为120min，水提的次数优选为2～4次，进一步优选为3次；
49.所述浓缩为优选浓缩至原体积的1/11～1/9，进一步优选为浓缩至原体积的1/10。
50.在本发明中，所述步骤(3)中，所述醇沉优选采用乙醇进行沉淀，所述乙醇的体积分数优选为75～85％，进一步优选为80％，所述醇沉的温度优选为3～5℃，进一步优选为4℃，醇沉的时间优选为12～18h，进一步优选为13～16h，更进一步优选为14h；
51.所述冷冻干燥的温度优选为
‑
40～
‑
20℃，进一步优选为
‑
35～
‑
25℃，更进一步优选为
‑
30℃，冷冻干燥的时间优选为48～72h，进一步优选为56～64h，更进一步优选为60h。
52.在本发明中，所述步骤(4)中，所述纯化优选采用deae cellulose
‑
52离子交换柱纯化多糖，所述纯化条件为优选采用tris
‑
hcl缓冲液上样，所述tris
‑
hcl缓冲液的ph优选为7.5～7.7，进一步优选为7.6，所述上样的浓度优选为1～2mg/ml太子参粗多糖，进一步优选为1.5mg/ml太子参粗多糖；
53.所述洗脱优选顺次用含0、0.1、0.2、0.3mol/lnacl的盐溶液等体积洗脱，收集第一个单一洗脱峰，所述洗脱的流速优选为1.5～2.5ml/min，进一步优选为2ml/min；
54.所述透析优选用450～550da的透析袋进行透析，进一步优选为用500da的透析袋进行透析；
55.所述浓缩为优选浓缩至原体积的1/11～1/9，进一步优选为浓缩至原体积的1/10；
56.所述冷冻干燥的温度优选为
‑
40～
‑
20℃，进一步优选为
‑
35～
‑
25℃，更进一步优选为
‑
32℃，冷冻干燥的时间优选为48～72h，进一步优选为56～64h，更进一步优选为62h。
57.本发明还提供了一种太子参多糖。
58.下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
59.实施例1
60.1)将太子参烘干后，用高速破碎机破碎，过40目筛，得太子参粉；
61.2)在太子参粉中加入8倍蒸馏水，80℃提取100min后离心，提取2次，合并滤液，浓缩至原体积的1/11，后用体积分数为75％的乙醇，在3℃下醇沉12小时，离心得沉淀，在
‑
40℃下冷冻干燥48h得太子参粗多糖；
62.3)采用deae cellulose
‑
52离子交换柱纯化多糖，纯化条件为：ph为7.5的tris
‑
hcl缓冲液上样，上样浓度为1mg/ml太子参粗多糖，上样结束后，顺次用含0、0.1、0.2、0.3mol/lnacl的盐溶液等体积洗脱，流速为1.5ml/min，收集第一个单一洗脱峰，450da透析袋透析除盐，浓缩至原体积的1/11，在
‑
40℃下冷冻干燥48h后得太子参多糖。
63.实施例2
64.1)将太子参烘干后，用高速破碎机破碎，过50目筛，得太子参粉；
65.2)在太子参粉中加入9倍蒸馏水，100℃提取120min后离心，提取3次，合并滤液，浓缩至原体积的1/10，后用体积分数为80％的乙醇，在4℃下醇沉14小时，离心得沉淀，在
‑
30℃下冷冻干燥60h得太子参粗多糖；
66.3)采用deae cellulose
‑
52离子交换柱纯化多糖，纯化条件为：ph为7.6的tris
‑
hcl缓冲液上样，上样浓度为1.5mg/ml太子参粗多糖，上样结束后，顺次用含0、0.1、0.2、0.3mol/lnacl的盐溶液等体积洗脱，流速为2ml/min，收集第一个单一洗脱峰，500da透析袋透析除盐，浓缩至原体积的1/10，在
‑
32℃下冷冻干燥62h后得太子参多糖。
67.实施例3
68.1)将太子参烘干后，用高速破碎机破碎，过60目筛，得太子参粉；
69.2)在太子参粉中加入10倍蒸馏水，120℃提取140min后离心，提取4次，合并滤液，浓缩至原体积的1/9，后用体积分数为85％的乙醇，在5℃下醇沉18小时，离心得沉淀，在
‑
20℃下冷冻干燥72h得太子参粗多糖；
70.3)采用deae cellulose
‑
52离子交换柱纯化多糖，纯化条件为：ph为7.7的tris
‑
hcl缓冲液上样，上样浓度为2mg/ml太子参粗多糖，上样结束后，顺次用含0、0.1、0.2、0.3mol/lnacl的盐溶液等体积洗脱，流速为2.5ml/min，收集第一个单一洗脱峰，550da透析袋透析除盐，浓缩至原体积的1/9，在
‑
20℃下冷冻干燥72h后得太子参多糖。
71.实施例4
72.1)将太子参烘干后，用高速破碎机破碎，过50目筛，得太子参粉；
73.2)在太子参粉中加入9倍蒸馏水，100℃提取120min后离心，提取3次，合并滤液，浓缩至原体积的1/10，后用体积分数为80％的乙醇，在4℃下醇沉14小时，离心得沉淀，在
‑
30℃下冷冻干燥60h得太子参粗多糖；
74.3)采用deae cellulose
‑
52离子交换柱纯化多糖，纯化条件为：ph为7.6的tris
‑
hcl缓冲液上样，上样浓度为1.5mg/ml太子参粗多糖，上样结束后，顺次用含0、0.1、0.2、0.3mol/lnacl的盐溶液等体积洗脱，流速为2ml/min，收集第一个单一洗脱峰，500da透析袋透析除盐，浓缩至原体积的1/10，在
‑
32℃下冷冻干燥62h后得太子参多糖。
75.实施例5
76.1)将太子参烘干后，用高速破碎机破碎，过50目筛，得太子参粉；
77.2)在太子参粉中加入9倍蒸馏水，100℃提取120min后离心，提取3次，合并滤液，浓缩至原体积的1/10，后用体积分数为80％的乙醇，在4℃下醇沉14小时，离心得沉淀，在
‑
30℃下冷冻干燥60h得太子参粗多糖；
78.3)采用deae cellulose
‑
52离子交换柱纯化多糖，纯化条件为：ph为7.6的tris
‑
hcl缓冲液上样，上样浓度为1.5mg/ml太子参粗多糖，上样结束后，顺次用含0、0.1、0.2、0.3mol/lnacl的盐溶液等体积洗脱，流速为2ml/min，收集第一个单一洗脱峰，500da透析袋透析除盐，浓缩至原体积的1/10，在
‑
32℃下冷冻干燥62h后得太子参多糖。
79.实验例1
80.研究实施例2所得太子参多糖对raw264.7小鼠巨噬细胞体外免疫调节作用的影响：以raw264.7小鼠巨噬细胞为模型，设置6个处理组：空白组、模型组、80、160、320、640μg/ml实施例2所得太子参多糖剂量组；观察太子参多糖对免疫损伤的细胞形态的影响，细胞形态变化如图1
‑
6所示。
81.由图1
‑
6可知，空白对照组的小鼠巨噬细胞大多呈椭圆或圆形；模型组免疫损伤的细胞形态发生改变，伸展爬开呈现成纤维样，呈现较多的菱形、梭形，细胞密度也大不如空白对照组，还可见较长伪足；加入实施例2所得太子参多糖后的细胞相对收缩变圆，增殖减慢，呈标准圆形、类椭圆形、纺锤形及其他不规则形等。可见，实施例2所得太子参多糖具有调节免疫的潜在能力。
82.实验例2
83.研究实施例2所得太子参多糖对小鼠机体免疫调节作用的影响：选取清洁级昆明小鼠40只，随机分为5组：空白组、模型组、太子参多糖低、中、高剂量组，每组雌雄各4只。
84.正常组灌胃、注射生理盐水；模型组灌胃生理盐水，皮下注射150mg/kg d
‑
半乳糖；低剂量组灌胃75mg/kg实施例2所得太子参多糖，皮下注射150mg/kg d
‑
半乳糖；中剂量组灌胃150mg/kg实施例2所得太子参多糖，皮下注射150mg/kg d
‑
半乳糖；高剂量组灌胃300mg/kg实施例2所得太子参多糖，皮下注射150mg/kg d
‑
半乳糖。
85.实验进行至49天，对小鼠末次给药后，断食不断水12h，称重，取血，处死。测定其体重生长、组织病理、免疫分子含量变化，结果如图7
‑
18所示。
86.由图7可知，模型组的体重增长率为15％左右。与模型组相比，实施例2所得太子参多糖的同步喂养使小鼠的体重增长有一定回升，接近20％，相对缓解了d
‑
半乳糖导致的不良发育状况。
87.由图8
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12可知，模型组的细胞核表现出明显核固缩或其他变形，细胞质疏松化，核界限模糊，经太子参多糖干预后，肝细胞核固缩现象及细胞质疏松化现象得到缓解，细胞形态结构更趋完整，细胞质紧密，说明实施例2所得太子参多糖对肝损伤有一定的修复作用。
88.由图13
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17可知，相较于正常组，模型组出现肾小球体积明显增大，部分肾小囊腔变窄的现象。太子参多糖干预后，肾小球体积均有不同程度的相对缩小，肾小囊腔积相对变大，说明实施例2所得太子参多糖对肾脏损伤有一定的修复作用。
89.细胞因子的分泌水平反映了机体的炎症反应及应答能力。由图18可知，与模型组相比，实施例2所得太子参多糖组的小鼠的炎症水平(il
‑
6、il
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1β、tfn
‑
α)相对下调。
90.研究结果综合提示，本发明制得的太子参多糖通过调整小鼠体重生长，修复组织病理损伤，缓解机体炎症表达水平，综合表现出太子参多糖具备调节小鼠体内免疫的能力。
91.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。