一种同时检测三种分枝杆菌的多重TaqMan荧光定量PCR试剂盒及其应用的制作方法

subsp.hominissuis，mah)、禽分枝杆菌副结核亚种(mycobacterium avium subsp.paratuberculosis，map)和禽分枝杆菌森林土壤亚种(mycobacterium avium subsp.silvaticum，mas)(shin et al.，2020)。
6.结核分枝杆菌复合群(mtbc)是引起人和动物结核病的主要病原菌，禽分枝杆菌副结核亚种(map)是引起反刍动物副结核病的病原菌，禽分枝杆菌禽亚种(maa)是引起禽结核病的病原菌，也能够感染牛等动物，常干扰牛结核病和副结核病的检疫，给牛结核病的净化和副结核病检测带来难题。传统的分枝杆菌分离鉴定方法存在培养条件苛刻、生长极其缓慢、分离率低和容易污染等问题。因此，建立一种快速敏感可区分mtbc、map和maa感染的诊断方法显得非常重要。


技术实现要素：

7.本发明的目的之一是提供一种可同时检测结核分枝杆菌复合群(mycobacterium tuberculosis complex，mtbc)、禽分枝杆菌副结核亚种(mycobacterium avium subsp.paratuberculosis，map)以及禽分枝杆菌禽亚种(mycobacterium avium subsp.avium，maa)的多重taqman荧光定量pcr试剂盒。
8.本发明的目的之二是提供上述试剂盒在检测三种分枝杆菌中的用途，并建立相关的多重taqman荧光定量pcr检测方法。
9.为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
10.本发明发明人在mtbc、map和maa的特异性基因devr、f57和is901设计与合成引物探针基础上，通过优化各种反应条件，从而建立了一种可同时检测三种分枝杆菌的多重taqman荧光定量pcr方法，并对模拟病料和感染小鼠进行了检测。实验结果如下：
11.针对mtbc、map和maa的特异性基因，共设计9对引物和9组探针，通过单重taqman荧光定量pcr，以最低的循环阈值(c
t
)和最高的荧光强度(δrn)增加值作为优化指标，筛选出最优无交叉反应性的mb
‑
2、map
‑
1和maa
‑
2的引物和探针，并确定引物浓度为0.2μm、探针浓度为0.25μm；将上述获得的最优引物、探针进行组合后，通过多重taqman荧光定量pcr方法确定最佳退火温度为59℃，不出现非特异性信号的最大循环数为40个。
12.分别以构建的3种重组质粒(pmd18
‑
t
‑
devr、pmd18
‑
t
‑
f57和pmd18
‑
t
‑
is901)和提取的bcg、map k
‑
10和maa血清ii型基因组dna为阳性标准品模板，建立多重taqman荧光定量pcr的标准曲线。结果显示，标准曲线具有良好的线性关系；检测重组质粒的敏感性为1.0拷贝/μl、细菌基因组为10拷贝/μl；不同细菌之间无交叉反应，特异性强；组内和组间的重复性好，变异系数均在2.5％以下；保存期实验结果显示，在4℃和
‑
20℃放置半年，c
t
值均无显著性差异(p＞0.05)，对多重taqman荧光定量pcr方法无影响。
13.将bcg、map k
‑
10和maa血清ii型单一分枝杆菌、两种组合分枝杆菌以及三种组合分枝杆菌分别与牛外周血细胞和下颌淋巴结混合制备模拟病料，分别提取纯菌液基因组dna与模拟病料基因组dna，应用建立的多重taqman荧光定量方法检测。结果表明，检测单一分枝杆菌或两种组合分枝杆菌时，血细胞和淋巴结模拟病料基因组dna与分枝杆菌基因组dna之间的检测限一致，均能达到1.0或10.0cfu/ml(cfu/g)；检测三种分枝杆菌时，bcg和map k
‑
10基因组dna检测限(1.0cfu/ml)是牛外周血血细胞模拟病料(10.0cfu/ml)的10倍，map k
‑
10基因组dna检测限(1.0cfu/ml)是淋巴结模拟病料(10.0cfu/g)的10倍，而maa血清
ii型和血细胞模拟病料以及bcg、maa血清ii型和淋巴结模拟病料之间的检测限一致，均为1.0cfu/ml(cfu/g)。
14.应用建立的多重taqman荧光定量方法，检测bcg、map k
‑
10和maa血清ii型感染后小鼠的小肠、肝脏、脾脏、肺脏、肠系膜淋巴结和血细胞，并与常规pcr和细菌培养进行比较。结果显示，建立的多重taqman荧光定量方法与常规pcr的阳性符合率为100.0％(175/175)、阴性符合率为87.0％(220/253)，与分枝杆菌培养的阳性符合率为100.0％(116/116)、阴性符合率为69.6％(220/316)。以上结果表明，本研究所建立的多重taqman荧光定量方法可用于mtbc、map和maa的定性和定量检测，为有效防控牛结核病和副结核病奠定基础。
15.在上述研究的基础上，本发明提出了一种同时检测三种分枝杆菌的多重taqman荧光定量pcr试剂盒，所述的试剂盒中包含分别用于检测结核分枝杆菌复合群、禽分枝杆菌副结核亚种以及禽分枝杆菌禽亚种的引物和探针；
16.其中，用于检测结核分枝杆菌复合群的引物和探针序列如下所示：
17.正向引物：gatcctcacgtcctacacctctg
18.反向引物：cgcgccaactccattcc
19.探针：cgattctcgccggtgccagc
20.其中，用于检测禽分枝杆菌副结核亚种的引物和探针序列如下所示：
21.正向引物：agcacgcaggcattccaa
22.反向引物：cggtccagttcgctgtcat
23.探针：tcctgaccacccttc
24.其中，用于检测禽分枝杆菌禽亚种的引物和探针序列如下所示：
25.正向引物：gccctgtccagcctcaaga
26.反向引物：tggttctcggatcgtttgc
27.探针：cgggggctttctacga
28.且以上所述的探针的5’端均标记有不同的荧光报告基团，3’端均标记有荧光淬灭基团。
29.其中，优选的，所述的探针的3’端还结合有小沟结合物(mgb)。
30.其中，优选的，用于检测结核分枝杆菌复合群的探针为：aby
‑
cgattctcgccggtgccagc
‑
qsy；用于检测禽分枝杆菌副结核亚种的探针为fam
‑
tcctgaccacccttc
‑
mgb
‑
nfq；用于检测禽分枝杆菌禽亚种的探针为vic
‑
cgggggctttctacga
‑
mgb
‑
nfq。
31.其中，优选的，所述的试剂盒中还包含2
×
taqpath proamp master mix。
32.其中，优选的，使用所述的试剂盒检测结核分枝杆菌复合群、禽分枝杆菌副结核亚种以及禽分枝杆菌禽亚种的多重taqman荧光定量pcr扩增反应体包括：2
×
taqpath proamp master mix 10μl、10μmol/l上游引物混合1.2μl、10μmol/l下游引物混合1.2μl、dna模板混合物6μl以及ddh2o0.1μl。
33.其中，优选的，使用所述的试剂盒检测结核分枝杆菌复合群、禽分枝杆菌副结核亚种以及禽分枝杆菌禽亚种的多重taqman荧光定量pcr扩增反应条件为：50℃温育2min，95℃预变性10min；95℃变性15s，59℃退火/延伸1min，共进行40个循环。
34.其中，优选的，所述的dna模板通过以下方法制备得到：
35.(1)取1ml菌液，经10000r/min离心2min收集菌体，加入1ml20mg/ml的溶菌酶缓冲液(1g溶菌酶；20mm tris
‑
hcl，ph8.0；2mm edta和1.2％triton x
‑
100)，反复吹打几次混匀，置于180r/min摇床37℃处理2h；
36.(2)处理后的菌体用超声细胞破碎仪进行超声处理，超声程序为：20％振幅，超声3s，间隔5s，超声时间3min；
37.(3)按照dna提取试剂盒说明书步骤分别完成后续菌液基因组dna的提取。
38.进一步的，本发明还提出了所述的多重taqman荧光定量pcr试剂盒在制备检测结核分枝杆菌复合群、禽分枝杆菌副结核亚种以及禽分枝杆菌禽亚种试剂中的用途。
39.相较于现有技术，本发明的有益效果是：
40.1、分枝杆菌属细菌具有细胞壁厚的生物学特点，直接使用细菌基因组dna提取试剂盒提取效果不佳，参考本实验室以往对分枝杆菌属成员的dna提取经验，我们在提取基因组dna前加入了溶菌酶37℃处理2h的步骤以降解其细胞壁。此外，电动研磨器研磨、低振幅超声和氧化锆研磨珠的使用也能提高分枝杆菌属细菌dna的提取效率，本试验对三种方法进行了提取效果的比较，发现20％振幅超声处理后能够得到最大浓度的细菌基因组dna，且对片段完整性无明显影响。此外，苯酚与氯仿抽提法、ctab(十六烷基三甲基溴化铵)抽提法、硅株法等都是国内外常见的分枝杆菌基因组提取方法。
41.2、特异性试验检测到mas基因组dna的扩增信号，这是因为maa与mas高度同源(turenne et a1.，2006)，目前对二者的鉴别只能够根据mas与maa的培养特性不同，(原代培养时要添加草分枝菌素)来实现，通过基因组dna无法区分(张阁et al.，2017)，因此，建立的多重taqman荧光定量pcr是特异的。
42.3、babafemi等系统评价了real
‑
time qpcr在检测病理样本中mtb的有效性，is6110 qpcr、16s rrna qpcr的敏感性和特异性分别为is6110(79％，98％)、16s rrna(69％，99％)(babafemi et al.，2017)。haldar等描述了mtb devr qpcr用于快速诊断儿童结核性脑膜炎的实用性，qpcr检测表现出优秀的敏感性(98％)和特异性(98％)(haldar et al.，2012)。ji lingyun等根据mb psts1基因建立了一种用于btb诊断的灵敏、特异的real
‑
time pcr检测方法，模拟样品的最低可检测浓度为101cfu/ml(ji et al.，2020)。
43.butot等评价了牛乳制品中map f57 qpcr检测方法的性能，检测水平(lod
50
)达10～100cfu/ml，与细菌分离结果的阳性符合率为83％(butot et al.，2019)。alajmi等评估了一种商品试剂盒(靶向特异性转座子序列ismap02)在奶粉样本中的map检测效果，含有map 1.7
×
101cells/50ml的奶粉检测概率为91.6％(alajmi et al.，2016)。
44.slana等建立了基于is901的血液/组织样品中maa检测的三重荧光定量方法，可重复的最低检测限为50个拷贝(slana et al.，2010)。
45.本发明建立的多重荧光定量pcr检测方法特异性和重复性表现优秀，敏感性为bcg 10.0拷贝/μl(0.7fg/μl)、map k
‑
1010.0拷贝/μl(0.8fg/μl)、maa血清2型10.0拷贝/μl(0.9fg/μl)，敏感性高于目前大部分检测方法，比常规pcr方法检测限高100～1000倍，能够同时检测三种病原菌，定量准确、耗时短，有较大的应用价值。
附图说明
46.图1为研磨与超声处理分枝杆菌提取的基因组dna片段的完整性；
47.其中：(a)电动研磨器提取的分枝杆菌基因组dna片段完整性。(b)超声提取的分枝杆菌基因组dna片段完整性。m：dl5000 dna marker；1：bcg基因组片段；2：map k
‑
10基因组片段；3：maa血清ii型基因组片段；
48.图2为重组质粒的pcr鉴定；
49.其中：(a)pmd18
‑
t
‑
devr的pcr鉴定结果。m：dl2000 dna marker；1～5：pmd18
‑
t
‑
devr pcr产物；(b)pmd18
‑
t
‑
f57和pmd18
‑
t
‑
is901的pcr鉴定结果。m：dl2000 dna marker；1～3：pmd18
‑
t
‑
f57 pcr产物；5，6：pmd18
‑
t
‑
is901 pcr产物；
50.图3为引物和探针的单重taqman pcr扩增结果；
51.图4为单重与多重taqman荧光定量pcr扩增曲线；
52.图5为多重taqman荧光定量pcr标准品模板扩增曲线；
53.图6为多重taqman荧光定量pcr标准品模板标准曲线；
54.图7为多重taqman荧光定量pcr基因组模板扩增曲线；
55.图8为多重taqman荧光定量pcr基因组模板标准曲线；
56.图9为常规pcr敏感性试验；
57.其中：m：dl2000 dna marker；1～8：109copies/μl～102copies/μl的bcg pcr扩增产物；9～16：109copies/μl～102copies/μl的map k
‑
10pcr扩增产物；17～24：109copies/μl～102copies/μl的maa pcr扩增产物；
58.图10为多重taqman荧光定量pcr特异性试验；
59.图11为多重taqman荧光定量pcr保存期试验。
具体实施方式
60.下面通过实验并结合实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。
61.实施例1 mtbc、map和maa多重taqman荧光定量pcr方法的建立
62.1菌株
63.牛分枝杆菌bcg(mycobacterium bovis bcg，bcg)(atcc19015)、map k
‑
10(atcc baa
‑
968)参考菌株由本实验保存；maa血清ii型(cvcc276)购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心；e.coli dh5α感受态细胞购自黑龙江泰康生物科技有限公司。
64.2方法
65.2.1引物和探针的设计
66.参考国内外相关文献(sevilla et al.，2015；tasara et al.，2005；slana et al.，2010)，利用primerexpress 3.0软件，针对mtbc中的特异性基因devr、map k
‑
10中的特异性基因f57以及maa血清ii型中的特异性基因is901，分别设计3对引物和3组探针，共9对引物和9组探针，用于多重taqman荧光定量pcr方法引物和探针的筛选。引物和探针由美国abi公司合成，序列见表1。
67.表1荧光定量pcr引物和探针序列
68.[0069][0070]
2.2细菌dna提取方法的优化
[0071]
在细菌基因组dna提取试剂盒的基础上，对本实验中使用的细菌dna提取方法进行了优化。具体方法如下：
[0072]
(4)取3管(od相同的)1ml菌液，经10000r/min离心2min收集菌体，加入1ml 20mg/ml的溶菌酶缓冲液(1g溶菌酶；20mm tris
‑
hcl，ph8.0；2mm edta和1.2％triton x
‑
100)，反复吹打几次混匀，置于180r/min摇床37℃处理2h。
[0073]
(5)将管1置于预冷的冰盒中，防止温度过高。使用电动研磨器，8000r/min持续研磨5min，注意研磨棒贴紧管底部，避免液体飞溅。
[0074]
(6)将管2用超声细胞破碎仪进行超声处理，超声程序为：20％振幅，超声3s，间隔5s，超声时间3min。此时超声探头不可触碰管底，同时ep管需置于冰水混合物中防止过热。
[0075]
(7)将管3加入0.25g的0.2mm氧化锆研磨珠，涡旋仪2800r/min振荡5min。
[0076]
(8)按照dna提取试剂盒说明书步骤分别完成后续3管菌液基因组dna的提取。
[0077]
(9)提取的细菌基因组dna使用超微量分光光度计测定dna浓度，核酸电泳验证片段完整性，并比较3种提取方法的效果。
[0078]
2.3目的片段的克隆及标准品制备
[0079]
本实验设计的标准品引物序列见表2，分别以提取的bcg、map k
‑
10和maa血清ii型细菌基因组dna为模板，按照如下反应体系及反应条件进行常规pcr扩增。pcr反应扩增体
系：2
×
premix ex taq dnapolymerase，25.0μl；上游引物(10mm)1.0μl；下游引物(10mm)1.0μl；模板基因组dna(10ng/μl)，1.0μl；ddh2o，22.0μl。反应条件为：预变性95℃5min；95℃30s、60℃30s、72℃1min，30个循环；72℃1min。
[0080]
表2标准品引物序列
[0081][0082]
(1)将pcr产物于1％琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收目的片段，参照gelextraction kit说明书进行纯化。
[0083]
(2)胶回收纯化产物参照pmd 18
‑
t vector cloning kit说明书，将目的基因连接到pmd 18
‑
t载体上。
[0084]
(3)连接后的重组质粒转化dh5α感受态细胞，将转化后富集的100μl细胞全部涂布于含有氨苄抗性的lb琼脂平板上，于37℃温箱中培养过夜。
[0085]
(4)次日挑取单克隆接种于5ml含有氨苄抗性的液体lb培养基中，180r/min摇床37℃培养12h。
[0086]
(5)取0.5μl菌液，加入10μl的2
×
premix ex taq dna polymerase、8.5μl的ddh2o以及表2
‑
4中对应的上下游引物各0.5μl，做菌液pcr鉴定。
[0087]
(6)鉴定结果为阳性的菌液送吉林省库美生物有限公司进行测序分析。
[0088]
(7)测序结果使用ncbi进行blast序列比对，100％同源的菌液使用质粒提取试剂盒提取重组质粒。
[0089]
(8)超微量分光光度计测定质粒浓度后，按照如下公式计算拷贝数：6.02
×
10
14
×
质粒浓度(ng/μl)/mw(平均分子量)＝拷贝/μl，对于dsdna，mw＝碱基数
×
650(dolton/碱基数)。
[0090]
(9)按照公式将3组阳性质粒的浓度统一稀释至对应的拷贝数为1.0
×
10
10
拷贝/μl，放置
‑
20℃冰箱保存备用。
[0091]
2.4引物、探针的筛选及组合
[0092]
taqman荧光定量pcr加样前进行如下操作：在超净台、移液器、枪头盒、冰盒等表面，定量pcr管、引物、探针、taq酶等外包装喷洒treliefsolution a，然后立刻喷洒treliefsolution b，静置5min后，用dna酶处理过的灭菌水喷洒清洗，吸水纸擦干，以去除dna污染。
[0093]
以bcg、map k
‑
10和maa血清ii型细菌基因组dna为模板，使用本实验设计的9对引物和9组探针，参照taqpath proamp master mix建议的反应条件(表3)及反应体系(表4)进行单重taqman荧光定量pcr分析，验证引物及探针的有效性。以最低的循环阈值(c
t
)和最高
的荧光强度(δrn)增加值为指标筛选各组最优的引物和探针，之后将最优的3组引物探针进行组合，初步建立三重taqman荧光定量pcr扩增方法，并与单重taqman荧光定量pcr结果比较，观察有无交叉反应、彼此对c
t
值有无影响、是否100％扩增。
[0094]
表3单重taqman荧光定量pcr扩增反应体系
[0095][0096][0097]
表4单重taqman荧光定量pcr扩增反应条件
[0098][0099]
2.5多重taqman荧光定量pcr反应条件的优化
[0100]
在单重taqman荧光定量pcr的反应条件下，引物浓度分别采用0.2μm、0.4μm、0.6μm、0.8μm、0.9μm进行优化；探针浓度分别采用0.15μm、0.20μm、0.25μm、0.30μm、0.35μm进行优化；在三重taqman荧光定量pcr的反应条件下，退火温度采用55℃、57℃、59℃、61℃、63℃、65℃，退火时间采用30s、40s、50s、60s，循环数采用36次、38次、40次、42次进行优化。以上参数的选择均以最低的循环阈值(c
t
)和最高的荧光强度(δrn)增加值为标准，同时保证阴性对照模板的检测不出现非特异性信号。
[0101]
2.6多重taqman荧光定量pcr标准曲线建立
[0102]
将标准品质粒进行倍比稀释制成浓度梯度为1.0
×
109拷贝/μl
‑
1.0
×
100拷贝/μl的标准品模板；将bcg、map
‑
k10和maa血清ii型细菌基因组dna进行倍比稀释，制成浓度梯度为1.0
×
108拷贝/μl
‑
1.0
×
100拷贝/μl的基因组模板，选择dna酶处理过的灭菌水做阴性对照，以最佳的引物和探针浓度、退火温度和循环数进行三重taqman荧光定量pcr扩增，由quantstudio design&analysis software v1.4.3分析绘制扩增曲线和标准曲线。
[0103]
2.7多重taqman荧光定量pcr敏感性试验
[0104]
选取浓度梯度为1.0
×
105拷贝/μl
‑
1.0
×
100拷贝/μl的标准品模板以及分枝杆菌
基因组dna模板，以dna酶处理过的灭菌水做阴性对照，进行三重taqman荧光定量pcr扩增，使用相同的荧光定量引物进行单重常规pcr扩增，确定并比较两种方法的敏感性。
[0105]
2.8多重taqman荧光定量pcr特异性试验
[0106]
用于评估本试验建立的多重taqman荧光定量pcr检测方法特异性的细菌菌株见表5。使用优化后的dna提取方法获得分枝杆菌基因组dna，其余菌株的基因组提取参照细菌基因组dna提取试剂盒说明书步骤操作，得到的基因组dna作为pcr模板验证三重taqman荧光定量pcr方法的特异性。
[0107]
表5特异性试验所用菌株
[0108]
[0109]
[0110][0111]
2.9多重荧光定量pcr重复性试验
[0112]
优化后的多重taqman荧光定量pcr方法完成对敏感性、特异性检测后进行重复性试验。共进行3个批次的试验，对拷贝数为1.0
×
106拷贝/μl、1.0
×
105拷贝/μl、1.0
×
104拷贝/μl的分枝杆菌基因组模板进行检测，dna酶处理过的灭菌水作为阴性对照。相同批次的
各拷贝数做3次重复，即3次组内试验，得到组内变异系数；3个不同批次的相同拷贝数pcr扩增结果为组间试验，通过公式计算得到组间变异系数(coefficient of variation，cv)。cv公式：变异系数(cv/％)＝标准差(sd)/平均值(mn)
×
100％。
[0113]
2.10保存期实验
[0114]
将引物、探针与dna酶处理过的灭菌水按比例组装，分别存放于4℃和
‑
20℃条件下，半年后取出，按照优化后的多重taqman荧光定量pcr方法检测同一模板，比较c
t
值与δrn值差异。评价不同温度条件下，建立的多重taqman荧光定量pcr方法的保存期。
[0115]
3实验结果
[0116]
3.1分枝杆菌基因组dna提取方法的优化
[0117]
为了优化分枝杆菌细胞壁破碎方法，在使用细菌基因组dna提取试剂盒前，采用0.2mm的氧化锆研磨珠震荡、20％振幅超声和研磨器研磨的处理方法，提取后的基因组dna`用超微量分光光度计测定浓度(表6)。结果表明，20％振幅超声的提取效率明显优于研磨珠和研磨器的提取效率。
[0118]
表6分枝杆菌基因组dna三种提取方法的比较
[0119][0120]
超声处理可能破坏细菌基因组片段的完整性，本试验通过核酸电泳观察并比较了超声与研磨方法提取的基因组dna条带完整性(图1)。结果显示，两种方法处理后提取的基因组dna均有不同程度的拖带。同时，20％振幅超声提取的基因组dna条带明显较后者更亮，进一步证实了20％振幅超声的提取效率明显优于研磨的方法。
[0121]
3.2重组质粒的鉴定
[0122]
通过菌液pcr鉴定，pmd18
‑
t
‑
devr、pmd18
‑
t
‑
f57和pmd18
‑
t
‑
is901重组质粒的分别扩增得到约630bp、613bp和1472bp的3个目的条带(图2)。将鉴定为阳性的菌液测序分析，通过blast比对显示测序结果与目的基因序列之间100％同源，表明重组质粒构建成功。
[0123]
3.3引物、探针的筛选及组合
[0124]
为了获得最佳的引物和探针，我们使用本实验设计的9对引物和9组探针，以bcg、map k
‑
10和maa血清ii型细菌基因组dna为模板，单重taqman荧光定量pcr验证引物及探针的有效性(见图3)。以最低的c
t
和最高的δrn增加值为指标筛选各组最优的引物和探针，9对引物和9组探针的pcr扩增结果见表7。结果表明，mtbc
‑
2、map
‑
1和maa
‑
2的引物和探针表现最佳。
[0125]
表7引物和探针的有效性验证
[0126][0127]
a
每个靶标获得的平均c
t
值和标准偏差(sd)
[0128]
b
3个重复中taqman荧光定量pcr阳性重复的数量
[0129]
为了检测筛选后的引物探针组合有无交叉反应性，是否影响彼此的扩增效率，我们同时进行了单重和多重taqman荧光定量pcr扩增，比较两种扩增模式下δrn值与c
t
值的变化(图4，表8)。结果表明，多重taqman荧光定量pcr扩增各靶标的δrn值均高于而c
t
值均低于后者，表现出更好的扩增效率，并且三者之间无交叉反应性。
[0130]
表8单重与多重taqman荧光定量pcr扩增数据比较
[0131][0132]
a
每个靶标获得的平均c
t
值和标准偏差(sd)
[0133]
b
3个重复中pcr阳性重复的数量
[0134]
c
undetermined，无扩增信号
[0135]
3.4多重taqman荧光定量pcr反应条件的优化
[0136]
通过单重taqman荧光定量pcr优化引物和探针浓度，多重taqman荧光定量pcr优化
退火温度、退火时间和循环数，以最低的c
t
和最高的δrn增加值为指标。反应条件最终确定为：引物浓度400nm，探针浓度250nm，退火温度59℃，退火时间对pcr扩增结果影响很小，未做调整(1min)，不出现非特异性信号的最大循环数为40次。优化后的多重taqman荧光定量pcr扩增反应体系及扩增反应条件分别见表9和表10。
[0137]
表9优化后的多重taqman荧光定量pcr扩增反应体系
[0138][0139][0140]
表10优化后的多重taqman荧光定量pcr扩增反应条件
[0141][0142]
3.5多重taqman荧光定量pcr标准曲线建立
[0143]
为了建立多重taqman荧光定量pcr的标准曲线，将标准品质粒10倍倍比稀释制成标准品模板，进行多重taqman荧光定量pcr扩增，quantstudio design&analysis software v1.4.3分析绘制的扩增曲线(图5)和标准曲线(图6)。结果表明，在标准品模板浓度1.0
×
100拷贝/μl～1.0
×
109拷贝/μl的梯度区间内，扩增结果呈现了良好的线性关系。软件计算出的拷贝数(x)与c
t
值(y)的线性方程即标准曲线方程为：pmd18
‑
t
‑
devr，y＝
‑
3.35
·
logx 35.589，r2＝0.999；pmd18
‑
t
‑
f57，y＝
‑
3.34
·
logx 37.062，r2＝0.999；pmd18
‑
t
‑
is901，y＝
‑
3.396
·
logx 37.118，r2＝0.998。
[0144]
将bcg、map k
‑
10和maa血清ii型细菌基因组dna制成基因组标准模板，进行taqman多重荧光定量pcr扩增，扩增曲线(图7)和标准曲线(图8)显示，在基因组模板浓度1.0
×
100拷贝/μl～1.0
×
108拷贝/μl的梯度区间内，pcr扩增结果呈现了良好的线性关系。拷贝数(x)与c
t
值(y)的线性方程即标准曲线方程为：mtbc，y＝
‑
3.41
·
logx 42.125，r2＝0.995；map，y＝
‑
3.35
·
logx 43.118，r2＝0.996；maa，y＝
‑
3.50
·
logx 41.693，r2＝0.997。
[0145]
3.6多重taqman荧光定量pcr敏感性试验
[0146]
标准品模板和细菌基因组模板的倍比稀释液进行多重taqman荧光定量pcr扩增，得到的敏感性分析数据见表11。结果显示，多重taqman荧光定量pcr方法检测的拷贝数和浓度最低为bcg 10.0拷贝/μl(0.7fg/μl)、mapk
‑
1010.0拷贝/μl(0.8fg/μl)、maa10.0拷贝/μl(0.9fg/μl)、pmd18
‑
t
‑
devr1.0拷贝/μl(3.6ag/μl)、pmd18
‑
t
‑
f571.0拷贝/μl(3.6ag/μl)、pmd18
‑
t
‑
is901 1.0拷贝/μl(4.5ag/μl)。常规pcr方法检测的拷贝数最低为bcg1000.0拷贝/μl(0.07pg/μl)、map k
‑
1010000.0拷贝/μl(0.8pg/μl)、maa1000.0拷贝/μl(0.09pg/μl)(图9)，以上结果表明，多重taqman荧光定量pcr检测方法的敏感性明显优于常规pcr。
[0147]
表11多重taqman荧光定量pcr敏感性分析
[0148][0149]
a
每个靶标获得的平均c
t
值和标准偏差(sd)
[0150]
b
3个重复中pcr阳性重复的数量
[0151]
c
undetermined，无扩增信号
[0152]
3.7多重taqman荧光定量pcr特异性试验
[0153]
提取表5中所列细菌基因组dna作为模板，通过本试验建立的多重taqman荧光定量pcr方法扩增，结果显示牛分枝杆菌bcg，结核分枝杆菌h37rv、h37ra，非洲分枝杆菌，田鼠分枝杆菌，副结核分枝杆菌map xj41、map hlj37、map ln129、map nm5、k
‑
10参考株，禽分枝杆菌森林土壤亚种(mas)，禽分枝杆菌血清ii型、血清iii型表现出特异性扩增。而strain4
‑
strain24：禽分枝杆菌猪亚种(mah)、母牛分枝杆菌、胞内分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、偶发
分枝杆菌、微黄分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、戈登分枝杆菌、胃分枝杆菌、日内瓦分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、海分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、草分枝杆菌、布鲁氏菌、牛支原体湖北株、肺炎克雷伯氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、肠炎沙门菌、猪链球菌ii型未检测到荧光信号(图10)，说明本试验建立的多重荧光定量pcr方法特异性好。
[0154]
3.8多重taqman荧光定量pcr重复性试验
[0155]
对拷贝数为1.0
×
106拷贝/μl、1.0
×
105拷贝/μl、1.0
×
104拷贝/μl的分枝杆菌基因组模板进行3次组间试验和3次组内试验(表12)。结果表明，组内各重复与各组间重复的扩增数据较为一致，c
t
值的cv均低于2.5％。因此，本试验建立的多重taqman荧光定量pcr方法重复性较好。
[0156]
表12多重taqman荧光定量pcr重复性试验
[0157][0158][0159]
3.9多重taqman荧光定量pcr保存期试验
[0160]
组装好的引物探针混合物，于
‑
20℃和4℃条件下存放半年后，按照优化后的多重taqman荧光定量pcr方法检测同一模板，c
t
值与δrn值无明显差异(表13和图11)。经过t检验分析，p值均大于0.05，因此，在半年的保存期内，4℃和
‑
20℃对建立的多重taqman荧光定量pcr方法无影响。
[0161]
表13多重taqman荧光定量pcr保存期试验
[0162][0163]
a
每个靶标获得的平均c
t
值和标准偏差(sd)
[0164]
b
3个重复中pcr阳性重复的数量
[0165]
4小结
[0166]
本研究筛选出最佳的引物探针组合为mb
‑
2&map
‑
1&maa
‑
2、最适引物浓度为0.2μmol/l、最适探针浓度为0.25μmol/l、最适退火温度为59℃，不出现非特异性信号的最大循环数为40次。建立了敏感性高、特异性强、重复性表现优异、稳定性好的多重taqman荧光定量pcr检测方法。
[0167]
实施例2 mtbc、map和maa多重taqman荧光定量pcr方法的初步应用
[0168]
1菌株和实验动物
[0169]
bcg、map k
‑
10参考菌株由本实验保存，maa血清ii型购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心；24只10周龄的雌性balb/c小鼠购自辽宁长生生物技术有限公司。
[0170]
2方法
[0171]
2.1体外模拟病料的检测
[0172]
2.1.1阴性组织样本的筛选
[0173]
收集27份牛抗凝血样本和12份牛下颌淋巴结组织，采用idexx牛分枝杆菌、副结核分枝杆菌elisa抗体检测试剂盒以及本实验室包被maa抗原制备的elisa酶标板分别检测mb、map和maa的血清抗体，采用普通pcr方法分别检测f57、is901和devr基因，结果显示mb、map和maa的血清学和病原学检测均为阴性，可以开展下列的体外模拟实验。
[0174]
按照如下的前处理方法处理组织样本：
[0175]
(1)牛抗凝血：
[0176]
将1ml抗凝血经3000
×
g离心10min，收集血细胞沉淀，取200μl血细胞，加入3倍体积(600μl)的红细胞裂解液混匀，室温放置5min(期间反复颠倒3次)后10000r/min离心1min，弃去上清。
[0177]
(2)牛淋巴结：
[0178]
在60
×
15mm培养皿中加入1ml灭菌水(dna free)和一片300目灭菌铜网，取0.5g淋巴结(实质)，使用一次性无菌注射器的活塞芯杆将组织充分研磨。收集研磨液，10000r/min离心1min后弃去上清。
[0179]
经过前处理的组织样本按照优化后的细菌基因组dna提取方法提取细菌基因组。使用建立的多重荧光定量pcr方法筛选阴性组织样本。
[0180]
2.1.2体外模拟病料的制备和检测
[0181]
细菌悬液光密度值与菌落计数是具有关联性的，当od600测量值为1时，其cfu数值约为2
×
108/ml。据此关系，分别将bcg、map k
‑
10和maa血清ii型培养至od
600
为1.0左右，然后将分枝杆菌菌液cfu控制在1.0
×
103/ml、1.0
×
102/ml、1.0
×
101/ml和1.0
×
100/ml。分别取1ml稀释后的分枝杆菌菌液参照优化后的分枝杆菌基因组dna提取方法提取基因组。
[0182]
分别取1ml的稀释后的分枝杆菌菌液分别与200μl血细胞、0.5g牛淋巴结实质混合，制备出含有单一分枝杆菌(bcg、map k
‑
10、maa血清ii型)、两种分枝杆菌(bcg&map k
‑
10、bcg&maa血清ii型、map k
‑
10&maa血清ii型)和三种分枝杆菌(bcg&map k
‑
10&maa血清ii型)的血细胞模拟病料以及牛淋巴结模拟病料，参照2.1.1的前处理方法处理模拟病料并提取细菌基因组。
[0183]
使用建立的多重taqman荧光定量pcr方法分别检测分枝杆菌菌液和人工模拟病料，每个样本组内重复检测3次，比较本方法在同一菌液浓度下对分枝杆菌菌液和模拟病料的检测效果。参考3.4的实验结果以及sevilla等发表的文献数据(sevilla et al.，2015)，将c
t
值小于等于40的检测结果判定为阳性。
[0184]
2.2小鼠感染及检测
[0185]
2.2.1小鼠分组及感染实验
[0186]
将24只balb/c小鼠随机分为8组，每组3只。将bcg、map k
‑
10和maa血清ii型菌液控制在5.0
×
106‑
5.0
×
108cfu/ml，制备出含有单一分枝杆菌(bcg、map k
‑
10、maa血清ii型，3组)、两种分枝杆菌(bcg&mapk
‑
10、bcg&maa血清ii型、map k
‑
10&maa血清ii型，3组)和三种分枝杆菌(bcg&map k
‑
10&maa血清ii型，1组)的菌液，用0.5ml微量注射器吸取200μl菌液(控制每种分枝杆菌含有1.0
×
106cfu)分别对24只balb/c小鼠进行尾静脉注射。pbst作为阴性对照组(1组)。以上动物实验已通过中国农业科学院哈尔滨兽医研究所动物伦理委员会批准。
[0187]
2.2.2感染病料的采集
[0188]
在bcg、map k
‑
10、maa血清ii型、bcg&map k
‑
10、bcg&maa血清ii型、map k
‑
10&maa血清ii型、bcg&map k
‑
10&maa血清ii型和pbst感染小鼠后的5d，co2麻醉后对小鼠眼球采血并处死，血液收集在1.5ml含有抗凝剂的ep管中。在生物安全柜中分离小鼠的小肠、肝脏、脾脏、肺脏和肠系膜淋巴结，放入6孔细胞培养板中，板内预先加入2ml含有0.05％tween
‑
80的灭菌middlebrook 7h9培养基。参照3.2.1.1的前处理方法处理抗凝血和小鼠组织，收集全血细胞及组织研磨液。
[0189]
2.2.3感染病料的处理和检测
[0190]
取200μl血细胞(裂解液处理)和500μl组织研磨液，按照优化后的细菌基因组dna提取方法提取细菌基因组，使用建立的多重taqman荧光定量pcr方法检测各组小鼠血细胞及组织脏器的分枝杆菌定殖情况。
[0191]
2.2.4感染病料的培养
[0192]
各取50μl血细胞(裂解液处理)和组织研磨液，在加入混合抗生素(50μg/ml萘啶酸钠盐、50μg/ml盐酸万古霉素和50μg/ml两性霉素b)的7h10固体培养基(10％oadc，0.2％甘油，2mg/l分枝杆菌素)上涂板划线，37℃培养，次日检查污染情况，10
‑
15d后观察统计maa血清ii型生长情况，30d后观察统计bcg及map k
‑
10生长情况。
[0193]
3实验结果
[0194]
3.1体外模拟病料的检测
[0195]
将od
600
为1.0左右的分枝杆菌菌液稀释后将cfu控制在1.0
×
103/ml、1.0
×
102/ml、1.0
×
101/ml和1.0
×
100/ml，分别用已建立的多重taqman荧光定量pcr方法检测单一分枝杆菌(bcg、map k
‑
10、maa血清ii型)、两种分枝杆菌(bcg&map k
‑
10、bcg&maa血清ii型、map k
‑
10&maa血清ii型)和三种分枝杆菌(bcg&map k
‑
10&maa血清ii型)的菌液和分枝杆菌的模拟病料(血细胞和淋巴结)。
[0196]
由表14结果可知，单一分枝杆菌和双重分枝杆菌与模拟病料之间的检测极限保持一致，均为1.0
×
100cfu/ml或1.0
×
101cfu/ml，并且无交叉反应性出现。
[0197]
三种分枝杆菌和血细胞模拟病料的检测结果表明，maa血清ii型和血细胞模拟病料的检测极限一致(1.0
×
100cfu/ml)，而bcg和map k
‑
10的检测极限为1.0
×
100cfu/ml，血细胞模拟病料的检测极限为1.0
×
101cfu/ml。
[0198]
三种分枝杆菌和淋巴结模拟病料的检测结果表明，maa血清ii型和bcg与淋巴结模拟病料的检测极限一致(1.0
×
100cfu/ml)，而map k
‑
10的检测极限为1.0
×
100cfu/ml，淋巴结模拟病料的检测极限为1.0
×
101cfu/ml。
[0199]
[0200]
[0201]
[0202][0203]
3.3.2感染小鼠病料的检测
[0204]
应用建立的多重taqman荧光定量方法，分别检测bcg、map k
‑
10和maa血清ii型或
组合感染小鼠后的小肠、肝脏、脾脏、肺脏、肠系膜淋巴结和血细胞的分枝杆菌，并与普通pcr方法和分枝杆菌培养方法进行比对。结果如表15所示，结果显示，多重taqman荧光定量方法与普通pcr的阳性符合率为100％(175/175)，与分枝杆菌培养阳性符合率为100.0％(116/116)；多重taqman荧光定量方法与普通pcr的阴性符合率为87.0％(220/253)，与分枝杆菌培养阴性符合率为69.6％(220/316)。
[0205]
[0206]
[0207][0208]
4小结
[0209]
(1)建立的多重taqman荧光定量pcr方法在检测单一分枝杆菌或两种分枝杆菌时，模拟病料与分枝杆菌的敏感性一致；在同时检测三种分枝杆菌时，血细胞模拟病料的敏感性(10.0cfu/ml)是bcg和map k
‑
10敏感性(1.0cfu/ml)的1/10，淋巴结模拟病料的敏感性
(10.0cfu/ml)是map k
‑
10敏感性(1.0cfu/ml)的1/10，而maa血清ii型和血细胞模拟病料以及bcg、maa血清ii型和淋巴结模拟病料之间的敏感性一致(1.0cfu/ml)。
[0210]
(2)建立的多重taqman荧光定量pcr方法检测小鼠感染后的小肠、肝脏、脾脏、肺脏、肠系膜淋巴结和血细胞，结果显示，bcg、map和maa分别与普通pcr的阳性符合率均为100.0％(58/58、71/71和46/46)，总符合率为100.0％(171/175)；与分枝杆菌培养阳性的符合率均为100.0％(35/35、34/34和47/47)，总符合率为100.0％(116/116)。bcg、map和maa分别与普通pcr的阴性符合率分别为83.7％(72/86)、98.6％(72/73)和80.9％(76/94)，总符合率为87.0％(220/253)；与分枝杆菌培养阴性的符合率分别为66.1％(72/109)、65.5％(72/110)和78.4％(76/97)，总符合率为69.6％(220/316)。