一种产beta-丙氨酸酵母菌及其构建方法与流程

一种产beta
‑
丙氨酸酵母菌及其构建方法
技术领域
1.本发明属于代谢工程和基因工程领域，具体地说，涉及一种产β
‑
丙氨酸的酿酒酵母工程菌及其构建方法。


背景技术：

2.β
‑
丙氨酸(beta
‑
丙氨酸)是自然界中存在的一种天然β型氨基酸。虽然不是蛋白质氨基酸，但其参与多种功能性物质如肌肽、维生素b5的合成，被广泛应用于医药、食品、化工等行业。例如可用于合成泛酸、泛酸钙、肌肽、帕米磷酸钠、八柳氮等，也可作为一种膳食补充剂为肌肉提供能量。由于β
‑
丙氨酸及其衍生物在医药、美容、食品、饲料及化工等领域有广泛应用，因而市场需求量日渐上升。
3.β
‑
丙氨酸制备方法有化学法、酶法及发酵法三种方法。其中，化学法和酶法是现在主要的生产方法。化学法包括丙烯腈法、丙烯酸法、β
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氨基丙腈法、琥珀酰亚胺降解法等，但这些方法为高温、高压反应，工艺条件苛刻，且反应过程副产物较多，提取过程复杂，成本高，环境不友好，这些不可避免的缺点导致化学法合成β
‑
丙氨酸在市场上的竞争力越来越弱。
4.酶法催化合成β
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丙氨酸主要是l
‑
天冬氨酸在l
‑
天冬氨酸α脱羧酶(adc)催化下脱羧生成β
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丙氨酸，该方法催化效率高、条件温和、提取工艺简单环保，一直是研究的热点，但该方法的缺陷是酶催化底物天冬氨酸比较昂贵，导致生产成本较高，工业化受到很大限制。专利文献cn201710659654.9公开了生物酶法催化丙烯酸加氨合成β
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丙氨酸的方法，但因为后处理步骤繁琐、生产成本较高因而无法工业化应用。发明人在前的研究cn201911182183.2中报道了以丙烯酸或丙烯腈为底物、用天冬氨酸氨裂合酶突变体aspb
‑
11
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d4催化生产β
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丙氨酸，但在工业化生产方面尚需进一步完善。
5.发酵法采用廉洁易得的葡萄糖作为起始原料，近些年来逐渐成为新研究方向，专利文献cn201910474753.9公开了在大肠杆菌工程菌中实现了以葡萄糖为原料发酵产β
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丙氨酸，产量高达50g/l，糖酸转化率达40％，但该方法还仅处于实验室研究阶段。此外，专利文献cn112662609a、cn112625985a、cn103898033a也公开了利用大肠杆菌工程菌发酵来生产β
‑
丙氨酸，但也都仅限于实验室研究阶段，尚无法实现工业化应用。
6.现有技术的发酵法基本上都是采用大肠杆菌工程菌进行发酵，这存在一个致命缺陷。因为在公众看来，尤其是β
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丙氨酸产品的普通消费者看来，大肠杆菌是一种致病菌，发酵产品会存在内毒素，这导致β
‑
丙氨酸产品的用户难以接受，严重影响发酵产品的市场销售。


技术实现要素：

7.为了探索采用公认的生物安全模式微生物比如谷氨酸棒杆菌、乳酸菌、枯草芽孢杆菌、面包酵母、酿酒酵母等作为菌种通过发酵来生产β
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丙氨酸的可行性，我们对于β
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丙氨酸在不同种类微生物中的可能代谢途径进行了推演和实验，并在某些微生物中取得了成
功。例如，开发出了酿酒酵母by4742(matα his3δ1 leu2δ0 lys2δ0 ura3δ0)生物合成β
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丙氨酸的代谢路线，从而使本发明构建的酿酒酵母工程菌能够实现β
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丙氨酸的一步发酵生产。
8.因此，本发明的第一个目的在于提供一种产β
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丙氨酸的酿酒酵母，其为酿酒酵母by4742衍生菌，在基因组上整合了外源的编码甲基丙二酰
‑
coa变构酶的mmut基因、编码甲基丙二酰
‑
coa脱羧酶的ygfg基因、编码丙酸coa
‑
转移酶(propionate coa
‑
transferase)的pct基因、编码乳酰基
‑
coa脱水酶alfa亚基的lcda基因、编码乳酰基
‑
coa脱水酶beta亚基的lcdb基因、编码硫酯裂解酶(tesb)的tesb基因和编码氨基裂合酶例如天冬氨酸氨裂合酶的aspb基因。
9.上述酿酒酵母by4742的基因型可以为matα his3δ1 leu2δ0 lys2δ0 ura3δ0即by4742(matα his3δ1 leu2δ0 lys2δ0 ura3δ0)。
10.优选地，上述甲基丙二酰
‑
coa变构酶来源于人homo sapiens(human)，其氨基酸序列为seq id no:1；
11.上述甲基丙二酰
‑
coa脱羧酶来源于大肠杆菌escherichia coli(strain k12)，其氨基酸序列为seq id no:3；
12.上述丙酸coa
‑
转移酶来源于大肠杆菌escherichia coli(strain k12)，其氨基酸序列为seq id no:5；
13.上述乳酰基
‑
coa脱水酶alfa亚基来源于丙酸厌氧菌anaerotignum propionicum dsm 1682，其氨基酸序列为seq id no:7；
14.上述乳酰基
‑
coa脱水酶beta亚基来源于丙酸厌氧菌anaerotignum propionicum dsm 1682，其氨基酸序列为seq id no:9；
15.上述硫酯裂解酶来源于大肠杆菌escherichia coli(strain k12)，其氨基酸序列为seq id no:11；并且/或者
16.上述氨基裂合酶可以是来源于芽孢杆菌bacillus sp.ym55
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1的野生型天冬氨酸氨裂合酶(aspb，文献ruifeng li.et al,computational redesign of enzymes for regio
‑
and enantioselective hydroamination.nat.chem.biol.,2018.中报道的序列)或者其(n142v,h188a)突变体，更优选所述(n142v,h188a)突变体，其氨基酸序列为seq id no:13，已在发明人在前的专利cn201911182183.2中公开，在该专利文献中是氨基酸序列为seq id no:3，编号是aspb
‑
11
‑
d4(相对应地，野生型酶编号为aspb1)，在本文中继续沿用该编号。
17.在一种实施方式中，上述mmut基因的核苷酸序列可以为seq id no:2；
18.上述ygfg基因的核苷酸序列可以为seq id no:4；
19.上述pct基因的核苷酸序列为seq id no:6；
20.上述lcda基因的核苷酸序列可以为seq id no:8；
21.上述lcdb基因的核苷酸序列可以为seq id no:10；
22.上述tesb基因的核苷酸序列为seq id no:12；并且/或者
23.上述aspb基因的核苷酸序列为seq id no:14。
24.本发明的第二个目的在于提供一种构建上述酿酒酵母的方法，其包括以下步骤：
25.a.构建mmut基因表达盒，包括启动子ptef1、mmut基因、终止子adh1t，形成ptef1
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mmut
‑
adh1t表达盒；
26.构建ygfg基因表达盒，包括启动子ptpi1、ygfg基因、终止子prm5t，形成ptpi1
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ygfg
‑
prm5t表达盒；
27.构建pct基因表达盒，包括启动子ptef2、pct基因、终止子idp1t，形成ptef2
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pct
‑
idp1t表达盒；
28.构建lcda基因表达盒，包括启动子peno2、lcda基因、终止子cps1t，形成peno2
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lcda
‑
cps1t表达盒；
29.构建lcdb基因表达盒，包括启动子pgpm1、lcdb基因、终止子idp1t，形成pgpm1
‑
lcdb
‑
idp1t表达盒；
30.构建tesb基因表达盒，包括启动子ppgk3、tesb基因、终止子prm9t，形成ppgk3
‑
tesb
‑
prm9t表达盒；
31.构建aspb基因表达盒，包括启动子ptdh3、aspb
‑
11
‑
d4基因、终止子spg5t，形成ptdh3
‑
aspb
‑
11
‑
d4
‑
spg5t表达盒；
32.b.将上述步骤a构建的7种基因表达盒装载到适合于在酿酒酵母中表达的质粒载体上，形成基因簇表达质粒；
33.c.将步骤b得到的基因簇表达质粒转化入酿酒酵母by4742，筛选基因组中整合了上述7种基因的阳性克隆；
34.d.筛选得到生产β
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丙氨酸的酿酒酵母。
35.优选地，上述适合于在酿酒酵母中表达的质粒载体可以是puc57等，但不限于此，所形成的基因簇表达质粒命名为puc57
‑
pathway质粒。该puc57
‑
pathway质粒全长序列为16192bp。
36.上述步骤c中的质粒转化方法选自化学转化(比如氯化钙转化)和电转化，优选电转化。
37.本发明的第三个目的在于提供上述的酿酒酵母在生产β
‑
丙氨酸中的应用。
38.具体而言，通过上述酿酒酵母的发酵来生产β
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丙氨酸，即通过“一步发酵法”实现β
‑
丙氨酸的从头合成。
39.在发酵时，发酵培养基中可以添加有氨水或铵盐，所述铵盐选自硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵、硝酸铵等。
40.在一种实施方式中，发酵用的种子培养基可以是ypd培养基，菌体发酵培养基是ypd
‑
nh4培养基，组成为：10g/l酵母提取物，20g/l胰蛋白胨，20g/l葡萄糖，根据需要在发酵期间，例如发酵培养至45
‑
48h，添加15％左右的氨水。
41.按照酿酒酵母的生长习性，发酵温度是30℃左右。
42.本发明构建的酿酒酵母工程菌是一种公认的安全模式微生物，能够通过发酵直接产生β
‑
丙氨酸，所得到的发酵产物易于被广大用户接受，具有工业化开发利用价值。
附图说明
43.图1为本发明构建的酿酒酵母by4742(matα his3δ1 leu2δ0 lys2δ0 ura3δ0)菌株内生物合成β
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丙氨酸的代谢路线图。
44.图2是本发明构建的基因簇表达质粒puc57
‑
pathway的结构示意图。
具体实施方式
45.本发明对酿酒酵母by4742(matα his3δ1 leu2δ0 lys2δ0 ura3δ0)菌株内在的代谢途径进行了改变，如图1所示，可以从葡萄糖出发，通过酶系催化实现β
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丙氨酸的生物合成。
46.在该代谢途径中，酿酒酵母菌可以摄入葡萄糖作为碳源，代谢生成丙酮酸和琥珀酰
‑
coa，其中丙酮酸可在乳酸脱氢酶的催化下生成乳酸；琥珀酰
‑
coa先后经甲基丙二酰
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coa变构酶和甲基丙二酰
‑
coa脱羧酶催化生成丙酰
‑
coa；丙酰
‑
coa和乳酸经丙酸coa转移酶催化发生转酰基反应，生成乳酰基
‑
coa；进一步经乳酰基
‑
coa脱水酶、硫酯裂解酶催化生成丙烯酸；丙烯酸可在无机铵存在的条件下，经氨基裂合酶催化生成β
‑
丙氨酸。
47.在本文中，为了描述简便，有时会将某种酶比如硫酯裂解酶tesb与其编码基因(dna)名称混用，本领域技术人员应能理解它们在不同描述场合表示不同的物质。本领域技术人员根据语境和上下文容易理解它们的含义。例如，对于tesb，用于描述硫酯裂解酶的功能或类别时，指的是蛋白质；在作为一种基因描述时，指的是编码该酶的基因。
48.应理解，本发明中整合入酿酒酵母基因组的mmut基因、ygfg基因、pct基因、lcda基因、lcdb基因、tesb基因和aspb基因还可以分别单独地克隆在一个质粒上，然后分别地、或者同时地转入同一个酿酒酵母菌感受态细胞中；也可以将两个以上基因相组合地克隆在一个质粒上；也可以像图2所示的那样，将这7种基因形成基因簇克隆在一个质粒上，然后分别地、或者同时地转入同一个酿酒酵母菌感受态细胞中，经筛选阳性克隆，得到β
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丙氨酸基因工程菌。所述质粒载体可以是任何适合于在酿酒酵母by4742中表达的质粒载体例如puc57等。
49.在本文中，对于本发明，术语“β
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丙氨酸基因工程生产菌”、“β
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丙氨酸基因工程菌”、“丙氨酸生产菌”都表示构建的酿酒酵母by4742工程菌，尤其是酿酒酵母by4742(matα his3δ1 leu2δ0 lys2δ0 ura3δ0)工程菌。
50.为了在酿酒酵母by4742中表达中最佳地表达甲基丙二酰
‑
coa变构酶seq id no:1、甲基丙二酰
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coa脱羧酶seq id no:3、丙酸coa
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转移酶seq id no:5、乳酰基
‑
coa脱水酶alfa亚基seq id no:7、乳酰基
‑
coa脱水酶beta亚基seq id no:9、硫酯裂解酶seq id no:11和氨基裂合酶seq id no:13，本发明对它们的表达基因进行了密码子优化。
51.密码子优化是可用于通过增加感兴趣基因的翻译效率使生物体中蛋白质表达最大化的一种技术。不同的生物体由于突变倾向和天然选择而通常示出对于编码相同氨基酸的一些密码子之一的特殊偏好性。例如，在生长快速的微生物如大肠杆菌中，优化密码子反映出其各自的基因组trna库的组成。因此，在生长快速的微生物中，氨基酸的低频率密码子可以用用于相同氨基酸的但高频率的密码子置换。因此，优化的dna序列的表达在快速生长的微生物中得以改良。
52.经过针对酿酒酵母进行密码子优化，上述7种酶seq id no:1、3、5、7、9、11、13的编码基因分别可以是seq id no:2、4、6、8、10、12、14。
53.以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
54.本文中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。
55.实施例
56.材料和方法
57.实施例中的全基因合成、引物合成及测序皆由苏州金唯智生物科技有限公司完成。
58.本文中的分子生物学实验包括质粒构建、酶切、感受态细胞制备、转化等主要参照《分子克隆实验指南》(第三版)，j.萨姆布鲁克，d.w.拉塞尔(美)编著，黄培堂等译，科学出版社，北京，2002)进行。比如感受态细胞转化方法及感受态制备方法均参照第1章96页进行。必要时可以通过简单试验确定具体实验条件。
59.pcr扩增实验根据质粒或dna模板供应商提供的反应条件或试剂盒说明书进行。必要时可以通过简单试验予以调整。
60.培养基：
61.lb培养基：5g/l酵母提取物，10g/l胰蛋白胨，10g/l氯化钠。(lb固体培养基另加20g/l琼脂粉。)
62.ypd培养基：10g/l酵母提取物，20g/l胰蛋白胨，20g/l葡萄糖。(固体培养基另加20g/l琼脂粉。)
63.ypd
‑
nh4培养基：10g/l酵母提取物，20g/l胰蛋白胨，20g/l葡萄糖，根据需要在发酵培养至48h，添加15％的氨水。
64.以下实施例中，当使用含卡那霉素的培养基时，所述卡那霉素在培养基中的终浓度为50μg/ml。
65.20x电转母液：80g/l甘氨酸，2％吐温80。
66.丙烯酸hplc检测方法：
67.检测仪器：安捷伦1260高效液相色谱仪，色谱柱：上海月旭oaa色谱柱，流动相a(100％)：10mm磷酸二氢钾(0.68g到500ml水)磷酸调至ph2.5，流速1ml/min，柱温箱20℃，检测时间20min，采集波长210nm，进样量5ul。
68.β
‑
丙氨酸hplc检测方法：
69.检测仪器：安捷伦1260高效液相色谱仪，色谱柱：安捷伦sb
‑
c18色谱柱或依利特bds
‑
c18柱，流动相a：2.871g无水乙酸钠 700ml水，流动相b：甲醇，梯度程序见下表，流速1.0ml/min，柱温箱40℃，检测波长334nm，进样量5ul，检测时间20min。
70.时间mina％b％07030670307554515554515.57030207030
71.衍生剂的配制：称取0.1372g邻苯二甲醛、0.0589g n
‑
乙酰
‑
l
‑
半胱氨酸，加2ml无水乙醇，超声波震荡1min至溶解，加硼酸缓冲液至10ml(容量瓶定容)(p1f3位置)。
72.硼酸缓冲液配制：称取6.183g硼酸粉末，加250ml蒸馏水超声波震荡至溶解，然后用6mol naoh溶液调ph至9.5，过滤，备用(p1f2位置)。p1f1位置是水针。衍生方法：1、使用默
认补偿值以最大速度从位置p1f2上抽取5.00μl，在冲洗口清洗针3s。2、使用默认补偿值以最大速度从样品中抽取2.00μl。3、混合：将来自空气中的默认体积，以最大速度混合2次。4、等待0.1min，在冲洗口清洗针3s。5、使用默认补偿值以最大速度从位置p1f3上抽取1.00μl。6、混合：将来自空气中的默认体积，以最大速度混合6次。7、等待0.3min。8、在冲洗口清洗针3s。9、以最大速度，从针座上抽取32.00μl。10、将来自针座的默认体积，以最大速度混合2次。11、等待0.5min。12、进样。
73.实施例中所使用的出发菌株为酿酒酵母by4742(matα his3δ1 leu2δ0 lys2δ0 ura3δ0)，由上海工业生物技术研发中心惠赠。
74.实施例中所使用的质粒puc57
‑
pathway委托苏州金唯智生物科技有限公司合成，任何单位和个人都可以获得这些质粒用于验证本发明，但未经允许不得用作其他用途，包括开发利用、科学研究和教学。
75.实施例1：β
‑
丙氨酸代谢工程菌的构建
76.1.1根据图2的设计，将7种基因搭配与酿酒酵母by4742(matαhis3δ1leu2δ0lys2δ0ura3δ0)适配的功能启动子和终止子，形成7个基因表达盒，其中：lcda基因，使用启动子peno2，终止子cps1t，形成peno2
‑
lcda
‑
cps1t；pct基因，使用启动子ptef2，终止子idp1t，形成ptef2
‑
pct
‑
idp1t；lcdb基因，使用启动子pgpm1，终止子idp1t，形成pgpm1
‑
lcdb
‑
idp1t；ygfg基因，使用启动子ptpi1，终止子prm5t，形成ptpi1
‑
ygfg
‑
prm5t；tesb基因，使用启动子ppgk3，终止子prm9t，形成ppgk3
‑
tesb
‑
prm9t；mmut基因，使用启动子ptef1，终止子adh1t，形成ptef1
‑
mmut
‑
adh1t；aspb
‑
11
‑
d4基因，使用启动子ptdh3，终止子spg5t，形成ptdh3
‑
aspb
‑
11
‑
d4
‑
spg5t。
77.将上述基因簇设计后，送苏州金唯智公司合成，装载到质粒载体puc57上，形成puc57
‑
pathway质粒，全长序列为16192bp，如图2所示。
78.1.2将酿酒酵母by4742(matα his3δ1 leu2δ0 lys2δ0 ura3δ0)菌种在ypd固体培养基上划线，30℃培养2天，挑单菌落转接装有4ml ypd液体培养基的试管。30℃，220rpm过夜培养，转接装有25ml ypd液体培养基的250ml摇瓶，30℃，220rpm培养4～6h，培养至od600为0.8～1.0，菌液用于制备酿酒酵母转化感受态。感受态的制作和转化，使用frozen
‑
ez yeast transformation ii kit进行，严格参考其使用说明书。
79.利用电转化方法将质粒puc57
‑
pathway转入感受态细胞中。转化产物涂布sc
‑
his平板(葡萄糖20g/l，ynb基本氮源1.7g/l，赖氨酸、亮氨酸、尿嘧啶各50mg/l)，30℃培养4天。使用his3作为后续转化酿酒酵母宿主的筛选标记，阳性转化子可在缺少组氨酸的筛选平板上生长。
80.1.3筛选平板上，挑取阳性转化子，进行基因组抽提，以基因组为模板，分别使用下述两对验证引物yz
‑1‑
f/yz
‑1‑
r和yz
‑2‑
f/yz
‑2‑
r对转化子进行pcr验证，pcr反应体系配置严格参考high efficient&high fidelity pcr enzyme kod fx(购自东洋纺公司)。pcr产物进行dna凝胶电泳检测，两个pcr产物分别对应7935bp和6928bp大小。
81.验证引物：
82.yz
‑1‑
f：atgaatactgatgttagaat，
83.yz
‑1‑
r：atgtcttatcaatatgtcaa。
84.yz
‑2‑
f：ttaatgaccaacaaaatttg，
85.yz
‑2‑
r：ttattcagctgcagccatat。
86.实施例2：β
‑
丙氨酸工程菌发酵验证
87.对实施例1中鉴定获得的基因型阳性转化子进行摇瓶发酵验证。将转化子分别接种ypd
‑
nh4培养基进行发酵，30℃、220rpm培养3天。阳性转化子的β
‑
丙氨酸最高产量为3g/l。相反，未进行β
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丙氨酸代谢途径整合的宿主菌不产生丙烯酸和β
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丙氨酸。
88.上述实施例表明，发明人针对酿酒酵母by4742(matα his3δ1 leu2δ0 lys2δ0 ura3δ0)设计的β
‑
丙氨酸代谢途径是成功的。整合了该代谢途径的菌株能够实现发酵液中β
‑
丙氨酸的积累，具有工业化开发潜力。
89.应理解，上述实施例仅用于举例说明目的，而不是对本发明的限制。本领域技术人员在阅读了本发明的构思之后，对其作出的各种改变或调整，均应落入本发明的保护范围内，这些等价形式同样属于本文所附权利要求书限定的范围。