视网膜组织的制备方法与流程

视网膜组织的制备方法
1.本技术是国际申请号pct/jp2015/080017，国际申请日2015年10月23日，中国申请号201580068968.0，发明名称为“视网膜组织的制备方法”的专利申请的分案申请。
[技术领域]
[0002]
本发明涉及用于由多能干细胞制备视网膜细胞或视网膜组织的方法。
[

背景技术：
]
[0003]
作为由多能干细胞制备诸如视网膜组织的神经组织的方法，已经报道了用于制备神经组织的方法，所述方法包括在无血清培养基中形成均匀的多能干细胞聚集体，悬浮培养所述聚集体，酌情在存在分化诱导因子等的条件下在用于分化诱导的培养基中悬浮培养所述聚集体，从而诱导多能干细胞向目的神经细胞的分化(专利文献1和非专利文献1)。例如，已知用于由多能干细胞得到多层视网膜组织的方法(非专利文献2和专利文献2)，和用于获得多层视网膜组织的方法，所述方法包括在含有wnt信号转导途径抑制物质的无血清培养基中形成均匀的多能干细胞聚集体，然后将其在存在基膜制剂的条件下悬浮培养，然后将其在含血清培养基中悬浮培养(非专利文献3和专利文献3)。另外，还已经报道了用于诱导多能干细胞向下丘脑组织分化的方法(专利文献4和非专利文献4)和诱导多能干细胞向神经前体细胞分化的方法(非专利文献5和6)。
[0004]
在存在饲养细胞的条件下并且加入用于维持未分化状态的因子，培养作为这些制备方法的起始材料的多能干细胞，特别是在灵长类多能干细胞的情形中，从而维持未分化状态。近年来，在维持未分化状态的培养中已经取得了一些改进，并且已经报道了在不存在饲养细胞(无饲养细胞)的条件下加入用于维持未分化状态的因子培养灵长类多能干细胞的方法(非专利文献7，非专利文献8和非专利文献9)。需要使用通过该方法进行无饲养细胞培养的多能干细胞作为起始材料的制备视网膜细胞或视网膜组织的稳定方法。
[0005]
[文献列表]
[0006]
[专利文献]
[0007]
[专利文献1]wo 2009/148170
[0008]
[专利文献2]wo 2011/055855
[0009]
[专利文献3]wo 2013/077425
[0010]
[专利文献4]wo 2013/065763
[0011]
[非专利文献]
[0012]
[非专利文献1]cell stem cell，3，519
‑
32(2008)
[0013]
[非专利文献2]nature，472，51
‑
56(2011)
[0014]
[非专利文献3]cell stem cell，10(6)，771
‑
775(2012)
[0015]
[非专利文献4]nature，480，57
‑
62(2011)
[0016]
[非专利文献5]nature biotechnology，27(3)，275
‑
80(2009)
[0017]
[非专利文献6]proc natl acad sci usa，110(50)，20284
‑
9(2013)
[0018]
[非专利文献7]nature methods，8，424
‑
429(2011)
[0019]
[非专利文献8]scientific reports，4，3594(2014)
[0020]
[非专利文献9]in vitro cell dev biol anim.，46，247
‑
58(2010)
[0021]
[发明概述]
[0022]
[发明要解决的问题]
[0023]
本发明要解决的问题是提供一种用于由在不存在饲养细胞的条件下制备或培养的保持未分化状态的多能干细胞制备视网膜细胞或视网膜组织的方法。
[0024]
[解决问题的方式]
[0025]
本发明人已经进行了深入的研究，尝试解决前述问题，并且发现通过在不存在饲养细胞的条件下培养多能干细胞(特别是人ips细胞)同时维持未分化状态，并且将得到的多能干细胞在含有sonic hedgehog信号转导途径激活物质的培养基中进行悬浮培养，从而形成细胞聚集体，可以高效地形成具有光滑表面和致密内部并且维持未分化状态的球形细胞聚集体。另外，本发明人已经发现，通过使用这种高质量的细胞聚集体，可以高效地诱导视网膜细胞或视网膜组织，这导致了本发明的完成。
[0026]
即，本发明涉及下述各项：
[0027]
[1]用于制备视网膜细胞或视网膜组织的方法，所述方法包括下述步骤(1)
‑
(3)：
[0028]
(1)第一步，在不存在饲养细胞的条件下在含有用于维持未分化状态的因子的培养基中培养人多能干细胞，
[0029]
(2)第二步，在存在sonic hedgehog信号转导途径激活物质的条件下悬浮培养第一步中得到的多能干细胞，从而形成细胞聚集体，和
[0030]
(3)第三步，在存在bmp信号转导途径激活物质的条件下悬浮培养第二步中得到的聚集体，从而得到包含视网膜细胞或视网膜组织的聚集体。
[0031]
[2][1]的制备方法，其中，在第二步中，将在第一步中得到的细胞分散，并且将分散的细胞进行悬浮培养。
[0032]
[3][1]或[2]的制备方法，其中所述用于维持未分化状态的因子是fgf信号转导途径激活物质。
[0033]
[4][3]的制备方法，其中所述fgf信号转导途径激活物质是bfgf。
[0034]
[5][1]
‑
[4]中任一项的制备方法，其中，在第二步中，所述培养基中所述sonic hedgehog信号转导途径激活物质的浓度是与10nm至700nm的sag的sonic hedgehog信号转导活性相对应的浓度。
[0035]
[6][1]
‑
[5]中任一项的制备方法，其中所述sonic hedgehog信号转导途径激活物质是sag、purmorphamine或shh。
[0036]
[7][1]
‑
[6]中任一项的制备方法，其中所述bmp信号转导途径激活物质是选自由bmp2、bmp4、bmp7和gdf7组成的组的一种或多种蛋白。
[0037]
[8][6]的制备方法，其中所述bmp信号转导途径激活物质是bmp4。
[0038]
[9][1]
‑
[8]中任一项的制备方法，其中，在第三步中，在第二步开始后第2天与第9天之间向所述培养基中添加所述bmp信号转导途径激活物质。
[0039]
[10][1]
‑
[9]中任一项的制备方法，其中，在第三步中，在包含浓度不超过与700nm sag的sonic hedgehog信号转导活性相对应的浓度的sonic hedgehog信号转导途径激活物
质的培养基中培养所述聚集体。
[0040]
[11][1]
‑
[10]中任一项的制备方法，其中第一步通过贴壁培养方法进行。
[0041]
[12][1]
‑
[11]中任一项的制备方法，其中所述多能干细胞是诱导的多能干细胞。
[0042]
[13][1]
‑
[12]中任一项的制备方法，其中在第二步中形成均匀的聚集体。
[0043]
[14][1]
‑
[13]中任一项的制备方法，其中在第三步中得到的聚集体包含一种或多种选自由下述各项组成的组的细胞：视网膜祖先细胞，神经视网膜祖先细胞，感光前体细胞，感光细胞，视杆感光细胞，视锥感光细胞，水平细胞，无长突细胞，中间神经元，神经节细胞，视网膜色素上皮细胞，和睫状边缘区细胞。
[0044]
[15][1]
‑
[14]中任一项的制备方法，其中所述悬浮培养在不存在基膜制剂的条件下进行。
[0045]
[16]用于评价测试物质的毒性或功效的试剂，所述试剂包含通过[1]
‑
[15]中任一项的方法制备的视网膜细胞或视网膜组织。
[0046]
[17]用于评价测试物质的毒性或功效的方法，所述方法包括使所述物质与通过[1]
‑
[15]中任一项的方法制备的视网膜细胞或视网膜组织接触，并且检测所述物质对所述细胞或组织的影响。
[0047]
[18]用于治疗由于视网膜组织紊乱导致的疾病的药物，其包含通过[1]
‑
[15]中任一项的方法制备的视网膜细胞或视网膜组织。
[0048]
[19][18]的药物，其中所述视网膜细胞是视网膜祖先细胞和/或视网膜层专有的神经元。
[0049]
[20]用于治疗由于视网膜组织紊乱导致的疾病的方法，所述方法包括向需要移植的受试者移植有效量的通过[1]
‑
[15]中任一项的方法制备的视网膜细胞或视网膜组织。
[0050]
[21]通过[1]
‑
[15]中任一项的方法制备的视网膜细胞或视网膜组织，其用于治疗由于视网膜组织紊乱导致的疾病。
[0051]
[22]包含通过[1]
‑
[15]中任一项的方法制备的视网膜细胞或视网膜组织作为活性成分的药物组合物。
[0052]
[发明效果]
[0053]
按照本发明，可以由在不存在饲养细胞的条件下培养的多能干细胞高效地产生高质量的细胞聚集体，以及视网膜细胞和视网膜组织。
[0054]
[附图简述]
[0055]
图1显示比较例1和实施例1的培养条件以及聚集体的亮视野图像(a
‑
d)。
[0056]
图2显示实施例1的培养条件以及聚集体针对视网膜组织标记(chx10，rx)的免疫组织化学染色图像(a
‑
d)。
[0057]
图3显示实施例2的培养条件和聚集体的亮视野图像(a
‑
d)。
[0058]
图4显示实施例2的培养条件(无bmp4处理)以及定量聚集体形态水平的图表。
[0059]
图5显示实施例3的培养条件以及聚集体针对视网膜组织标记(chx10，rx)的免疫组织化学染色图像(a
‑
d)。
[0060]
图6显示在实施例4的培养条件下产生的视网膜组织针对视网膜组织标记的免疫染色图像。
[0061]
图7显示在实施例5的培养条件下产生的视网膜组织针对视网膜组织标记的免疫
染色图像。
[0062]
图8显示在实施例6的培养条件下产生的聚集体的亮视野图像(a
‑
c)以及针对视网膜组织标记(chx10)的免疫染色图像(d
‑
f)。
[0063]
图9显示在实施例7的培养条件下产生的聚集体的亮视野图像(a
‑
d)以及针对视网膜组织标记(chx10)的免疫染色图像(e)。
[0064]
图10显示在实施例8的培养条件下产生的聚集体的亮视野图像(a，b)以及针对视网膜组织标记(chx10，rx)的免疫染色图像(c，d)。
[0065]
[实施方案描述]
[0066]
1.定义
[0067]
在本发明中，“干细胞”意指具有分化潜能和保持分化潜能的增殖能力(特别是自我更新的能力)的未分化的细胞。干细胞依据分化潜能包括多种亚群，诸如多能干细胞(pluripotent stem cell)，专能干细胞(multipotent stem cell)，单能干细胞等。多能干细胞是指能够在体外培养并且具有分化成属于三个胚层(外胚层、中胚层、内胚层)和/或来源于胚外组织的组织的任意细胞谱系的潜能(多能性)的干细胞。专能干细胞意指具有分化成多种类型的组织或细胞但不是所有种类的组织或细胞的潜能的干细胞。单能干细胞意指具有分化成特定的组织或细胞的潜能的干细胞。
[0068]
多能干细胞可以由受精卵、克隆胚胎、生殖干细胞、组织中的干细胞、体细胞等诱导。多能干细胞的实例包括胚胎干细胞(es细胞)，eg细胞(胚胎生殖细胞)，诱导的多能干细胞(ips细胞)等。由间质干细胞(msc)得到的muse细胞(多系分化应激持久细胞(multi
‑
lineage differentiating stress enduring cell))和由生殖细胞(例如，睾丸)产生的gs细胞也包括在多能干细胞中。胚胎干细胞最先在1981年建立，并且自1989年起还已经用于产生敲除小鼠。在1998年，建立了人胚胎干细胞，其也用于再生药物。可以通过在饲养细胞上或在含有lif的培养基中培养内细胞团而产生es细胞。es细胞的制备方法记载在，例如，wo 96/22362，wo 02/101057，us 5,843,780，us 6,200,806，us 6,280,718等中。胚胎干细胞可从给定的机构得到，或可以购买商购产品。例如，人胚胎干细胞，khes
‑
1，khes
‑
2和khes
‑
3，可从京都大学前沿医学科学研究院(kyoto university’s institute for frontier medical sciences)得到。作为小鼠胚胎干细胞的eb5可从incorporated administrative agency riken得到，并且作为小鼠胚胎干细胞的d3细胞系可从atcc得到。
[0069]
作为es细胞中的一种的核移植es细胞(ntes细胞)可以由通过将体细胞的细胞核移植到无核卵中产生的克隆胚胎建立。
[0070]
eg细胞可以通过在含有mscf、lif和bfgf的培养基中培养原始生殖细胞而产生(cell，70：841
‑
847，1992)。
[0071]
本发明中的“诱导的多能干细胞”是通过已知的方法等使体细胞重新编程而被诱导具有多能性的细胞。具体地，可以提及通过表达多种基因的组合使分化的体细胞(诸如成纤维细胞、外周血单核细胞等)重新编程而被诱导具有多能性的细胞，所述多种基因选自由包括下述各项的重新编程基因组成的组：oct3/4，sox2，klf4，myc(c
‑
myc，n
‑
myc，l
‑
myc)，glis1，nanog，sall4，lin28，esrrb等。优选的重新编程因子的组合的实例包括：(1)oct3/4，sox2，klf4，和myc(c
‑
myc或l
‑
myc)，和(2)oct3/4，sox2，klf4，lin28和l
‑
myc(stem cells，2013；31：458
‑
466)。
[0072]
诱导的多能干细胞由yamanaka等人在2006年在小鼠细胞中建立(cell，2006，126(4)，pp.663
‑
676)。在2007年，还由人成纤维细胞建立了诱导的多能干细胞，并且具有与胚胎干细胞相似的多能性和自我更新能力(cell，2007，131(5)，pp.861
‑
872；science，2007，318(5858)，pp.1917
‑
1920；nat.biotechnol.，2008，26(1)，pp.101
‑
106)。除了基于通过基因表达的直接重新编程的制备方法之外，还可以通过添加化合物等由体细胞得到诱导的多能干细胞(science，2013，341，pp.651
‑
654)。
[0073]
还可以获得建立的诱导的多能干细胞，并且，例如，由京都大学建立的人诱导的多能细胞系，诸如201b7细胞，201b7
‑
ff细胞，253g1细胞，253g4细胞，1201c1细胞，1205d1细胞，1210b2细胞或1231a3细胞等可从京都大学和ips academia japan，inc.获得。作为建立的诱导的多能干细胞，例如，由京都大学建立的ff
‑
i01细胞和ff
‑
i14细胞可从京都大学获得。
[0074]
尽管用于获得诱导的多能干细胞的体细胞没有特别限制，但是可以提及组织来源的成纤维细胞、血液谱系细胞(例如，外周血单核细胞、t细胞)、肝细胞、胰腺细胞、肠上皮细胞、平滑肌细胞等。
[0075]
当通过表达一些种类的基因进行重新编程产生诱导的多能干细胞时，对基因表达的方式没有特别限制。前述方式的实例包括使用病毒载体(例如，反转录病毒载体，慢病毒载体，仙台病毒(sendaivirus)载体，腺病毒载体，腺伴随病毒载体)的感染法，使用质粒载体(例如，质粒载体，附加型载体)的基因转移法(例如，磷酸钙法，脂转染法，retronectin法，电穿孔法)，使用rna载体的基因转移法(例如，磷酸钙法，脂转染法，电穿孔法)，直接注射蛋白的方法等。
[0076]
诱导的多能干细胞可以在存在饲养细胞的条件下或在不存在饲养细胞的条件下(无饲养细胞)产生。当在存在饲养细胞的条件下产生时，所述诱导的多能干细胞可以在存在用于维持未分化状态的因子的条件下通过已知的方法产生。尽管用于在不存在饲养细胞的条件下产生诱导的多能干细胞的培养基没有特别限制，但是可以使用已知的用于胚胎干细胞和/或诱导的多能干细胞的维持培养基和用于在无饲养细胞的条件下建立诱导的多能干细胞的培养基。用于在无饲养细胞的条件下建立诱导的多能干细胞的培养基的实例包括无饲养细胞培养基，诸如essential8培养基，tesr培养基，mtesr培养基，mtesr
‑
e8培养基，stemfit培养基等。例如，可以在不存在饲养细胞的条件下，用仙台病毒(sendaivirus)载体向体细胞中基因转移oct3/4、sox2、klf4和myc 4个因子而产生诱导的多能干细胞。
[0077]
用于本发明的多能干细胞优选是es细胞或诱导的多能干细胞，更优选是诱导的多能干细胞。
[0078]
作为专能干细胞，可以提及组织干细胞(还称为组织中的干细胞、组织特异性干细胞或体干细胞)，诸如造血干细胞、神经干细胞、视网膜干细胞、间充质干细胞等。
[0079]
可以例如，通过使用同源重组技术产生遗传上修饰的多能干细胞。染色体上要被修饰的基因的实例包括细胞标记基因、组织相容性抗原基因、与神经细胞紊乱导致的疾病相关的基因等。染色体上的靶基因可以使用以下各项中记载的方法进行修饰：manipulating the mouse embryo，a laboratory manual(操作小鼠胚胎，实验室手册)，第二版，cold spring harbor laboratory press(1994)；gene targeting，a practical approach(基因靶向，实践方法)，irl press at oxford university press(1993)；
biomanual series8，gene targeting，making of mutant mouse using es cell(基因靶向，使用es细胞产生突变体小鼠)，yodosha co.，ltd.(1995)；等等。
[0080]
具体而言，例如，分离包含要被修饰的靶基因(例如，细胞标记基因、组织相容性抗原基因、疾病相关的基因等)的基因组dna，并且使用该分离的基因组dna产生用于该靶基因同源重组的靶向载体。将所产生的靶向载体引入到干细胞中，并且选择表现出在所述靶基因与所述靶向载体之间的同源重组的细胞，由此可以产生在染色体中具有所述修饰的基因的干细胞。
[0081]
用于分离包含靶基因的基因组dna的方法的实例包括以下各项中记载的已知方法：molecular cloning，a laboratory manual(分子克隆，实验室手册)，第二版，cold spring harbor laboratory press(1989)，current protocols in molecular biology(现代分子生物学流程)，john wiley&sons(1987
‑
1997)等。包含靶基因的基因组基因也可以使用基因组dna文库筛选系统(由genome systems制造)、通用基因组步量试剂盒(universal genomewalker kits)(由clontech制造)等分离。也可以使用编码靶蛋白的多核苷酸替代基因组dna。所述多核苷酸可以通过用pcr法扩增相对应的多核苷酸而得到。
[0082]
用于靶基因同源重组的靶向载体的产生和同源重组子的有效选择可以按照以下各项中记载的方法进行：gene targeting，a practical approach(基因靶向，实践方法)，irl press at oxford university press(1993)；biomanual series 8，gene targeting，making of mutant mouse using es cell(基因靶向，使用es细胞产生突变体小鼠)，yodosha co.，ltd.(1995)；等等。作为所述靶向载体，可以使用替换类型或插入类型中的任一种。作为所述选择方法，可以使用诸如阳性选择、启动子选择、阴性选择、聚腺苷酸(polya)选择等的方法。
[0083]
用于从所选的细胞系中选择需要的同源重组子的方法的实例包括用于基因组dna的dna杂交法(southern hybridization method)、pcr法等。
[0084]
本发明中的“哺乳动物”包括啮齿类、有蹄类、食肉类、灵长类动物等。啮齿类包括小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠等。有蹄类包括猪、牛、山羊、马、绵羊等、食肉类包括狗、猫等。本发明中的“灵长类”是指属于灵长类的哺乳动物，并且灵长类包括原猴亚目(prosimian)，如狐猴(lemur)，懒猴(loris)，tupai等，和类人猿亚目(anthropoidea)，如猴，类人猿(ape)，人等。
[0085]
用于本发明的多能干细胞是人多能干细胞，更优选是人诱导的多能干细胞(ips细胞)。
[0086]
本发明中的“悬浮培养”或“悬浮培养法”是指在维持细胞或细胞聚集体悬浮在培养基中的状态的同时进行培养和进行所述培养的方法。即，悬浮培养在细胞或细胞聚集体不粘附在培养容器等上的条件下进行，并且在允许粘附到培养容器等上的条件下进行的培养(贴壁培养或贴壁培养法)不包括在悬浮培养的范畴内。在这一情形中，细胞粘附意指在细胞或细胞聚集体与培养容器之间形成强的细胞
‑
基质间接合。更具体地，悬浮培养是指在细胞或细胞聚集体与培养容器之间不形成强的细胞
‑
基质间接合的条件下的培养，并且贴壁培养是指在细胞或细胞聚集体与培养容器等之间形成强的细胞
‑
基质间接合的条件下的培养。
[0087]
在悬浮培养的细胞聚集体中，形成平面的细胞
‑
细胞粘附。在悬浮培养的细胞聚集体中，几乎不形成与培养容器等的细胞
‑
基质间接合，并且即使形成与培养容器等的细胞
‑
基质间接合，其贡献也是小的。在一些实施方案中，在聚集体内部存在内源性细胞
‑
基质间接合，但是几乎不形成与培养容器等的细胞
‑
基质间接合，即使形成与培养容器等的细胞
‑
基质间接合，其贡献也是小的。
[0088]
平面细胞
‑
细胞粘附(平面附着)意指一个细胞经由平面与另一个细胞连接。更具体地，平面细胞
‑
细胞粘附意指，例如，一个细胞不少于1％，优选不少于3％，更优选不少于5％的表面积粘附到另一个细胞的表面上。细胞的表面可以通过用对膜染色的试剂(例如，dii)染色、细胞粘附分子(例如，e
‑
钙粘蛋白和n
‑
钙粘蛋白)的免疫染色而观察到。
[0089]
进行悬浮培养时使用的细胞培养容器没有特别限制，只要其能够使得能够“悬浮培养”即可，并且本领域普通技术人员能够适当地确定此类细胞培养容器。此类细胞培养容器的实例包括烧瓶、组织培养瓶、培养平皿(平皿)、培养皿、组织培养皿、多联培养皿、微量平板、微孔平板、微孔、多联平板、多孔平板、室载玻片、碗(schale)、管、托盘、培养袋、锥形瓶(erlenmeyer flask)、旋转烧瓶、摇瓶等。为了能够允许悬浮培养，这些培养容器优选是非细胞粘附性的。可用的非细胞粘附性的培养容器包括表面没有进行改善细胞粘附性的人工处理(例如，使用诸如基膜制剂、层粘连蛋白、触觉蛋白(entactin)、胶原蛋白、明胶等的细胞外基质等进行的表面处理或用诸如聚赖氨酸、聚鸟氨酸等的聚合物进行的包被处理或正电荷处理等)以及类似处理的培养皿。作为非细胞粘附性培养容器，可以使用表面已被人工处理以减小对细胞的粘附性(例如，使用mpc聚合物等的超亲水处理、蛋白低吸附性处理等)以及类似处理的培养容器。可以使用旋转烧瓶、摇瓶等进行转管(roller)培养。培养容器的培养表面可以是平底的或可以具有凹陷和凸出。
[0090]
用于贴壁培养的培养容器没有特别限制，只要可以进行“贴壁培养”即可，并且本领域普通技术人员能够依据培养规模、培养条件和培养时间适当地选择合适的培养容器。此类培养容器的实例包括烧瓶、组织培养瓶、培养平皿(平皿)、组织培养皿、多联培养皿、微量平板、微孔平板、多联平板、多孔平板、室载玻片、碗(schale)、管、托盘、培养袋、微载体、珠子、叠板、旋转烧瓶和摇瓶。为了能够允许贴壁培养，这些培养容器优选是细胞粘附性的。细胞粘附性的培养容器包括对表面进行人工处理以改善细胞粘附性的培养容器，并且具体是表面处理的培养容器，或可以提及内部用涂层剂涂覆的培养容器。涂层剂的实例包括细胞外基质，如层粘连蛋白[包括层粘连蛋白α5β1γ1(以下为层粘连蛋白511)，层粘连蛋白α1β1γ1(以下为层粘连蛋白111)等和层粘连蛋白片段(层粘连蛋白511e8等)]，触觉蛋白，胶原蛋白，明胶，玻连蛋白，synthemax(corning incorporated)，基质胶(matrigel)等，或聚合物，诸如聚赖氨酸，聚鸟氨酸等。所述表面处理的培养容器的实例包括通过正电荷处理等进行表面处理的培养容器。
[0091]
在本发明中用于培养细胞的培养基可以由通常用于培养动物细胞的培养基作为基础培养基而制备。所述基础培养基的实例包括可以用于培养动物细胞的培养基，诸如bme培养基，bgjb培养基，cmrl1066培养基，glasgow mem(gmem)培养基，改良的mem锌选择培养基，imdm培养基，medium199培养基，eagle mem培养基，αmem培养基，dmem培养基，f
‑
12培养基，dmem/f
‑
12培养基，imdm/f12培养基，ham培养基，rpmi1640培养基，费希尔培养基(fischer’s medium)，以及它们的混合培养基等。
[0092]
本发明中的“无血清培养基”表示不含未调节的或未纯化的血清的培养基。在本发明中，含有纯化的血液来源的组分和动物组织来源的组分(例如，生长因子)的培养基也包
括在无血清培养基中，除非其中含有未调节的或未纯化的血清。
[0093]
无血清培养基可以含有血清代替物。血清代替物的实例包括适当地含有以下物质的那些：白蛋白，转铁蛋白，脂肪酸，胶原蛋白前体，痕量元素，2
‑
巯基乙醇或3’硫醇甘油，或它们的等效物等。此种血清代替物可以通过例如wo98/30679中所述的方法制备。此外，血清代替物可以是市售的产品。此种市售血清代替物的实例包括knockout
tm
血清替代品(knockout
tm serum replacement，life technologies，现为thermofisher：下文中有时也被称为ksr)，化学成分确定的脂质浓缩物(由life technologies生产)，和glutamax
tm
(由life technologies生产)，b27(由life technologies生产)，n2补充剂(由life technologies生产)。
[0094]
用于悬浮培养的无血清培养基可以适当地含有脂肪酸或脂质，氨基酸(例如，非必需氨基酸)，维生素，生长因子，细胞因子，抗氧化剂，2
‑
巯基乙醇，丙酮酸，缓冲剂，无机盐等。
[0095]
为避免复杂的制备，补充有适当量(例如，约0.5％
‑
约30％，优选约1
‑
约20％)的市售的ksr(由life technologies生产)的无血清培养基可以用作所述无血清培养基(例如，补充有10％ksr、1x化学成分确定的脂质浓缩物(cdlc)和450μm 1
‑
一硫代甘油的f
‑
12培养基和imdm培养基的1∶1混合物的培养基)。关于与ksr相当的产品，可以提及jp
‑
a
‑
2001
‑
508302中公开的培养基。
[0096]
本发明中的“含血清培养基”表示含有未调节的或未纯化的血清的培养基。所述培养基可以含有脂肪酸、脂质，氨基酸(例如，非必需氨基酸)，维生素，生长因子，细胞因子，抗氧化剂，2
‑
巯基乙醇，1
‑
一硫代甘油，丙酮酸，缓冲剂，无机盐等。例如，血清培养基可以用在维持由本发明产生的神经组织(例如，视网膜组织)的步骤中(也被称为成熟培养)。
[0097]
在本发明中，培养优选地在无外源物质(xeno
‑
free)的条件下进行。“无外源物质”意指消除源自与要培养的细胞不同的物种的成分的条件。
[0098]
在本发明中，“含有物质x的培养基”和“在存在物质x的条件下”表示补充有外源物质x的培养基或含有外源物质x的培养基，或在存在外源物质x的条件下。即，当培养基中存在的细胞或组织内源性表达、分泌或产生物质x时，内源性物质x与外源性物质x区分，并且，理解无内源性物质x的培养基落在“含有物质x的培养基”的范畴之外(甚至当其包含内源性物质x时)。
[0099]
例如，“含有sonic hedgehog信号转导途径激活物质的培养基”是补充有外源性sonic hedgehog信号转导途径激活物质的培养基或包含外源性sonic hedgehog信号转导途径激活物质的培养基。
[0100]
在本发明中，饲养细胞是指在培养干细胞时共存的除干细胞之外的细胞。用于培养多能干细胞同时保持未分化状态的饲养细胞的实例包括小鼠成纤维细胞(mef等)、人成纤维细胞、snl细胞等。关于饲养细胞，优选经历生长抑制处理的饲养细胞。生长抑制处理的实例包括用生长抑制剂(例如，丝裂霉素c)、γ辐射、uv辐照等处理。用于培养多能干细胞同时保持未分化状态的饲养细胞通过分泌激素因子(优选用于维持未分化状态的因子)或产生用于细胞粘附的构架(细胞外基底)而有助于维持多能干细胞的未分化。
[0101]
在本发明中，不存在饲养细胞(无饲养细胞)意指在不存在饲养细胞的条件下培养。不存在饲养细胞意指，例如，无饲养细胞添加的条件，或基本上无饲养细胞的条件(例
如，饲养细胞数目相对于细胞总数的比例不大于3％)。
[0102]
在本发明中，细胞的“聚集体”是指由分散在培养基中的细胞组装形成的团块，其中细胞彼此粘附。细胞团块、胚状体、球体、球状体也包含在所述细胞聚集体中。优选地，在细胞的聚集体中形成平面细胞
‑
细胞粘附。在一些实施方案中，在一些或全部的聚集体中，细胞有时形成细胞
‑
细胞接合和/或细胞粘附，例如，粘附接合。本发明中的“聚集体”特别包括：在上文提及的本发明[1]的第二步中产生的聚集体，其由在开始悬浮培养时分散的细胞形成，和在上文提及的本发明[1]的第三步中产生的聚集体，其包含由多能干细胞分化的诱导的视网膜细胞，并且所述“聚集体”还包括在上文提及的本发明[1]的第二步开始时(即，在悬浮培养开始时)已经形成的聚集体。在第二步中形成的细胞聚集体包含“胚状体(eb)”。
[0103]
在本发明中，“均匀的聚集体”意指在培养多个聚集体时，每个聚集体的尺寸一致，并且在通过最大直径的长度评价所述聚集体的尺寸时，最大直径的长度变化小。更具体地，这意味着全部聚集体群体中不少于75％的聚集体在所述聚集体群体中最大直径的平均值
±
100％、优选平均值
±
50％、更优选平均值
±
20％内。
[0104]
在本发明中，“形成均匀的细胞聚集体”意指，当汇聚细胞形成细胞聚集体并且悬浮培养所述细胞聚集体时，“迅速聚集给定数量的分散的细胞”从而形成尺寸均匀的细胞聚集体。
[0105]
分散是指通过诸如酶处理、物理处理等的分散处理将细胞或组织分成小细胞块(不少于2个细胞，并且不多于100个细胞，优选不多于50个细胞)或单个细胞。给定数量的分散的细胞是特定数量的细胞块或单个细胞的集合。
[0106]
分散多能干细胞的方法的实例包括机械分散处理、细胞分散液处理和细胞保护剂添加处理。这些处理可以联合进行。优选地，进行细胞分散处理，然后进行机械分散处理。
[0107]
关于机械分散处理的方法，可以提及吹吸处理或通过刮刀刮片操作。
[0108]
关于用于细胞分散液处理的细胞分散液，可以提及包含诸如胰蛋白酶、胶原蛋白酶、透明质酸酶、弹性蛋白酶、链霉蛋白酶、dna酶、木瓜蛋白酶等中的任一种酶和诸如乙二胺四乙酸等的螯合剂的溶液。还可以使用商购的细胞分散液，诸如tryple select(由life technologies生产)和tryple express(由life technologies生产)。
[0109]
当分散多能干细胞时，可以通过用细胞保护剂处理而抑制多能干细胞的细胞死亡。关于用于细胞保护剂处理的要使用的细胞保护剂，可以提及fgf信号转导途径激活物质、肝素、igf信号转导途径激活物质、血清和血清代替物。为了抑制由分散引起的细胞死亡(特别是人多能干细胞的细胞死亡)，可以在分散时添加rho相关卷曲螺旋激酶(rock)抑制物质或肌球蛋白抑制物质。关于rock抑制物质，可以提及y
‑
27632、法舒地尔(fasudil)(ha1077)、h
‑
1152等。关于肌球蛋白抑制物质。可以提及blebbistatin。关于优选的细胞保护剂，可以提及rock抑制物质。
[0110]
例如，用于分散多能干细胞的方法包括，例如，包括在存在rock抑制物质作为细胞保护剂的条件下，用细胞分散液(tryple select)处理多能干细胞的集落，并且通过吹吸进一步将其分散的方法。
[0111]
在本发明的制备方法中，优选地通过迅速汇集多能干细胞而形成多能干细胞聚集体。当以这样的方式形成多能干细胞聚集体时，可以以良好的重现性在由所形成的聚集体诱导和分化的细胞中形成上皮样结构。形成聚集体的实验操作的实例包括涉及使用具有小
孔的平板(例如，当以平底方式计算时，具有基底面积为约0.1
‑
2.0cm2的孔的平板)、微孔等将细胞保持在小空间内的方法，涉及通过用小离心管短时间离心而使细胞聚集的方法。关于具有小孔的平板，例如，可以提及24孔平板(当以平底方式计算时，面积约为1.88cm2)、48孔平板(当以平底方式计算时，面积约为1.0cm2)、96孔平板(当以平底方式计算时，面积约为0.35cm2，内径约为6
‑
8mm)和384孔平板。优选96孔平板。关于具有小孔的平板的形状，例如，从上方看孔时底表面的形状为多边形、长方形、椭圆形、真正的圆形，优选是真正的圆形。关于从侧孔观察孔时具有小孔的平板的形状，底表面的形状可以是平底结构或具有高外部周长和低内部凹陷的结构。底表面的形状包括，例如，u型底、v型底、m型底，优选u型底或v型底，更优选v型底。关于具有小孔的平板，也可以使用在底表面上具有凹凸或齿状(dent)的细胞培养平皿(例如，60mm
‑
150mm的平皿，培养瓶)。具有小孔的平板的底表面优选是非细胞粘附性底表面，优选前述非细胞粘附性涂覆的底表面。
[0112]
多能干细胞聚集体或包含多能干细胞的细胞群的聚集体的形成以及它们的均匀性可以基于聚集体块的尺寸和其中的细胞数目、宏观形态、通过组织染色分析的微观形态和它们的同质性等来确定。另外，可以基于聚集体的宏观形态、通过组织染色分析的微观形态及其均匀性、分化和未分化标记的表达及其均匀性、分化标记表达的控制及其同步性、聚集体之间的分化效率的重现性等确定聚集体中上皮样结构的形成及其均匀性。
[0113]
在本发明中，“组织”是指细胞群结构，其具有这样的构造，其中具有均匀的形态或性质的一种细胞，或具有不同形态和性质的多种类型的细胞在空间上以给定模式排列。
[0114]
在本发明中，“神经组织”是指由神经细胞组成的组织，包括处在发育阶段或成人阶段的大脑、中脑、小脑、脊髓、视网膜、周围神经、前脑、后脑、端脑、间脑等。神经组织有时形成具有层结构的上皮结构(神经上皮)，并且细胞聚集体中神经上皮的量可以通过使用光学显微镜的亮视野观察进行评价。
[0115]
在本发明中，“神经细胞”是指来源于外胚层的组织中除表皮谱系细胞之外的细胞。即，其包括诸如神经前体细胞、神经元(神经元细胞)、神经胶质、神经干细胞、神经元前体细胞、神经胶质前体细胞等的细胞。神经细胞还包括组成下文提及的视网膜组织(视网膜细胞)、视网膜祖先细胞、视网膜层专有的神经元、神经视网膜细胞和视网膜色素上皮细胞的细胞。神经细胞可以通过使用巢蛋白、tuj1、psa
‑
ncam、n
‑
钙粘蛋白等作为标记进行鉴定。
[0116]
神经元(或神经元细胞)是形成神经回路并且对信号转导有贡献的功能细胞，并且可以通过使用不成熟神经元标记(诸如tuj1，dcx，huc/d等)和/或成熟神经元细胞标记(诸如map2，neun等)的表达作为指标进行鉴定。
[0117]
关于神经胶质，可以提及星形胶质细胞、少突胶质细胞、m
ü
ller胶质等。关于星形胶质细胞标记，可以提及gfap；关于少突胶质细胞标记，可以提及o4，并且关于m
ü
ller胶质标记，可以提及cralbp等。
[0118]
神经干细胞是具有向神经元和胶质细胞的分化潜能(多能性)和维持多能性的增殖能力(有时称为自我更新能力)的细胞。关于神经干细胞标记，可以提及巢蛋白、sox2、musashi、hes家族、cd133等；然而，这些标记通常是关于祖先细胞/前体细胞的标记，并且不被认为是神经干细胞
‑
特异性的标记。神经干细胞的数量可以通过神经球测定、克隆测定等评估。
[0119]
神经元前体细胞是具有增殖能力的细胞，其产生神经元，并且不产生胶质细胞。关
于神经元前体细胞标记，可以提及tbr2、tα1等。备选地，不成熟的神经元标记(tuj1，dcx，huc/d)
‑
阳性的和生长标记(ki67，ph3，mcm)
‑
阳性的细胞也可以被鉴定为神经元前体细胞。
[0120]
神经胶质前体细胞是具有增殖能力的细胞，其产生神经胶质细胞，并且不产生神经元。
[0121]
神经前体细胞是前体细胞的集合，包括神经干细胞、神经元前体细胞和神经胶质前体细胞，并且具有增殖能力和神经元
‑
与神经胶质
‑
产生能力。神经前体细胞可以用巢蛋白、glast、sox2、sox1、musashi、pax6等作为标记鉴定。备选地，神经细胞标记
‑
阳性的和生长标记(ki67，ph3，mcm)
‑
阳性的细胞也可以被鉴定为神经前体细胞。
[0122]
在本发明中，“视网膜组织”意指这样的组织，其中在体内组成各个视网膜层的一种类型的或至少两种或更多种类型的细胞在空间上按层排列，所述细胞诸如感光细胞、感光前体细胞、视杆感光细胞、视锥感光细胞、中间神经元、水平细胞、双极细胞、无长突细胞、视网膜神经节细胞(神经节细胞)、视网膜色素上皮细胞(rpe)、睫状边缘区细胞、它们的祖先/前体细胞以及视网膜祖先细胞等。由每个细胞组成的视网膜层可以通过已知的方法，例如，通过细胞标记表达的存在或不存在或其水平等验证。
[0123]
本发明中的“视网膜层”表示构成视网膜的每个层。其具体实例包括视网膜色素上皮层，光感受器层，外界膜，外核层，外网织层，内核层，内网织层，神经节细胞层，神经纤维层和内界膜。
[0124]
本发明中的“视网膜祖先细胞”是指能够分化成任何成熟的视网膜细胞(包括感光细胞，水平细胞，双极细胞，无长突细胞，视网膜神经节细胞和视网膜色素上皮细胞等)的祖先细胞。
[0125]
在本发明中，“神经视网膜祖先细胞”是指能够分化成多种成熟的视网膜细胞(包括感光细胞，水平细胞，双极细胞，无长突细胞，视网膜神经节细胞等)中的任一种的祖先细胞。通常，神经视网膜祖先细胞不分化成视网膜色素上皮细胞。
[0126]
感光前体细胞、水平细胞前体细胞、双极细胞前体细胞、无长突细胞前体细胞、视网膜神经节细胞前体细胞和视网膜色素上皮前体细胞分别是指确定分化成感光细胞、水平细胞、双极细胞、无长突细胞、视网膜神经节细胞和视网膜色素上皮细胞的前体细胞。
[0127]
在本发明中，“视网膜层专有的神经元”是构成视网膜层的细胞并且为视网膜层所专有的神经元细胞(神经元)。视网膜层专有的神经元的实例包括双极细胞，视网膜神经节细胞，无长突细胞，水平细胞，感光细胞，视网膜色素上皮细胞，视杆细胞和视锥细胞。
[0128]
本发明中的“视网膜细胞”包括前述视网膜祖先细胞和视网膜层专有的神经元。
[0129]
视网膜细胞标记的实例包括在视网膜祖先细胞中表达的rx(还称作rax)、pax6和chx10，在下丘脑神经元的前体细胞中表达而在视网膜祖先细胞中不表达的nkx2.1，在下丘脑神经上皮中表达而在视网膜中不表达的sox1，在感光细胞的前体细胞中表达的crx、blimp1等，等等。视网膜层专有的神经元的标记的实例包括在双极细胞中表达的chx10、pkcα和l7，在视网膜神经节细胞中表达的tuji和brn3，在无长突细胞表达中的钙视网膜蛋白，在水平细胞表达中的钙结合蛋白，在成熟的感光细胞中表达的视紫质(rhodopsin)和恢复蛋白，在视杆细胞中表达的nrl和视紫质，在视锥细胞中表达的rxr
‑
γ和s
‑
视蛋白，在视网膜色素上皮细胞中表达的rpe65和miff，在睫状边缘区中表达的rdhl0和ssea1等。
[0130]
2.制备视网膜细胞或视网膜组织的方法
[0131]
本发明的制备方法是用于制备视网膜细胞或视网膜组织的方法，所述方法包括下述步骤(1)
‑
(3)：
[0132]
(1)第一步，在不存在饲养细胞的条件下在含有用于维持未分化状态的因子的培养基中培养人多能干细胞，
[0133]
(2)第二步，在存在sonic hedgehog信号转导途径激活物质的条件下悬浮培养第一步中得到的多能干细胞，从而形成细胞聚集体，和
[0134]
(3)第三步，在存在或不存在分化诱导因子的条件下悬浮培养第二步中得到的聚集体，从而得到包含视网膜细胞或视网膜组织的聚集体。
[0135]
在步骤(1)中，在不存在饲养细胞的条件下在含有用于维持未分化状态的因子的培养基中培养人多能干细胞。
[0136]
关于步骤(1)中的人多能干细胞，可以提及人诱导的多能干细胞。
[0137]
诱导的多能干细胞的制备方法没有特别限制，并且其可以通过本领域普通技术人员公知的方法产生，如上文提及的。在无饲养细胞的条件下进行制备诱导的多能干细胞的步骤(即，使体细胞重新编程建立多能干细胞的步骤)也是合乎需要的。
[0138]
尽管胚胎干细胞(es细胞)的制备方法没有特别限制，并且可以通过本领域普通技术人员公知的方法制备，如上文提及的，在无饲养细胞的条件下制备胚胎干细胞(es细胞)的步骤也是合乎需要的。
[0139]
用于得到步骤(1)中所用的多能干细胞的维持培养或扩增培养可以通过本领域普通技术人员公知的方法进行，如上文提及的。尽管上文提及的多能干细胞的维持培养和扩增培养可以通过贴壁培养或悬浮培养进行，但是其优选地通过贴壁培养进行。尽管上文提及的多能干细胞的维持培养和扩增培养可以在存在饲养细胞的条件下或在无饲养细胞的条件下进行，但是其优选在无饲养细胞的条件下进行。
[0140]
在步骤(1)中不存在饲养细胞(无饲养细胞)意指基本上没有饲养细胞的条件(例如，饲养细胞数目相对于细胞总数的比例不大于3％)。优选地，步骤(1)在无饲养细胞的条件下进行。
[0141]
用于步骤(1)的培养基没有特别限制，只要其是能够允许在无饲养细胞条件下培养多能干细胞培养以维持未分化状态的培养基(无饲养细胞培养基)即可。优选地，为了允许培养以维持未分化状态的培养，其包含用于维持未分化状态的因子。例如，其是包含用于维持未分化状态的因子并且不含tgfβ家族信号转导途径抑制物质和sonic hedgehog信号转导途径激活物质的培养基。
[0142]
用于维持未分化状态的因子没有特别限制，只要其是具有抑制多能干细胞分化的作用的物质即可。在致敏的(primed)多能干细胞(例如，人es细胞，人ips细胞)的情形中，本领域普通技术人员广泛应用的用于维持未分化状态的因子的实例包括fgf信号转导途径激活物质、tgfβ家族信号转导途径激活物质、胰岛素等。关于fgf信号转导途径激活物质，可以特别提及成纤维细胞生长因子(例如，bfgf，fgf4，fgf8)。关于tgfβ家族信号转导途径激活物质，可以提及tgfβ信号转导途径激活物质，nodal/激活蛋白信号转导途径激活物质。关于tgfβ信号转导途径激活物质，可以提及tgfβ1、tgfβ2。关于nodal/激活蛋白信号转导途径激活物质，可以提及nodal、激活蛋白a、激活蛋白b。当培养人多能干细胞(人es细胞，人ips细胞)时，步骤(1)的培养基优选包含bfgf作为用于维持未分化状态的因子。
incorporated)，基质胶(matrigel)等，或聚合物，诸如聚赖氨酸，聚鸟氨酸等，以及类似的物质。还可以使用表面经过正电荷处理等处理的培养容器。优选的是层粘连蛋白，更优选的是层粘连蛋白511e
‑
8。层粘连蛋白511e
‑
8可以是商购产品(例如，imatrix
‑
511，nippi)。
[0148]
尽管用于步骤(1)的培养基可以是含血清培养基或无血清培养基，但是优选是无血清培养基，以避免化学上不确定的成分的污染。
[0149]
为了避免化学上不确定的成分的污染，用于步骤(1)的培养基可以是成分为化学上确定的培养基。
[0150]
在步骤(1)中，多能干细胞可以在悬浮培养和贴壁培养的任一条件下培养，优选进行贴壁培养。
[0151]
对于步骤(1)中在无饲养细胞的条件下培养多能干细胞，可以使用前文提及的无饲养细胞培养基作为培养基。
[0152]
对于步骤(1)中在无饲养细胞的条件下培养多能干细胞，可以使用适当的基质作为构架，用于给多能干细胞提供替代饲养细胞的构架。多能干细胞在表面用作为构架的基质涂覆的细胞容器中进行贴壁培养。
[0153]
关于可以用作构架的基质，可以提及层粘连蛋白(nat biotechnol 28，611
‑
615(2010))，层粘连蛋白片段(nat commun 3，1236(2012))，基膜制剂(nat biotechnol 19，971
‑
974(2001))，明胶，胶原蛋白，硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，触觉蛋白，玻连蛋白等。
[0154]“层粘连蛋白”是由α、β、γ链组成的异三聚体分子，并且是包含具有不同亚基链组成的异构体的细胞外基质蛋白。具体地，基于具有5种α链、4种β链和3种γ链的异三聚体组合，层粘连蛋白具有约15种异构体。层粘连蛋白的名称通过组合α链(α1
‑
α5)、β链(β1
‑
β4)和γ链(γ1
‑
γ4)各自的数目而确定。例如，具有α5链、β1链、γ1链的组合的层粘连蛋白称为层粘连蛋白511。在本发明中，优选使用层粘连蛋白511(nat biotechnol 28，611
‑
615(2010))。
[0155]
用于本发明的层粘连蛋白通常是哺乳动物层粘连蛋白。关于哺乳动物，可以提及上文提及的那些。为了获得无外源物质(xeno
‑
free)的条件，优选使用与要培养的细胞是相同物种的哺乳动物的层粘连蛋白。例如，使用人层粘连蛋白(优选地，人层粘连蛋白511)培养人多能干细胞。
[0156]
本发明中使用的层粘连蛋白片段没有特别限制，只要其具有与多能干细胞的粘附性并且允许在无饲养细胞的条件下维持培养多能干细胞即可，并且其优选是e8片段。在通过用弹性蛋白酶消化层粘连蛋白511得到的多个片段中，层粘连蛋白e8片段被鉴定为具有强细胞粘附活性的片段(embo j.，3：1463
‑
1468，1984，j.cell biol.，105∶589
‑
598，1987)。在本发明中，优选使用层粘连蛋白511的e8片段(nat commun 3，1236(2012)，scientific reports 4，3549(2014))。用于本发明的层粘连蛋白e8片段不需要是层粘连蛋白的弹性蛋白酶消化产物，并且可以是重组的。为了避免不确定成分的污染，在本发明中优选使用重组的层粘连蛋白片段。层粘连蛋白511的e8片段可商购获得，并且，例如，可以从nippi，inc.等购买。
[0157]
用于本发明的层粘连蛋白或层粘连蛋白片段优选是分离的。
[0158]
本发明中的“基膜制剂”是指这样的制剂，即，当将能够形成基膜的目的细胞涂布在其上并培养时，包含具有与上皮细胞的那些功能类似的控制细胞形态、分化、生长、移动
性、功能表达等的功能的基膜组成成分的制剂。例如，当进行进一步的贴壁培养时，通过本发明制备的神经细胞和神经组织可以分散并在存在基膜制剂的条件下培养。此处，“基膜组成成分”是指在动物组织中的上皮细胞层与间质细胞层等之间存在的薄膜形式的胞外基质分子。例如，基膜制剂可以通过用能够溶解细胞的脂质的溶液、碱溶液等从支持物上去除能够形成基膜的细胞而产生，所述细胞通过基膜粘附在所述支持物上。基膜制剂的实例包括可作为基膜制剂商购获得的产品(例如，matrigel
tm
(由corning incorporated制造：以下有时称为基质胶(matrigel)))，geltrex
tm
(由life technologies制造)，和已知为基膜成分的细胞外基质(例如，层粘连蛋白，iv型胶原蛋白，硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，触觉蛋白等)。
[0159]
matrigel
tm
是从engelbreth holn swarn (ehs)小鼠肉瘤提取的基膜制剂。matrigel
tm
的主要成分是iv型胶原蛋白、层粘连蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖和触觉蛋白。除了这些之外，包含tgf
‑
β、fgf、组织纤溶酶原激活物和由ehs肿瘤天然产生的生长因子。matrigel
tm
的“生长因子减少的产品”具有比常规matrigel
tm
低的生长因子浓度，并且其标准浓度为：＜0.5ng/ml的egf，＜0.2ng/ml的ngf，＜5pg/ml的pdgf，5ng/ml的igfl，和1.7ng/ml的tgfβ。
[0160]
为了避免不确定的成分的污染，在本发明中优选使用分离的层粘连蛋白或层粘连蛋白片段。
[0161]
优选地，在步骤(1)中在无饲养细胞的条件下培养多能干细胞时，将人多能干细胞在表面用分离的层粘连蛋白511或层粘连蛋白511的e8片段(更优选地，层粘连蛋白511的e8片段)涂覆的细胞容器中以粘附状态培养。
[0162]
尽管步骤(1)中培养多能干细胞的时间期没有特别限制，只要可以实现提高步骤(2)中形成的聚集体的质量的效果即可，其通常为0.5
‑
144小时，优选2
‑
96小时，更优选6
‑
48小时，进一步优选12
‑
48小时，进一步更优选18
‑
28小时(例如，24小时)。即，第一步在步骤(2)开始前0.5
‑
144小时(优选18
‑
28小时)开始，并且步骤(2)在步骤(1)结束时继续进行。
[0163]
在步骤(1)中，可以酌情更换培养基，并且一个实施方案具体包括涉及每1
‑
2天更换培养基的方法。此处，例如，培养基可以更换为不含下述细胞保护剂或抑制细胞死亡的试剂(如rock抑制剂等)的培养基。
[0164]
可以适当地确定步骤(1)中的培养条件，如培养温度和co2浓度。例如，尽管培养温度为约30℃
‑
约40℃，但是优选约37℃。例如，co2浓度为约1％
‑
约10％，优选约5％。
[0165]
在一个优选的实施方案中，在不存在饲养细胞的条件下，和在包含bfgf的无血清培养基中，以粘附状态培养人多能干细胞(例如，人ips细胞)。优选地，在表面用层粘连蛋白511、层粘连蛋白511的e8片段或玻连蛋白涂覆的细胞容器中进行贴壁培养。贴壁培养优选地使用essential8、tesr培养基、mtesr培养基、mtesr
‑
e8培养基或stemfit培养基、更优选essential 8或stemfit培养基作为无饲养细胞的培养基进行。
[0166]
在一个优选的实施方案中，在不存在饲养细胞的条件下，和在包含bfgf的无血清培养基中，悬浮培养人多能干细胞(例如，人ips细胞)。在悬浮培养中，人多能干细胞可以形成人多能干细胞聚集体。
[0167]
解释步骤(2)，其中步骤(1)得到的多能干细胞在存在sonic hedgehog信号转导途径激活物质的条件下悬浮培养，从而形成多能干细胞的细胞聚集体。
[0168]
用于步骤(2)的培养基没有特别限制，只要其在上文提及的定义部分有记载即可。
用于步骤(2)的培养基可以是含血清培养基或无血清培养基。为了避免化学上不确定成分的污染，在本发明中优选使用无血清培养基。例如，可以使用无wnt信号转导途径抑制物质的无血清培养基。例如，为了避免复杂的制备，优选使用补充了适量的商购血清代替物(如ksr等)的无血清培养基(例如，补充了10％ksr、450μm 1
‑
一硫代甘油和1x化学成分确定的脂质浓缩物的imdm与f
‑
12的1∶1混合物的培养基，或补充了5％
‑
20％ksr、neaa、丙酮酸、2巯基乙醇的gmem培养基)。在人es细胞的情形中，要添加到无血清培养基中的ksr的量通常为约1％至约30％，优选约2％至约20％。
[0169]
关于聚集体的形成，首先进行步骤(1)得到的多能干细胞的分散操作。通过分散操作得到的“分散的细胞”是指其中例如不少于70％的细胞是单细胞并且不多于30％的细胞是2
‑
50个细胞的团块的状态。优选地，关于分散的细胞，可以提及其中不少于80％的细胞是单细胞并且不多于20％的细胞是2
‑
50个细胞的团块的状态。分散的细胞是指几乎没有细胞的相互粘附(例如，平面附着)的状态。在该实施方案的一部分中，分散的细胞是指几乎不含细胞
‑
细胞接合(例如，粘附连接)的状态。
[0170]
步骤(1)得到的多能干细胞的分散操作可以包含上文提及的机械分散处理、细胞分散液处理和细胞保护剂添加处理。这些处理可以联合进行。优选地，细胞分散液处理与细胞保护剂添加处理同时进行，然后进行机械分散处理。
[0171]
关于用于细胞保护剂添加处理的细胞保护剂，可以提及fgf信号转导途径激活物质，肝素，igf信号转导途径激活物质，血清，和血清代替物。此外，为了抑制由分散诱导的多能干细胞的细胞死亡(特别地，人多能干细胞的细胞死亡)并且保护细胞，可以添加rho相关卷曲螺旋激酶(rock)抑制剂或肌球蛋白抑制剂。为了抑制由分散诱导的多能干细胞(特别是人多能干细胞)的细胞死亡，可以在第二步培养开始时添加rho相关卷曲螺旋激酶(rock)抑制物质或肌球蛋白抑制剂。关于rock抑制物质，可以提及y
‑
27632、fasudil(ha1077)、h
‑
1152等。关于肌球蛋白抑制剂，可以提及blebbistatin。
[0172]
关于用于细胞分散处理的细胞分散液，可以提及包含诸如胰蛋白酶、胶原蛋白酶、透明质酸酶、弹性蛋白酶、链霉蛋白酶、dna酶、木瓜蛋白酶等中的任一种酶和诸如乙二胺四乙酸等的螯合剂的溶液。也可以使用商购的细胞分散液，诸如tryple select(由life technologies制造)和tryple express(由life technologies制造)。
[0173]
关于机械分散处理方法，可以提及吹吸处理或刮刀的刮擦。
[0174]
将分散的细胞悬浮在上文提及的培养基中。
[0175]
然后，将分散的多能干细胞的混悬液接种在上文提及的培养容器中，将分散的多能干细胞在不与所述培养容器粘附的条件下培养，由此多个细胞聚集在一起形成聚集体。
[0176]
在这种情形中，可以通过将分散的多能干细胞接种在比较大的培养容器中，如10cm平皿中，在一个培养容器中同时形成多个细胞聚集体。然而，在这种情形中，聚集体的尺寸不同。因此，例如，将给定量的分散的多能干细胞放置在多孔平板(u型底、v型底)(如96孔微量平板)的每个孔中，并且进行静置培养，由此在每个孔中细胞快速凝聚形成一个聚集体。从多个孔中回收聚集体，由此可以得到均匀的聚集体群。
[0177]
步骤(2)中多能干细胞的浓度可以适当地设置，从而更均匀有效地形成细胞聚集体。例如，当使用96孔微孔平板悬浮培养人细胞(例如，步骤(1)中得到的人ips细胞)时，向孔中添加制备得到每孔约1x103至约1x105个细胞、优选约3x103至约5x104个细胞、更优选约
4x103至约2x104个细胞、进一步优选约4x103至约1.6x104个细胞、进一步更优选约8x103至约1.2x104个细胞的液体，并且将平板静置以形成聚集体。
[0178]
可以适当地确定步骤(2)的培养条件，诸如培养温度、co2浓度等。例如，培养温度为约30℃至约40℃，优选约37℃。例如，co2浓度为约1％至约10％，优选约5％。
[0179]
在步骤(2)中，当进行培养基更换操作时，例如，可以提及不丢弃已有的培养基添加新鲜培养基的操作(培养基添加操作)，弃掉约一半量的已有的培养基(已有的培养基体积的约30
‑
90％，例如，40
‑
60％)并且添加约一半量的新鲜培养基(已有的培养基体积的约30
‑
90％，例如，约40
‑
60％)的操作(一半培养基更换操作)，和弃掉约全部量的已有的培养基(不少于已有的培养基的量的90％)并且添加约全部量的新鲜培养基(不少于已有的培养基的量的90％)的操作(完全培养基更换操作)。
[0180]
当在特定时间点添加特定成分(例如，分化诱导因子)时，例如，可以进行这样的操作：计算终浓度，弃掉约一半量的已有的培养基，并且添加约一半量的新鲜培养基(一半培养基更换操作)，所述新鲜培养基包含浓度高于所述终浓度(具体地，所述终浓度的1.5倍
‑
3.0倍，例如，约为终浓度的2倍)的特定成分。
[0181]
当在特定时间点保持已有的培养基中包含的特定成分的浓度时，例如，可以进行这样的操作：弃掉约一半量的已有的培养基，并且添加约一半量的新鲜培养基，所述新鲜培养基包含浓度与已有的培养基中相同的特定成分。
[0182]
当通过在特定时间点稀释而降低已有的培养基中包含的成分的浓度时，例如，可以每天多次进行培养基更换操作，优选在1小时内进行多次(例如，2
‑
3次)。此外，当通过在特定时间点的稀释降低已有的培养基中包含的成分的浓度时，可以将细胞或聚集体转移到另一个培养容器中。
[0183]
尽管用于培养基更换操作的工具没有特别限制，例如，可以提及移液管、微量移液管(pipetman)、多通道微量移液管(multichannel pipetman)、连续的分配器等。例如，当使用96孔平板作为培养容器时，可以使用多通道微量移液管(multichannel pipetman)。
[0184]
形成细胞聚集体所需要的悬浮培养的时间期可以依据要用的多能干细胞适当地确定，以使细胞可以均匀地聚集。为了形成均匀的细胞聚集体，理想地是其尽可能短。用于分散的细胞以形成细胞聚集体的步骤可以分成聚集细胞的步骤和由所聚集的细胞形成细胞聚集体的步骤。在人多能干细胞(例如，人ips细胞)的情形中，在接种分散的细胞(即，在悬浮培养开始时)以使细胞聚集的步骤中，优选地在约24小时内，更优选在约12小时内，形成聚集的细胞。在人多能干细胞(例如，人ips细胞)的情形中，从接种分散的细胞的时间点(即，在悬浮培养开始的时间)到形成聚集体的时间期，例如，优选在约72小时内，更优选在约48小时内形成聚集体。细胞聚集体形成的时间期可以通过控制使细胞聚集的工具、离心条件等而适当地调节。
[0185]
可以基于聚集体的尺寸和细胞数目、宏观形态、组织染色分析的微观形态和其均匀性、分化
‑
和未分化
‑
标记的表达及其均匀性、分化标记表达的控制及其同步性、聚集体之间的分化效率的重现性等，确定细胞聚集体的形成及其均匀性。
[0186]
在聚集体形成后，聚集体可以按原样继续培养。步骤(2)中悬浮培养的时间期通常为约12小时
‑
6天，优选约12小时
‑
48小时。
[0187]
用于步骤(2)的培养基包含sonic hedgehog信号转导途径激活物质。在步骤(1)
hedgehog信号转导途径激活物质的处理形成的聚集体相比，步骤(2)中得到的聚集体具有更高的质量。具体而言，可以得到具有高比例的球形细胞聚集体的聚集体群，所述球形细胞聚集体具有平滑的表面、致密的内部、和未塌陷的形状。在一个实施方案中，当自第二步开始起第6天随机选择聚集体(例如，不少于100个聚集体)时，例如，未塌陷的聚集体和/或非囊性聚集体的比例总数不小于30％，优选不小于50％。
[0194]
步骤(2)中得到的聚集体具有向多种分化细胞和分化组织分化的潜能。在一个实施方案中，步骤(2)中得到的聚集体具有向神经细胞(例如，视网膜细胞)或神经组织(例如，视网膜组织)分化的潜能。在一个实施方案中，通过使用步骤(1)中得到的并且在步骤(2)中具有向至少神经细胞或神经组织(优选地，视网膜组织，视网膜祖先细胞，或视网膜层专有的神经元)分化的潜能的干细胞(优选地，具有向至少神经细胞或神经组织(优选地，视网膜组织，视网膜祖先细胞，或视网膜层专有的神经元)分化的潜能的oct3/4阳性的干细胞)，可以得到包含具有向至少神经细胞或神经组织(优选地，视网膜组织，视网膜祖先细胞，或视网膜层专有的神经元)分化的潜能的干细胞(例如，oct3/4阳性的干细胞)的聚集体。通过在适当的分化条件下培养步骤(2)中得到的聚集体，可以高效地诱导多种分化的细胞和分化的组织(例如，神经细胞，诸如视网膜细胞等，神经组织，诸如视网膜组织等)。
[0195]
在一个实施方案中，在步骤(2)中得到的聚集体包含与在步骤(1)中得到的多能干细胞与神经细胞或神经组织(优选地，视网膜细胞或视网膜组织)之间的中间阶段的细胞相对应的细胞。这些细胞表达多能性状态标记oct3/4、外胚层标记(sox1，sox2，n
‑
钙粘蛋白，tp63)、神经外胚层标记(sox1，sox2，巢蛋白，n
‑
钙粘蛋白，otx2)和前文提及的神经细胞标记中的任一种。即，在一个实施方案中，在步骤(2)中得到的聚集体包含表达多能性状态标记oct3/4、外胚层标记(sox1，sox2，n
‑
钙粘蛋白，tp63)、神经外胚层标记(sox1，sox2，巢蛋白，n
‑
钙粘蛋白，otx2)和前文提及的神经细胞标记中的任一种的细胞的混合物。即，在步骤(2)中得到的聚集体包含具有向至少神经细胞或神经组织(优选地，视网膜细胞或视网膜组织)分化的潜能的干细胞，和/或神经细胞或神经组织(优选地，视网膜细胞或视网膜组织)的祖先/前体细胞。另外，所述祖先/前体细胞特征在于，当将它们在已知的适当培养条件下培养时，它们表现出表达前文提及的神经细胞标记(优选地，视网膜细胞标记)的能力(competence)。因此，在一个实施方案中，在步骤(2)中得到的聚集体包含具有向至少神经细胞或神经组织(优选地，视网膜细胞或视网膜组织)分化的潜能的oct3/4阳性干细胞，和/或神经细胞或神经组织(优选地，视网膜细胞或视网膜组织)的祖先/前体细胞。在步骤(2)中得到的聚集体中包含的一部分细胞可以表达前文提及的神经组织标记。在一个实施方案中，在步骤(2)中得到的聚集体可以包含不少于总细胞的50％(例如，不少于70％)的比例的oct3/4阳性细胞。
[0196]
在步骤(2)中，当进行培养基更换操作时，例如，可以提及不丢弃已有的培养基添加新鲜培养基的操作(培养基添加操作)，弃掉约一半量的已有的培养基(已有的培养基体积的约30
‑
90％，例如，约40
‑
60％)并且添加约一半量的新鲜培养基(已有的培养基体积的约30
‑
90％，例如，约40
‑
60％)的操作(一半培养基更换操作)，和弃掉约全部量的已有的培养基(不少于已有的培养基的量的90％)并且添加约全部量的新鲜培养基(不少于已有的培养基的量的90％)的操作(完全培养基更换操作)。
[0197]
当在特定时间点添加特定成分(例如，分化诱导因子)时，例如，可以进行这样的操
作：计算终浓度，弃掉约一半量的已有的培养基，并且添加约一半量的新鲜培养基(一半培养基更换操作)，所述新鲜培养基包含浓度高于所述终浓度(具体地，所述终浓度的1.5
‑
3.0倍，例如，约为终浓度的2倍)的特定成分。
[0198]
当在特定时间点保持已有的培养基中包含的特定成分的浓度时，例如，可以进行这样的操作：弃掉约一半量的已有的培养基，并且添加约一半量的新鲜培养基，所述新鲜培养基包含浓度与已有的培养基中相同的特定成分。
[0199]
当通过在特定时间点的稀释而降低已有的培养基中包含的成分的浓度时，例如，可以每天多次进行培养基更换操作，优选在1小时内进行多次(例如，2
‑
3次)。此外，当通过在特定时间点的稀释降低已有的培养基中包含的成分的浓度时，可以将细胞或聚集体转移到另一个培养容器中。
[0200]
尽管用于培养基更换操作的工具没有特别限制，例如，可以提及移液管、微量移液管(pipetman)、多通道微量移液管(multichannel pipetman)、连续的分配器等。例如，当使用96孔平板作为培养容器时，可以使用多通道微量移液管(multichannel pipetman)。
[0201]
解释步骤(3)，其中由步骤(2)中得到的聚集体诱导包含视网膜细胞或视网膜组织的聚集体。
[0202]
将步骤(2)中得到的聚集体在存在或不存在(优选在存在)适当的分化诱导因子的条件下悬浮培养，由此可以得到包含视网膜细胞或视网膜组织的聚集体。
[0203]
关于通过悬浮培养诱导细胞聚集体成为视网膜细胞或视网膜组织的方法，已经报道了多种方法。例如，已知在nature，472，51
‑
56(2011)，cell stem cell，10(6)，771
‑
775(2012)等中记载的方法，但是所述方法不限于这些。
[0204]
关于在不存在分化诱导因子的条件下制备视网膜细胞或视网膜组织的方法，可以提供及这样的方法，其包括在含血清的培养基或无血清培养基中诱导步骤(2)中得到的聚集体自发分化为包括视网膜细胞的神经细胞。关于前文提及的含血清培养基或无血清培养基，可以提及不含用于维持未分化状态的因子的血清培养基或无血清培养基。在向神经细胞的分化过程中产生的视网膜细胞可以进行选择和分离。对于选择和分离，可以使用facs或macs。另外，也可以使用容易产生视网膜的多能干细胞作为步骤(1)中的起始材料。
[0205]
优选地，将步骤(2)中得到的聚集体在存在分化诱导因子的条件下进行悬浮培养，从而产生包含视网膜细胞或视网膜组织的聚集体。
[0206]
此处所用的分化诱导因子没有特别限制，只要其是具有诱导向视网膜细胞或视网膜组织分化的能力的因子即可。其实例包括bmp信号转导激活物质，基膜制剂，wnt信号转导途径抑制物质，tgfβ家族信号转导途径抑制物质等。对分化诱导因子的反应随细胞的种类和分化状态(能力或潜能)而不同，并且分化诱导因子的作用甚至在分化诱导过程中可能改变，这取决于分化诱导因子的浓度和加入的时机。此外，已知分化诱导因子表现出相似效果的最佳浓度随动物物种而不同，并且，例如，已知在小鼠细胞与人细胞之间，人细胞的最佳浓度通常较高(特别是在外胚层、内胚层中)。关于多能干细胞向特定细胞或组织的分化诱导的方法存在多个报道，并且可以选择适于目的细胞或组织的分化诱导因子或分化诱导方法。
[0207]
优选地，使用bmp信号转导途径激活物质作为分化诱导因子。即，将步骤(2)中得到的聚集体在存在bmp信号转导途径激活物质的条件下悬浮培养，以产生包含视网膜细胞或
视网膜组织的聚集体。
[0208]
bmp信号转导途径激活物质是能够增强由bmp介导的信号转导的物质。bmp信号转导途径激活物质的实例包括bmp蛋白如bmp2，bmp4或bmp7等，gdf蛋白如gdf7等，抗
‑
bmp受体抗体，bmp部分肽等。bmp2蛋白，bmp4蛋白和bmp7蛋白可获自，例如，r&d systems，而gdf7蛋白可获自，例如，wako pure chemical industries，ltd。所述bmp信号转导途径激活物质优选是bmp4。
[0209]
用于本发明的分化诱导因子(例如，bmp4)通常是哺乳动物分化诱导因子。哺乳动物的实例包括上文提及的那些。由于分化诱导因子可能在哺乳动物物种之间具有交叉反应性，也可以使用任意哺乳动物的分化诱导因子，只要可以实现培养的多能干细胞的分化诱导即可。优选地，使用与培养的细胞相同物种的哺乳动物分化诱导因子。例如，当诱导人多能干细胞向视网膜组织或视网膜细胞分化时，优选使用人分化诱导因子(例如，bmp4)。
[0210]
用于本发明的分化诱导因子(例如，bmp4)优选是分离的。因此，在一个实施方案中，本发明包括提供分离的分化诱导因子(例如，bmp4)的步骤。并且，在一个实施方案中，本发明包括向用于步骤(3)的培养基中外源添加分离的分化诱导因子(例如，bmp4)的步骤。
[0211]
在一个实施方案中，用于步骤(3)的培养基是补充了分化诱导因子(例如，bmp4)的无血清培养基或含血清培养基(优选无血清培养基)。所述培养基可以包含或可以不包含基膜制剂。关于基膜制剂，可以使用上文提及的那些。当添加基膜制剂时，其浓度例如为使用基质胶时的体积浓度的0.1
‑
10％，更优选为0.5％
‑
2％。为避免化学上不确定物质的污染，不添加基膜制剂。
[0212]
用于所述培养基的无血清培养基或含血清培养基没有特别限制，只要其是上文提及的即可。为了避免复杂的制备，例如，优选使用补充了适量的商购血清代替物(如ksr等)的无血清培养基(例如，补充了10％ksr、450μm 1
‑
一硫代甘油和1x化学成分确定的脂质浓缩物的imdm与f
‑
12的1∶1混合物的培养基或补充了5％
‑
20％ksr、neaa、丙酮酸、2巯基乙醇的gmem培养基)。在人es细胞的情形中，要添加到无血清培养基中的ksr的量通常为约1％至约20％，优选约2％至约20％。
[0213]
关于要用于步骤(3)的培养基(优选是无血清培养基)，可以直接使用步骤(2)所用的培养基(优选是无血清培养基)或可以用新鲜培养基(优选是无血清培养基)替换。当步骤(2)中所用的不含分化诱导因子(例如，bmp4)的无血清培养基直接用于步骤(3)时，可以向所述培养基中添加分化诱导因子(例如，bmp4)。
[0214]
在一个实施方案中，当添加到步骤(2)的培养基中的shh信号转导途径激活物质的浓度比较低(例如，对于sag，不大于700nm，并且对于其他shh信号转导途径激活物质，以赋予与上文提及的浓度的sag相当或比其更低的shh信号转导促进活性的浓度)时，培养基更换不是必要的，并且可以向步骤(2)中所用的培养基中添加分化诱导因子(例如，bmp4)。另一方面，当shh信号转导途径激活物质的浓度比较高(例如，对于sag，超过700nm或不小于1000nm，并且对于其他shh信号转导途径激活物质，以赋予与上文提及的浓度的sag相当的shh信号转导促进活性的浓度)时，需要将培养基更换为含有分化诱导因子(例如，bmp4)的新鲜培养基，以抑制在加入分化诱导因子时残留的shh信号转导途径激活物质的影响。
[0215]
在优选的实施方案中，当相对于sag的shh信号转导促进活性计算时，在用于步骤(3)的培养基中的shh信号转导途径激活物质的浓度不大于700nm，优选不大于300nm，更优
选不大于10nm，进一步优选不大于0.1nm，进一步优选不含shh信号转导途径激活物质。“不含shh信号转导途径激活物质”的培养基还包括基本上不含shh信号转导途径激活物质的培养基，例如，不含处在对向视网膜细胞或视网膜组织的选择性分化施加不利影响的浓度的shh信号转导途径激活物质的培养基。“不含shh信号转导途径激活物质”的培养基还包括基本上没有补充shh信号转导途径激活物质的培养基，例如，没有补充处在对向视网膜细胞或视网膜组织的选择性分化施加不利影响的浓度的shh信号转导途径激活物质的培养基。
[0216]
培养基中分化诱导因子(例如，bmp信号转导途径激活物质)的浓度可以是可以诱导多能干细胞或由其衍生的细胞的聚集体向视网膜细胞分化的浓度。例如，在人bmp4的情形中，将其以约0.01nm至约1μm，优选约0.1nm至约100nm，更优选约1nm至约10nm，进一步优选约1.5nm(55ng/ml)的浓度添加到培养基中。当使用不同于bmp4的bmp信号转导途径激活物质时，其理想地以施加与上文提及的浓度的bmp4相当的bmp信号转导促进活性的浓度使用。
[0217]
培养基中分化诱导因子(例如，bmp4)的浓度在步骤(3)期间可以变化。例如，在步骤(3)开始时提供分化诱导因子(例如，bmp4)落在上文提及的范围内，并且浓度以每2
‑
4天40
‑
60％的比例逐渐或逐步地降低。
[0218]
分化诱导因子(例如，bmp4)可以在自步骤(2)的悬浮培养起始时约24小时或以后加入，并且也可以在自悬浮培养起始时数天内(例如，15天内)加入到培养基中。优选地，分化诱导因子(例如，bmp4)在自悬浮培养起始第1天至第15天内、更优选第1天至第9天内、更优选第3天至第8天内、仍然更优选地第3天至第6天内加入到培养基中。
[0219]
向培养基中加入分化诱导因子(例如，bmp4)并且开始将聚集体向视网膜细胞的诱导分化后，向所述培养基中加入分化诱导因子(例如，bmp4)不是必需的，并且培养基可以更换为分别不含分化诱导因子(例如，bmp4)的无血清培养基或含血清培养基。在一个实施方案中，在开始将聚集体向神经细胞的分化诱导后，通过将培养基更换为分别不含分化诱导因子(例如，bmp4)的无血清培养基或含血清培养基，培养基中分化诱导因子(例如，bmp4)的浓度以每2
‑
4天40
‑
60％的比例逐渐或逐步降低。结果，分化诱导因子(例如，bmp4)的浓度可以逐步被稀释，并且分化诱导因子作用的效果和持续时间可以得到限制。
[0220]
在具体的实施方案中，在开始悬浮培养后(即，在前述步骤(2)开始后)第1
‑
9天、优选第2
‑
8天、进一步优选第3天或第4天，培养基可以被部分或完全更换为包含bmp4的培养基，以调节bmp4的终浓度至约1
‑
10nm，并且可以将细胞在存在bmp4的条件下培养约1
‑
12天，优选2
‑
9天，更优选2
‑
5天。为了将bmp4的浓度保持在相同水平，可以将培养基用包含bmp4的培养基部分或完全更换一次或两次。备选地，如上文提及的，bmp4的浓度也可以逐步减小。
[0221]
其中已经开始向视网膜细胞分化的诱导的细胞可以通过例如检测所述细胞中视网膜祖先细胞标记基因(例如，rx基因(别名rax)，pax6基因，chx10基因)的表达而证实。将通过使用在rx基因座中敲入了荧光报告蛋白基因(如gfp等)的多能干细胞在步骤(2)中形成的聚集体在存在向视网膜细胞分化诱导需要的浓度的分化诱导因子(例如，bmp4)的条件下悬浮培养，并且检测由所表达的荧光受体蛋白发射的荧光，由此可以证实向视网膜细胞分化诱导开始的时间点。作为步骤(3)的一个实施方案，在包含向视网膜细胞分化诱导需要的浓度的分化诱导因子(例如，bmp4)的无血清培养基或含血清培养基中悬浮培养步骤(2)中形成的聚集体的步骤，直到开始出现表达视网膜祖先细胞标记基因(例如，rx基因，pax6
基因，chx10基因)的细胞，由此得到包含视网膜祖先细胞的细胞聚集体。
[0222]
在步骤(3)中，当进行培养基更换操作时，例如，可以提及培养基添加操作，一半培养基更换操作和完全培养基更换操作。
[0223]
当在特定时间点加入特定的成分(例如，分化诱导因子)时，例如，可以进行这样的操作：计算终浓度，弃掉约一半量的已有的培养基，并且添加约一半量的新鲜培养基(一半培养基更换操作)，所述新鲜培养基包含浓度高于所述终浓度(具体地，所述终浓度的1.5
‑
3.0倍，例如，约为终浓度的2倍)的特定成分。
[0224]
当在特定时间点保持已有的培养基中包含的特定成分的浓度时，例如，可以进行这样的操作：弃掉约一半量的已有的培养基，并且添加约一半量的新鲜培养基，所述新鲜培养基包含浓度与已有的培养基中相同的特定成分。
[0225]
当通过在特定时间点的稀释而降低已有的培养基中包含的成分的浓度时，例如，可以每天多次进行培养基更换操作，优选在1小时内进行多次(例如，2
‑
3次)。此外，当通过在特定时间点的稀释降低已有的培养基中包含的成分的浓度时，可以将细胞或聚集体转移到另一个培养容器中。
[0226]
尽管用于培养基更换操作的工具没有特别限制，例如，可以提及移液管、微量移液管(pipetman)、多通道微量移液管(multichannel pipetman)、连续的分配器等。例如，当使用96孔平板作为培养容器时，可以使用多通道微量移液管(multichannel pipetman)。
[0227]
可以适当地确定步骤(3)中的培养条件，如培养温度和co2浓度等。例如，培养温度为约30℃
‑
约40℃，优选约37℃。例如，co2浓度为约1％
‑
约10％，优选约5％。
[0228]
通过这样的培养，诱导形成步骤(2)中得到的聚集体的细胞向视网膜祖先细胞分化，由此可以得到包含视网膜祖先细胞的聚集体。本发明还提供制备此类包含视网膜祖先细胞的聚集体的方法。得到包含视网膜祖先细胞的聚集体的事实可以通过例如检测所述聚集体中表达rax、pax6或chx10(它们是视网膜祖先细胞标记)的细胞的存在而证实。步骤(3)的一个实施方案是在包含处于向视网膜细胞分化诱导所需要的浓度的bmp信号转导途径激活物质(例如，bmp4)的无血清培养基或含血清培养基中悬浮培养步骤(2)中形成的聚集体的步骤，直到开始出现表达rx基因的细胞，由此得到包含视网膜祖先细胞的聚集体。在一个实施方案中，进行步骤(3)的培养直到聚集体中包含的不少于20％(优选地，不少于30％，不少于40％，不少于50％，不少于60％)的细胞表达rx。
[0229]
得到的包含视网膜祖先细胞的聚集体可以按其原样作为用于评价毒性或功效的试剂使用。将包含视网膜祖先细胞的聚集体进行分散处理(例如，胰蛋白酶/edta处理或木瓜蛋白酶处理)，并且使用facs或macs对得到的细胞进行选择，由此也可以得到高纯度的视网膜祖先细胞。
[0230]
此外，可以将包含视网膜组织的聚集体继续在无血清培养基或含血清培养基中培养，以使视网膜组织中包含的视网膜细胞(例如，视网膜祖先细胞)进一步分化，由此可以产生神经上皮结构样视网膜组织。
[0231]
用于所述培养基的无血清培养基或含血清培养基没有特别限制，只要其是上文提及的即可。例如，可以提及作为补充了10％胎牛血清、n2补充物、100μm牛磺酸和500nm视黄酸的dmem
‑
f12培养基的含血清培养基或补充了适量的商购得到的血清代替物如ksr等的无血清培养基(例如，补充了10％ksr、450μm 1
‑
一硫代甘油和1x化学上明确的脂质浓缩物的
imdm和f
‑
12的1∶1混合物的培养基)等。
[0232]
尽管从视网膜祖先细胞诱导视网膜组织的培养时间期随目的视网膜层专有的神经元而不同，但是，例如，该时间期为约7天至约200天。
[0233]
视网膜组织覆盖着聚集体的表面存在。在悬浮培养结束后，可以将聚集体用固定剂(如多聚甲醛溶液等)固定，并且制备冷冻切片，随后可以通过免疫染色等证实具有层结构的视网膜组织的形成。由于视网膜组织的各个层由不同的细胞(感光细胞、水平细胞、双极细胞、无长突细胞、视网膜神经节细胞)构成，层结构的形成可以使用针对在这些细胞中表达的前述标记的抗体通过免疫染色证实。在一个实施方案中，视网膜组织是rx
‑
或chx10
‑
阳性神经上皮结构。
[0234]
存在于聚集体表面上的视网膜组织可以使用镊子等从所述聚集体上物理切下。在这一情形中，由于可以在每个聚集体表面上形成除视网膜组织之外的神经组织，从所述聚集体上切下的一部分神经组织可以通过下文提及的免疫染色等进行验证，由此可以证实所述组织是视网膜组织。
[0235]
在一个实施方案中，步骤(3)中得到的聚集体包含视网膜组织，并且基本上不含非神经头部外胚层。在包含视网膜组织且基本上不含非神经头部外胚层的聚集体中，例如，在前述聚集体冷冻切片的免疫染色图像中，在其外侧观察到rx
‑
阳性组织，没有观察到rx
‑
阴性组织。
[0236]
步骤(3)的一个实施方案是在包含处于向视网膜细胞分化诱导需要的浓度的bmp信号转导途径激活物质的无血清培养基或含血清培养基中悬浮培养步骤(2)中形成的聚集体的步骤，直到开始出现表达rx基因的细胞，从而产生包含视网膜祖先细胞的聚集体，并且随后在无血清培养基或含血清培养基中悬浮培养包含所述视网膜祖先细胞的聚集体，直到形成视网膜组织，由此得到包含视网膜组织的聚集体。当随后在无血清培养基或含血清培养基中悬浮培养包含所述视网膜祖先细胞的聚集体直到形成视网膜组织时，通过将所述培养基更换为分别不含bmp信号转导途径激活物质的无血清培养基或含血清培养基，培养基中诱导视网膜祖先细胞的bmp信号转导途径激活物质的浓度可以以每2
‑
4天40
‑
60％的比例逐渐或逐步降低。在一个实施方案中，进行包含视网膜祖先细胞的聚集体的悬浮培养，直到所述聚集体中所包含的不少于20％(优选地，不少于30％，不少于40％，不少于50％，不少于60％)的细胞表达chx10。
[0237]
在步骤(3)的一个实施方案中，步骤(2)中得到的聚集体或通过上文提及的方法悬浮培养步骤(2)中得到的聚集体而得到的聚集体可以进行贴壁培养以形成粘附的聚集体。在包含处于向视网膜细胞分化诱导所需要的浓度的分化诱导因子(例如，bmp4)的无血清培养基或含血清培养基中以粘附状态培养粘附的聚集体，直到开始出现表达rx基因的细胞，从而产生包含视网膜祖先细胞的粘附的聚集体。将包含所述视网膜祖先细胞的聚集体在无血清培养基或含血清培养基中以粘附状态培养，直到形成视网膜组织，由此得到包含视网膜组织的粘附的聚集体。在一个实施方案中，进行包含视网膜祖先细胞的粘附的聚集体的贴壁培养，直到不少于10％(优选地，不少于20％，不少于30％，不少于40％，不少于50％)的所述细胞表达chx10。
[0238]
通过本发明的方法，可以高效地从多能干细胞得到视网膜细胞和视网膜组织。由于通过本发明的方法得到的视网膜组织包含每个视网膜层专有的神经元(神经元细胞)，因
此也可能得到组成视网膜组织的各个细胞，诸如感光细胞、水平细胞、双极细胞、无长突细胞、视网膜神经节细胞或它们的祖先/前体细胞等。由获得的视网膜组织获得什么细胞可以通过本身已知的方法(例如，细胞标记物的表达)来确认。
[0239]
获得的含有视网膜组织的聚集体也可以直接按原样地用作用于评估毒性或功效的试剂。将包含视网膜组织的聚集体进行分散处理(例如，胰蛋白酶/edta处理)，并且使用facs或macs，对得到的细胞进行选择，由此也可以获得高纯度的视网膜组织
‑
组成细胞，例如，高纯度的感光细胞。
[0240]
可以通过下述步骤(a)和步骤(b)由通过本发明的制备方法得到的包含视网膜组织的细胞聚集体产生睫状边缘区样结构。
[0241]
睫状边缘区样结构是指与睫状边缘区相似的结构。“睫状边缘区(cmz)”的实例包括在体内在视网膜中的视网膜组织(具体地，神经视网膜)和视网膜色素上皮的边缘区中存在的组织，其是包含视网膜组织干细胞(视网膜干细胞)的区域。睫状边缘区还称为睫状边缘或视网膜边缘，并且睫状边缘区、睫状边缘和视网膜边缘是同等的组织。已知睫状边缘区在供应视网膜祖先细胞或向视网膜组织的分化细胞、维持视网膜组织结构等中起重要作用。睫状边缘区的标记基因的实例包括rdh10基因(阳性)、otx1基因(阳性)、zic1基因(阳性)等。
[0242]
步骤(a)包括在分别包含wnt信号途径激活物质和/或fgf信号途径抑制物质的无血清培养基或含血清培养基中培养通过本发明的制备方法2得到的包含视网膜组织的细胞聚集体持续仅在表达rpe65基因的细胞出现之前的时间期，在所述细胞聚集体中chx10阳性细胞以占所述视网膜组织20％以上且100％以下的比例存在。
[0243]
此处关于步骤(a)优选的培养，可以提及悬浮培养。
[0244]
关于用于步骤(a)的无血清培养基，可以提及作为补充了n2或ksr的基础培养基的无血清培养基。更具体地，可以提及作为补充了n2补充剂(n2，由life technologies制造)的dmem/f
‑
12培养基的无血清培养基。关于含血清的培养基，可以提及作为补充了胎牛血清的基础培养基的含血清培养基。
[0245]
可以适当设置步骤(a)的培养条件，诸如培养温度、co2浓度。例如，培养温度在约30℃至约40℃的范围内，优选地，例如，大致约37℃。例如，co2浓度在约1％至约10％的范围内，优选地，例如，大致约5％。
[0246]
在步骤(a)中，当在培养基中培养上文提及的“包含视网膜组织的细胞聚集体”时，要包含在无血清培养基或含血清培养基中的wnt信号转导途径激活物质没有特别限制，只要其能够增强由wnt介导的信号转导即可。wnt信号转导途径激活物质的具体实例包括属于wnt家族的蛋白(例如，wnt1，wnt3a，wnt7a)，wnt受体，wnt受体激动剂，gsk3抑制剂(例如，6
‑
溴靛玉红
‑3’‑
肟(6
‑
bromoindirubin
‑3’‑
oxime，bio)，chir99021，kenpaullone)等。
[0247]
在常见的wnt信号转导途径激活物质诸如chir99021的情形中，例如，步骤(a)中包含在无血清培养基或含血清培养基中的wnt信号转导途径激活物质的浓度在约0.1μm至约100μm的范围内，优选地，例如，在约1μm至约30μm的范围内，更优选地，例如，为约3μm。
[0248]
当在培养基中培养上文提及的“包含视网膜组织的细胞聚集体”时，步骤(a)中包含在无血清培养基或含血清培养基中的fgf信号转导途径抑制物质没有特别限制，只要其能够抑制由fgf介导的信号转导即可。fgf信号转导途径抑制物质的实例包括fgf受体，fgf
受体抑制剂(例如，su
‑
5402，azd4547，bgj398)，map激酶级联抑制物质(例如，mek抑制剂，mapk抑制剂，erk抑制剂)，pi3激酶抑制剂，akt抑制剂等。
[0249]
步骤(a)中包含在无血清培养基或含血清培养基中的fgf信号转导途径抑制物质的浓度仅需要是可以诱导聚集体向睫状边缘区样结构分化的浓度。例如，在su
‑
5402的情形中，将其添加到培养基中至约0.1μm至约100μm、优选地约1μm至约30μm、更优选地约5μm的浓度。
[0250]
步骤(a)中“培养持续仅在表达rpe65基因的细胞出现之前的时间期”意指在表达rpe65基因的细胞出现之前的全部时间期内或部分时间期内培养。即，在此时间期内，培养系统中的前述“包含视网膜组织的细胞聚集体”由基本上不表达rpe65基因的细胞组成的时间期(任意时间期)的全部或部分内的培养。通过使用这样的培养，可以得到其中没有出现表达rpe65基因的细胞的细胞聚集体。
[0251]
为了确定所述特定的时间期，使用前述“包含视网膜组织的细胞聚集体”作为样品，并且可以通过一般的遗传改造方法或生物化学方法测量存在或不存在样品中包含的rpe65基因的表达或其水平。具体地，例如，可以通过使用针对rpe65蛋白的抗体使前述“包含视网膜组织的细胞聚集体”的冷冻切片进行免疫染色法检验存在或不存在rpe65基因的表达或其水平。
[0252]
关于步骤(a)中“在表达rpe65基因的细胞出现之前的时间期”，例如，可以提及这样的时间期，在所述时间期内，与在分别包含wnt信号转导途径激活物质和/或fgf信号转导途径抑制物质的无血清培养基或含血清培养基中开始培养前述细胞聚集体的时刻相比，在上述视网膜组织中存在的chx10阳性细胞的比例降低，并且落入30％至0％的范围内。关于“其中没有出现表达rpe65基因的细胞的细胞聚集体”，可以提及这样的细胞聚集体，其中在前述视网膜组织中存在占所述组织的30％至0％比例的chx10阳性细胞。
[0253]
尽管步骤(a)中“在表达rpe65基因的细胞出现之前的时间期”的天数随wnt信号转导途径激活物质和/或fgf信号转导途径抑制物质的种类、无血清培养基或含血清培养基的种类、其他培养条件等而变化，但是，例如，其在14天内。更具体地，当使用无血清培养基(例如，作为补充了n2的基础培养基的无血清培养基)时，例如，上述时间期优选地在10天内，更优选地，例如，3天至6天。当使用含血清培养基(例如，作为补充了胎牛血清的含血清培养基)时，例如，前述时间期优选地在12天内，更优选地，例如，6天至9天。
[0254]
然后，关于步骤(b)，将通过上述培养得到的“其中没有出现表达rpe65基因的细胞的细胞聚集体”在分别不含wnt信号转导途径激活物质的无血清培养基或含血清培养基中培养。
[0255]
关于步骤(b)中优选的培养，可以提及悬浮培养。
[0256]
关于步骤(b)中的无血清培养基，可以提及作为补充了n2或ksr的基础培养基的培养基。关于含血清培养基，可以提及作为补充了胎牛血清的基础培养基的培养基。更具体地，可以提及作为补充了胎牛血清的dmem/f
‑
12培养基的含血清培养基。
[0257]
步骤(b)中上述无血清培养基或含血清培养基可以包含已知的生长因子、添加剂和促进生长的化学物质等。已知的生长因子的实例包括egf，fgf，igf，胰岛素等。促进生长的添加剂的实例包括n2补充剂(life technologies)，b27补充剂(life technologies)，ksr等。促进生长的化学物质的实例包括类视黄醇(例如，视黄酸)和牛磺酸。
[0258]
例如，步骤(b)中的培养的优选的时间期是这样的培养时间期，在所述时间期内，与在分别不含wnt信号转导途径激活物质的无血清培养基或含血清培养基中开始培养前述细胞聚集体的时刻相比，在前述视网膜组织中存在的chx10阳性细胞的比例增加，并且达到30％以上。
[0259]
可以适当地设定步骤(b)中的培养条件，诸如培养温度、co2浓度等。例如，培养温度在约30℃至约40℃的范围内，优选地，例如，大致约37℃。例如，co2浓度在约1％至约10％的范围内，优选地，例如，大致约5％。
[0260]
尽管步骤(b)中直到得到“包含睫状边缘区样结构的细胞聚集体”的上述培养天数随无血清培养基或含血清培养基的种类、其他培养条件等而变化，但是，例如，其在100天之内。例如，上述培养天数优选地为20天至70天，更优选地，例如，30天至60天。
[0261]
在通过前述步骤(a)、(b)制备的“包含睫状边缘区样结构的细胞聚集体”中，在同一细胞聚集体中，邻近所述睫状边缘区样结构存在视网膜色素上皮和视网膜组织(具体地，神经视网膜)。所述结构可以通过显微镜观察等证实。具体地，例如，可以通过显微镜观察证实睫状边缘区样结构的存在，其作为具有厚视网膜侧和薄视网膜色素上皮侧的上皮结构存在，其在具有高透明度的视网膜组织与表现出色素沉着的视网膜色素上皮之间形成。另外，可以通过免疫染色聚集体的冷冻切片鉴定rdhl0阳性、otx1阳性或zic1阳性细胞而证实睫状边缘区样结构的存在。
[0262]
可以通过下述步骤(c)由通过本发明的制备方法和类似方法得到的包含视网膜组织的细胞聚集体产生视网膜色素上皮细胞。视网膜色素上皮片层(sheet)可以通过下述步骤(d)由通过下述步骤(c)得到的视网膜色素上皮细胞产生。
[0263]
本发明中的“视网膜色素上皮细胞”意指在体内在视网膜中神经视网膜组织外侧存在的上皮细胞。其是否是视网膜色素上皮细胞可以由本领域普通技术人员基于例如细胞标记(rpe65(成熟的视网膜色素上皮细胞)，mitf(幼态的或成熟的视网膜色素上皮细胞)等)的表达、黑素颗粒的存在、多边形特征性细胞形态等而验证。
[0264]
首先，在步骤(c)中，将通过本发明的制备方法2得到的包含视网膜组织的细胞聚集体在不含bmp信号转导途径激活物质但是包含wnt信号转导途径激活物质的无血清培养基或含血清培养基中悬浮培养，从而产生包含视网膜色素上皮细胞的聚集体。
[0265]
关于用于步骤(c)的无血清培养基，可以提及作为补充了n2或ksr的基础培养基的无血清培养基。更具体地，可以提及作为补充了n2补充剂(life technologies)的dmem/f
‑
12培养基的无血清培养基。关于含血清培养基，可以提及作为补充了胎牛血清的基础培养基的含血清培养基。
[0266]
除了前述wnt信号转导途径激活物质之外，用于步骤(c)的无血清培养基还可以包含前述nodal/激活蛋白信号转导途径激活物质和/或前述fgf信号转导途径抑制物质。
[0267]
例如，步骤(c)中优选的培养是悬浮培养。
[0268]
解释步骤(d)，其中将在步骤(c)中得到的聚集体分散并且将得到的细胞以粘附状态培养。
[0269]
在步骤(c)开始后60天内，优选地在30天内，更优选地3天内，进行步骤(d)。
[0270]
关于步骤(d)中用于贴壁培养的无血清培养基或含血清培养基，可以提及前述培养基。为了避免复杂的制备，优选使用补充了适量商购血清代替物(如ksr等)的无血清培养
基(例如，补充了1/2x n2补充剂、1/2x b27补充剂和100μm 2
‑
巯基乙醇的dmem/f
‑
12和neurobasal的1∶1混合物的培养基)。在来源于人ips细胞的细胞的情形中，例如，要添加到无血清培养基中的ksr的量通常为约1％至约20％，优选约2％至约20％。
[0271]
在步骤(d)中，优选地在包含rock抑制物质的前述无血清培养基或含血清培养基中培养细胞。
[0272]
在步骤(d)中，更优选地在进一步包含选自由下述组成的组的一种或多种物质的无血清培养基或含血清培养基中培养细胞：wnt信号转导途径激活物质，fgf信号转导途径抑制物质，激活蛋白信号转导途径激活物质和bmp信号转导途径激活物质。
[0273]
激活蛋白信号转导途径激活物质是能够增强由激活蛋白介导的信号的物质。激活蛋白信号转导途径激活物质的实例包括属于激活蛋白家族的蛋白(例如，激活蛋白a，激活蛋白b，激活蛋白c，激活蛋白ab等)，激活蛋白受体，和激活蛋白受体激动剂。
[0274]
用于步骤(d)的激活蛋白信号转导途径激活物质的浓度可以是任意浓度，只要可以有效地形成均匀的视网膜色素上皮细胞片层即可。例如，加入重组的人/小鼠/大鼠激活蛋白a(r&d systems，#338
‑
ac)至约1ng/ml至约10μg/ml、优选地约10ng/ml至约1μg/ml、更优选地约100ng/ml的浓度。
[0275]
例如，在步骤(d)开始起18天内，优选地在第6天，添加激活蛋白信号转导途径激活物质。
[0276]
在步骤(d)中，优选地在表面用培养基底处理的培养容器上进行贴壁培养。关于步骤(d)中用于处理培养容器的培养基底，可以提及能够允许聚集体来源的细胞的贴壁培养和视网膜色素上皮片层形成的细胞培养基底。
[0277]
3.用于评价毒性和功效的方法
[0278]
由于通过本发明的制备方法产生的视网膜组织或视网膜细胞(例如，感光细胞，视网膜祖先细胞，视网膜层专有的神经元)可作为用于疾病研究或药物发现的材料用于筛选治疗由于视网膜组织或视网膜细胞的紊乱导致的疾病的药物，或用于毒性评价，其可以用作评价测试物质的毒性或功效的试剂。例如，由患有由于视网膜组织紊乱导致的疾病、特别是遗传病的人患者产生ips细胞，并且使用该ips细胞，通过本发明的方法产生视网膜组织或视网膜细胞(例如，感光细胞，视网膜祖先细胞，视网膜层专有的神经元)。所述视网膜组织或视网膜细胞可以在体外重现引起患者的疾病的视网膜组织紊乱。因此，本发明提供用于评价测试物质的毒性或功效的方法，所述方法包括使所述测试物质与通过本发明的制备方法产生的视网膜组织或视网膜细胞(例如，感光细胞，视网膜祖先细胞，视网膜层专有的神经元)接触，并且检测所述物质对所述细胞或组织的影响。
[0279]
例如，在存在或不存在(阴性对照)测试物质的条件下，培养通过本发明的制备方法产生的具有特定紊乱(例如，遗传性紊乱)的视网膜组织或视网膜细胞(例如，感光细胞，视网膜祖先细胞，视网膜层专有的神经元)。然后，将用测试物质处理的所述视网膜组织或视网膜细胞的紊乱的严重性与阴性对照的进行比较。结果，可以选择减轻紊乱的严重性的测试物质作为用于治疗由所述紊乱导致的疾病的药物的候选物质。例如，可以寻找改善通过本发明的制备方法产生的视网膜细胞的生理活性(例如，存活促进或成熟)的测试物质作为药物产品的候选物质。备选地，按照本发明的制备方法，通过诱导由体细胞制备的诱导的多能干细胞的分化制备视网膜细胞，所述体细胞具有引起特定紊乱诸如伴有视网膜中的紊
乱等的疾病的基因突变。
[0280]
可以基于添加了测试物质的视网膜细胞是否表现出前述紊乱作为指标，寻找有效作为所述紊乱的治疗药或预防药的测试物质的候选物。
[0281]
对于毒性评价，将通过本发明的制备方法产生的视网膜组织或视网膜细胞(例如，感光细胞，视网膜祖先细胞，视网膜层专有的神经元)在存在或不存在(阴性对照)测试物质的条件下培养。然后，将对用所述测试物质处理的视网膜组织或视网膜细胞的毒性严重性与阴性对照的毒性严重性比较。结果，与阴性对照相比，可以判断表现出毒性的测试物质是对视网膜组织或视网膜细胞(例如，感光细胞，视网膜祖先细胞，视网膜层专有的神经元)具有毒性的物质。
[0282]
即，本发明包括评价毒性的方法，所述方法包括下述步骤：
[0283]
(步骤1)在测试物质的存在下，在存活培养条件下，培养通过本发明的制备方法产生的视网膜组织或视网膜细胞达给定的时间，并且测量细胞损伤的严重性的步骤，
[0284]
(步骤2)在不存在测试物质或存在阳性对照时，在存活培养条件下，培养通过本发明的制备方法产生的视网膜组织或视网膜细胞达给定的时间，并且测量细胞损伤的严重性的步骤，
[0285]
(步骤3)基于(步骤1)和(步骤2)中测量的结果的差异，评价步骤1中测试物质的毒性的步骤。
[0286]
用于本文时，“在不存在测试物质时”包括仅添加培养基或用于溶解所述测试物质的溶剂，而不添加测试物质。另外，“阳性对照”意指具有毒性的已知化合物。
[0287]
测量细胞损伤严重性的方法的实例包括测量存活细胞数量的方法，例如，测量细胞内atp的量的方法，通过细胞染色(例如，核染色)和形态观察测量存活细胞数量的方法等。
[0288]
在步骤3中，关于评价测试物质的毒性的方法，比较步骤1中的测量值和步骤2中阴性对照的测量值，并且当步骤1中细胞损伤的严重性高时，可以判断所述测试物质具有毒性。另外，比较步骤1中的测量值与步骤2中阳性对照的测量值，并且当步骤1中细胞损伤的严重性相同或更高时，可以判断所述测试物质具有毒性。
[0289]
4.药物组合物
[0290]
本发明提供包含有效量的通过本发明的制备方法产生的视网膜组织或视网膜细胞(例如，感光细胞，视网膜祖先细胞，视网膜层专有的神经元)的药物组合物。
[0291]
所述药物组合物包含有效量的通过本发明的制备方法产生的视网膜组织或视网膜细胞(例如，感光细胞，视网膜祖先细胞，视网膜层专有的神经元)和药用载体。
[0292]
关于药用载体，可以使用生理水性溶剂(盐水，缓冲液，无血清培养基等)。必要时，在移植治疗中，包含要移植的组织或细胞的药物可以包含常规使用的防腐剂、稳定剂、还原剂、等渗剂等。
[0293]
本发明的药物组合物可以通过将由本发明的制备方法1或2产生的视网膜组织或视网膜细胞悬浮在适当的生理水性溶剂中制成混悬剂。必要时，所述组合物可以添加冷冻保护剂，冷冻保藏，使用时解冻，用缓冲液洗涤，并且用于移植治疗。
[0294]
通过本发明的制备方法得到的视网膜组织也可以用镊子等切成适当的尺寸，以产生片层制剂。
[0295]
通过本发明的制备方法得到的细胞也可以在步骤(3)中进行贴壁培养用于分化诱导，从而形成片层样细胞，产生片层制剂。
[0296]
本发明的药物组合物可以用作由于神经组织或神经细胞(例如，视网膜组织，视网膜祖先细胞，视网膜层专有的神经元)的紊乱导致的疾病的治疗药。
[0297]
5.治疗药
[0298]
通过本发明的制备方法产生的视网膜组织或视网膜细胞(例如，感光细胞，视网膜祖先细胞，视网膜层专有的神经元)可用于由于视网膜组织或视网膜细胞的紊乱导致的疾病的移植治疗。因此，本发明提供用于治疗由于视网膜组织或视网膜细胞的紊乱导致的疾病的药物，其包含通过本发明的制备方法产生的视网膜组织或视网膜细胞(例如，感光细胞，视网膜祖先细胞，视网膜层专有的神经元)。通过本发明的制备方法产生的视网膜组织或视网膜细胞(包括视网膜祖先细胞，视网膜层专有的神经元)可以用作治疗由于视网膜组织或视网膜细胞的紊乱导致的疾病的药物或用于补充视网膜组织的损伤状态中相对应的损伤位点。由于视网膜组织或视网膜细胞的紊乱导致的疾病和视网膜组织的损伤状态可以通过向具有由于视网膜组织或视网膜细胞的紊乱导致的疾病或视网膜组织的损伤状态的患者(其需要移植)移植通过本发明的制备方法产生的视网膜组织或视网膜细胞进行治疗，从而补充视网膜细胞或紊乱的视网膜组织本身。由于视网膜组织或视网膜细胞的紊乱导致的疾病的实例包括视网膜变性(retinal denaturation)、视网膜色素性变性(pigmentary degeneration of the retina)、年龄相关黄斑变性(age
‑
related macular degeneration)、有机汞中毒(organic mercury poisoning)、氯喹视网膜病变(chloroquine retinopathy)、青光眼(glaucoma)、糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy)、新生儿视网膜病变(retinopathy of newborn babies)等。
[0299]
在移植治疗中，由于组织相容性抗原的差异导致的排异通常构成问题。然而，该问题可以通过使用由移植接受体的体细胞建立的多能干细胞(例如，诱导的多能干细胞)而解决。即，在优选的实施方案中，由接受体的体细胞建立的多能干细胞(例如，诱导的多能干细胞)用作本发明的方法中的多能干细胞，并且产生对于所述接受体在免疫上是自身的神经组织或神经细胞并移植到所述接受体中。
[0300]
另外，可以从由与接受体免疫相容的(例如，在hla型和mhc型方面相容)其他人的体细胞建立多能干细胞(例如，诱导的多能干细胞)产生同种异体神经组织或神经细胞，并且移植到所述接受体中。
[实施例]
[0301]
在下文通过参考实施例和药理学实施例详细解释本发明，所述实施例不应该解释为限制性的。
[0302]
比较例1：在步骤2中不使用shh信号转导途径激活物质由人ips细胞分化的实施例
[0303]
按照“scientific reports，4，3594(2014)”中所述的方法，在无饲养细胞的条件下培养人ips细胞(1231a3株，获自京都大学(kyoto university))。关于无饲养细胞的培养基，使用stemfit培养基(ak03，由ajinomoto co.，inc.制造)，并且关于无饲养细胞的构架，使用层粘连蛋白511
‑
e8(由nippi，inc.制造)。
[0304]
关于具体的维持培养操作，首先将业汇合(subconfluent)的人ips细胞(1231a3
株)用pbs洗涤，并且使用tryple select(由life technologies制造)分散成单个细胞。然后，将前述分散成单个细胞的人ips细胞接种在用层粘连蛋白511
‑
e8包被的塑料培养皿中，并且在存在y27632(rock抑制物质，10μm)的条件下，在stemfit培养基中进行无饲养细胞的培养。当使用6孔平板(由iwaki制造，对于细胞培养，培养面积为9.4cm2)作为前述塑料培养皿时，将关于前述分散成单个细胞的人ips细胞的铺板细胞数目调整为6x103。接种后一天，将全部量的培养基更换为不含y27632的stemfit培养基。然后，1
‑
2天一次，将全部量的培养基更换为不含y27632的stemfit培养基。之后，接种后6天，细胞培养至亚汇合(60％的培养面积被细胞覆盖)。
[0305]
通过使用tryple select(life technologies)，将上述亚汇合的人ips细胞用细胞分散液处理，并且通过吹吸操作进一步分散成单个细胞。然后，将上述分散成单个细胞的人ips细胞以1.2
×
104个细胞/孔悬浮在非细胞粘附性的96孔培养板(primesurface 96v型底平板，sumitomo bakelite)中的100μl无血清培养基中，并且在37℃，5％co2进行悬浮培养。关于用于此的无血清培养基(gfcdm ksr)，使用补充了10％ksr、450μm 1
‑
一硫代甘油、1x化学成分确定的脂质浓缩物的f
‑
12培养基与imdm培养基的1∶1混合物。在悬浮培养开始时(在悬浮培养开始后的第0天，步骤2开始)，向上述无血清培养基中加入y27632(终浓度为20μm)。到悬浮培养开始后第2天，形成细胞聚集体(步骤2结束，并且步骤3开始)。在悬浮培养开始后第3天，加入不含y27632的无血清培养基(50μl)。
[0306]
在悬浮培养开始后第6天，将一半量的培养基更换为不含y27632但包含或不包含人重组bmp4(由r&d制备)的培养基，以将外源性人重组bmp4的浓度调整为1.5nm(55ng/ml，图1b)或产生不含外源性人重组bmp4的培养基(图1a)。关于一半培养基更换操作，弃掉培养容器中一半体积的培养基，即75μl，加入上述新鲜的无血清培养基(75μl)调整总培养基量至150μl。然后，将一半量的培养基更换为上述不含y27632和人重组bmp4的无血清培养基，每2
‑
4天更换一次。在悬浮培养开始后第19天，将这样制备的细胞聚集体在倒置显微镜(biorevo，由keyence制造)下进行亮视野观察(图1a，b)。结果，发现在涉及添加人重组bmp4的条件下(图1b)和在不涉及添加的条件下(图1a)，都有不少于90％的细胞聚集体塌陷，并且神经组织形成效率差。
[0307]
实施例1：通过在步骤2中使用shh转导途径激活物质，由在步骤1中使用stemfit作为无饲养细胞培养基培养的人ips细胞制备的细胞聚集体、神经组织和视网膜组织的形成的实施例
[0308]
按照“scientific reports，4，3594(2014)”中所述的方法，在无饲养细胞的条件下培养人ips细胞(1231a3株，获自京都大学(kyoto university))。关于无饲养细胞的培养基，使用stemfit培养基(ak03，由ajinomoto co.，inc.制造)，并且关于无饲养细胞的构架，使用层粘连蛋白511
‑
e8(由nippi，inc.制造)。维持培养按照比较例1中所述的方法进行。
[0309]
通过使用tryple select (life technologies)，将这样制备的亚汇合的人ips细胞用细胞分散液处理，并且通过吹吸操作进一步分散成单个细胞。然后，将上述分散成单个细胞的人ips细胞以1.2
×
104个细胞/孔悬浮在非粘附性96孔培养板(primesurface 96v型底平板，sumitomo bakelite)中的100μl无血清培养基中，并且在37℃，5％co2进行悬浮培养。关于用于此的无血清培养基(gfcdm ksr)，使用补充了10％ksr、450μm 1
‑
一硫代甘油、1x化学成分确定的脂质浓缩物的f
‑
12培养基与imdm培养基的1∶1混合物。在悬浮培养开始
时(在悬浮培养开始后的第0天，步骤2开始)，向上述无血清培养基中加入y27632(终浓度为20μm)和作为shh信号转导途径激活物质的sag(300nm)。到悬浮培养开始后第2天，形成细胞聚集体(步骤2结束，步骤3开始)。在悬浮培养开始后第3天，加入不含y27632和sag的无血清培养基(50μl)。在悬浮培养开始后第6天，将一半量的培养基更换为不含y27632但包含或不包含人重组bmp4(由r&d制备)的培养基，以将外源性人重组bmp4的浓度调整为1.5nm(55ng/ml，图1d)或产生不含外源性人重组bmp4的培养基(图1c)。关于一半培养基更换操作，弃掉培养容器中一半体积的培养基，即75μl，加入上述新鲜的无血清培养基(75μl)调整总培养基量至150μl。然后，将一半量的培养基更换为上述不含y27632、sag和人重组bmp4的无血清培养基，每2
‑
4天更换一次。在悬浮培养开始后第19天，将这样制备的细胞聚集体在倒置显微镜(biorevo，由keyence制造)下进行亮视野观察(图1c，d)。结果，发现在涉及添加人重组bmp4的条件下(图1d)和在不涉及其添加的条件下(图1c)，细胞聚集体都得到维持，并且观察到神经上皮结构。即，发现加入shh信号转导途径激活物质提供良好的聚集体形状并且提高神经组织形成的效率(图1a
‑
d)。从该结果，发现通过在步骤2的悬浮培养开始时添加shh信号转导途径激活物质，可以由进行无饲养细胞培养的人ips细胞有效地产生神经组织。
[0310]
将上述在开始悬浮培养后第19天的细胞聚集体分别用4％多聚甲醛固定，产生冷冻切片。将这些冷冻切边针对chx10(抗
‑
chx10抗体，由exalpha制备，绵羊)(其是一种视网膜组织标记)或rx(抗
‑
rx抗体，由takara制备，豚鼠)(其是一种视网膜组织标记)免疫染色。在判断上述标记在免疫染色分析中是否是阳性时，将高于背景荧光强度不少于2倍的荧光强度视为是阳性的。结果，发现在涉及在悬浮培养的第0天添加shh信号转导途径激活物质和在悬浮培养的第6天不添加bmp信号转导途径激活物质的条件下，总细胞中rx
‑
阳性细胞的比例低于3％，并且chx10
‑
阳性细胞的比例也低于3％(图2a，c)。另一方面，发现在涉及在悬浮培养的第0天添加shh信号转导途径激活物质并且在悬浮培养的第6天添加bmp信号转导途径激活物质的条件下，总细胞中rx
‑
阳性细胞的比例不低于60％，并且chx10
‑
阳性细胞的比例也不低于60％(图2b，d)。此外，从连续切片分析来看，表明在具有高比例(不低于95％)的chx10
‑
阳性细胞的神经组织中，rx也是强阳性的(图2b，d)。从这些结果，发现通过在步骤2悬浮培养开始时添加shh信号转导途径激活物质并且在步骤3的悬浮培养期间添加作为分化诱导物质的bmp信号转导途径激活物质，能够由无饲养细胞培养的人ips细胞(以下有时称为无饲养细胞的人ips细胞)有效地产生视网膜组织。
[0311]
实施例2：在步骤1中使用essential 8作为无饲养细胞培养基并且在开始悬浮培养时使用shh转导途径激活物质由人ips细胞产生神经组织的实施例
[0312]
按照“scientific reports，4，3594(2014)”中所述的方法，在无饲养细胞的条件下培养人ips细胞(1231a3株，获自京都大学(kyoto university))。关于无饲养细胞的培养基，使用essential 8培养基(由life technologies制造)，并且关于无饲养细胞的构架，使用层粘连蛋白511
‑
e8(由nippi，inc.制造)。
[0313]
关于具体的维持培养操作，首先将亚汇合的人ips细胞(1231a3株)用pbs洗涤，并且使用tryple select(由life technologies制造)分散成单个细胞。然后，将前述分散成单个细胞的人ips细胞接种在用层粘连蛋白511
‑
e8包被的塑料培养皿中，并且在存在y27632(rock抑制物质，10μm)的条件下，在essential 8培养基中进行无饲养细胞的培养。当使用6孔平板(由iwaki制造，对于细胞培养，培养面积为9.4cm2)作为上述塑料培养皿时，
将关于上述分散成单个细胞的人ips细胞的铺板细胞数目调整为6x103。接种后一天，将全部量的培养基更换为不含y27632的essential 8培养基。然后，1
‑
2天一次，将全部量的培养基更换为不含y27632的essential 8培养基。之后，接种后6天，细胞培养至亚汇合(60％的培养面积被细胞覆盖)。
[0314]
通过使用tryple select (life technologies)，将这样制备的亚汇合的人ips细胞用细胞分散液处理，并且通过吹吸操作进一步分散成单个细胞，并且将上述分散成单个细胞的人ips细胞以1.2
×
104个细胞/孔悬浮在非细胞粘附性的96孔培养板(primesurface 96v型底平板，由sumitomo bakelite制造)中的100μl无血清培养基中。然后，将细胞在37℃，5％co2进行悬浮培养。关于用于此的无血清培养基(gfcdm ksr)，使用作为补充了10％ksr、450μm 1
‑
一硫代甘油、1x化学成分确定的脂质浓缩物的f
‑
12培养基与imdm培养基的1：1混合物的无血清培养基。在悬浮培养开始时(在悬浮培养开始后的第0天，步骤2开始)，使用补充了y27632(终浓度为20μm)的无血清培养基(图3a
‑
d)。这些中，在特定条件下，使用补充了y27632(终浓度为20μm)和作为shh信号转导途径激活物质的sag(300nm)的无血清培养基(图3c，d)。到悬浮培养开始后第2天，在具有和不具有sag添加的两种条件下都形成细胞聚集体(步骤2结束，并且步骤3开始)。在悬浮培养开始后第3天，添加不含y27632和sag的无血清培养基(50μl)。在悬浮培养开始后第6天，将一半量的培养基更换为不含y27632和sag但包含或不包含人重组bmp4(由r&d制备)的培养基，以将外源性人重组bmp4的终浓度设定为1.5nm(图3b，d)或产生不含外源性人重组bmp4的培养基(图3a，c)。然后，将一半量的培养基更换为上述不含y27632、sag和人重组bmp4的无血清培养基，每2
‑
4天更换一次。将在悬浮培养开始后第18天的这样制备的细胞聚集体在倒置显微镜(biorevo，由keyence制造)下进行亮视野观察(图3a
‑
d)。结果，发现在悬浮培养开始时不添加sag并且在悬浮培养过程中不添加bmp4的条件(条件1，图3a)和在悬浮培养开始时不添加sag并且在悬浮培养过程中添加bmp4的条件(条件2，图3b)下，都有不少于80％的细胞聚集体塌陷，并且神经组织形成效率差。另一方面，发现在悬浮培养开始时添加sag并且在悬浮培养过程中不添加bmp4的条件下(条件3，图3c)，和在悬浮培养开始时添加sag并且在悬浮培养过程中添加bmp4的条件下(条件4，图3d)，细胞聚集体得以维持，并且有效地形成神经上皮结构。
[0315]
此外，在悬浮培养开始后第18天，观察到多种聚集体的形状，并且分类为良好的形状(图4，黑色条，良好的聚集体，包含多个神经上皮)、中等水平的形状(图4，灰色条，良好的聚集体但是神经上皮比例低)和差的形状(图4，白色条，聚集体塌陷，不含神经上皮)并定量。结果，在条件1(图3a)，良好的形状的比例低于3％，并且差的形状的比例为71％(图4，对照)。相反，在条件3(图3c)，良好的形状的比例为93％，并且差的形状的比例为6％(图4，sag)。
[0316]
从这些结果，发现关于在essential 8培养基中培养的无饲养细胞的人ips细胞，通过在悬浮培养开始时添加shh信号转导途径激活物质提高神经组织形成的效率。
[0317]
实施例3：通过在步骤1中使用essential 8作为无饲养细胞培养基并且在开始悬浮培养时使用shh转导途径激活物质由人ips细胞产生视网膜组织的实施例
[0318]
按照“scientific reports，4，3594(2014)”中所述的方法，在无饲养细胞的条件下培养人ips细胞(201b7株，获自京都大学(kyoto university))。关于无饲养细胞的培养基，使用essential8培养基(由lifetechnologies制造)，并且关于无饲养细胞的构架，使用
层粘连蛋白511
‑
e8(由nippi，inc.制造)。
[0319]
关于具体的维持培养操作，首先将亚汇合的人ips细胞(201b7株)用pbs洗涤，并且使用tryple select(由life technologies制造)分散成单个细胞。然后，将上述分散成单个细胞的人ips细胞接种在用层粘连蛋白511
‑
e8包被的塑料培养皿中，并且在存在y27632(rock抑制物质，10μm)的条件下，在essential 8培养基中进行无饲养细胞的培养。当使用6孔平板(由iwaki制造，用于细胞培养，培养面积为9.4cm2)作为上述塑料培养皿时，将关于上述分散成单个细胞的人ips细胞的铺板细胞数目调整为6x103。接种后一天，将全部量的培养基更换为不含y27632的essential 8培养基。然后，1
‑
2天一次，将全部量的培养基更换为不含y27632的essential 8培养基。之后，接种后6天，细胞培养至亚汇合(60％的培养面积被细胞覆盖)。
[0320]
通过使用tryple select(由life technologies制造)，将这样制备的亚汇合的人ips细胞用细胞分散液处理，并且通过吹吸操作进一步分散成单个细胞，并且将上述分散成单个细胞的人ips细胞以1.2
×
104个细胞/孔悬浮在非细胞粘附性的96孔培养板(primesurface 96v型底平板，sumitomo bakelite)中的100μl无血清培养基中。然后，将细胞在37℃，5％co2进行悬浮培养。关于用于此的无血清培养基(gfcdm ksr)，使用作为补充了10％ksr、450μm 1
‑
一硫代甘油、1x化学成分确定的脂质浓缩物的f
‑
12培养基与imdm培养基的1：1混合物的无血清培养基。在悬浮培养开始时(在悬浮培养开始后的第0天，步骤2开始)，使用补充了sag(终浓度为300μm)(作为shh信号转导途径激活物质)和y27632(20μm)的无血清培养基(图5a
‑
d)。到悬浮培养开始后第2天，形成细胞聚集体。在悬浮培养开始后第3天，加入不含y27632和sag的无血清培养基(50μl)。在悬浮培养开始后第6天，将一半量的培养基更换为不含y27632和sag但包含或不包含人重组bmp4(由r&d制备)的培养基，以将外源性人重组bmp4的浓度调整为1.5nm(55ng/ml)。然后，将一半量的培养基更换为上述不含y27632、sag和人重组bmp4的无血清培养基，每2
‑
4天更换一次。在悬浮培养开始后第18天，将这样制备的细胞聚集体在倒置显微镜(biorevo，由keyence制造)下进行亮视野观察。结果，发现形成了神经上皮。
[0321]
将在开始悬浮培养后第18天的细胞聚集体用4％多聚甲醛固定，产生冷冻切片。将这些冷冻切边针对chx10(抗
‑
chx10抗体，exalpha，绵羊)(其是一种视网膜组织标记)或rx(抗
‑
rx抗体，由takara制备，豚鼠)(其是一种视网膜组织标记)免疫染色。结果，发现在涉及在悬浮培养的第0天添加shh信号转导途径激活物质并且在悬浮培养的第6天不添加bmp信号转导途径激活物质的条件下，总细胞中rx
‑
阳性细胞的比例不大于3％，并且chx10
‑
阳性细胞的比例也不大于3％(图5a，c)。另一方面，发现在涉及在悬浮培养的第0天添加shh信号转导途径激活物质并且在悬浮培养的第6天添加bmp信号转导途径激活物质的条件下，总细胞中rx
‑
阳性细胞的比例不低于40％，并且chx10
‑
阳性细胞的比例也不低于40％(图5b，d)。此外，连续切片分析表明，在具有高比例(不低于95％)的chx10
‑
阳性细胞的神经组织中，rx也是强阳性的(图5b，d)。从这些结果，发现通过在步骤2悬浮培养开始时添加shh信号转导途径激活物质并且在步骤3的悬浮培养期间添加作为分化诱导物质的bmp信号转导途径激活物质，能够由无饲养细胞的人ips细胞有效地产生视网膜组织。
[0322]
实施例4：通过在步骤2中使用shh转导途径激活物质并且在步骤3中使用bmp4由人ips细胞产生视网膜组织的实施例
[0323]
按照“scientific reports，4，3594(2014)”中所述的方法，将人ips细胞(1231a3株，获自京都大学(kyoto university))进行无饲养细胞培养。关于无饲养细胞的培养基，使用stemfit培养基(ak03，由ajinomoto co.，inc.制造)，并且关于无饲养细胞的构架，使用层粘连蛋白511
‑
e8(由nippi，inc.制造)。
[0324]
关于具体的维持培养操作，首先将亚汇合的人ips细胞(1231a3株)用pbs洗涤，并且使用tryple select(由life technologies制造)分散成单个细胞。然后，将上述分散成单个细胞的人ips细胞接种在用层粘连蛋白511
‑
e8包被的塑料培养皿中，并且在存在y27632(rock途径抑制物质，10μm)的条件下，在stemfit培养基中进行无饲养细胞的培养。当使用6孔平板(由iwaki制造，用于细胞培养，培养面积为9.4cm2)作为上述塑料培养皿时，将关于上述分散成单个细胞的人ips细胞的铺板细胞数目调整为6x103。接种后一天，将培养基更换为不含y27632的stemfit培养基。然后，1
‑
2天一次，将培养基更换为不含y27632的stemfit培养基。之后，接种后6天，细胞培养至亚汇合(60％的培养面积被细胞覆盖)。
[0325]
通过使用tryple select(lifetechnologies)，将上述亚汇合的人ips细胞分散成单个细胞，并且将上述分散成单个细胞的人ips细胞以1.2
×
104个细胞/孔悬浮在非细胞粘附性的96孔培养板(primesurface 96v型底平板，sumitomo bakelite)中的100μl无血清培养基中，并且在37℃，5％co2进行悬浮培养。关于用于此的无血清培养基(gfcdm ksr)，使用作为补充了10％ksr、450μm1
‑
一硫代甘油、1x化学成分确定的脂质浓缩物的f
‑
12培养基与imdm培养基的1∶1混合物的无血清培养基。在悬浮培养开始时(在悬浮培养开始后的第0天，步骤2开始)，向上述无血清培养基中加入y27632(终浓度为20μm)和sag(终浓度为300nm)。到悬浮培养开始后第2天，形成细胞聚集体(步骤2结束，步骤3开始)。
[0326]
此处，关于步骤3，培养在下述条件1和条件2下进行。
[0327]
在条件1下( bmp，d3)，在开始悬浮培养后第3天添加不含y27632和sag但是包含人重组bmp4(由r&d制备)的培养基(50μl)，以使外源性人重组bmp4的终浓度调整为1.5nm(总培养基量为150μl)。在悬浮培养开始后第6天，将一半量的培养基更换为上述不含y27632、sag和人重组bmp4的无血清培养基。
[0328]
在条件2下( bmp，d6)，在开始悬浮培养后第3天添加不含y27632、sag和人重组bmp4的无血清培养基(50μl)。在悬浮培养开始后第6天，将一半量的培养基更换为上述不含y27632和sag但是包含人重组bmp4(由r&d制备)的培养基，以使外源性人重组bmp4的终浓度调整为1.5nm。
[0329]
在条件1和条件2下开始细胞的悬浮培养后第6天或以后，将一半量的培养基更换为上述不含y27632、sag和人重组bmp4的无血清培养基，每2
‑
4天更换一次。在悬浮培养开始后第18天，在倒置显微镜下观察形状。发现在条件1和条件2下，细胞聚集体得以维持，并且形成神经组织。
[0330]
将在悬浮培养开始后第18天的这样制备的细胞聚集体(其通过由无饲养细胞的ips细胞作为起始材料在步骤2中添加sag产生)用4％多聚甲醛固定，产生冷冻切片。将这些冷冻切边针对chx10(抗
‑
chx10抗体，exalpha，绵羊)(其是一种视网膜组织标记)或rx(抗
‑
rx抗体，由takara制备，豚鼠)(其是一种视网膜组织标记)免疫染色。在倒置荧光显微镜下观察这些免疫染色的切片。结果，发现对于在条件1和条件2下的细胞二者，总细胞中rx
‑
阳性细胞的比例为约40％，chx10
‑
阳性细胞的比例也为约40％(图6)。此外，从连续切片分析
hedgehog信号转导途径激活物质由人ips细胞产生视网膜组织的实施例
[0339]
按照“scientific reports，4，3594(2014)”中所述的方法，在无饲养细胞的条件下培养人ips细胞(201b7株，获自京都大学(kyoto university))。关于无饲养细胞的培养基，使用stem fit培养基(ak03；由ajinomoto co.，inc.制造)，并且关于无饲养细胞的构架，使用层粘连蛋白511
‑
e8(由nippi，inc.制造)。
[0340]
关于具体的维持培养操作，首先将亚汇合的人ips细胞(201b7株)用pbs洗涤，并且使用tryple select(由life technologies制造)分散成单个细胞。然后，将上述分散成单个细胞的人ips细胞接种在用层粘连蛋白511
‑
e8包被的塑料培养皿中，并且在存在y27632(rock途径抑制物质，10μm)的条件下，在stem fit培养基中进行无饲养细胞的培养。当使用6孔平板(由iwaki制造，用于细胞培养，培养面积为9.4cm2)作为上述塑料培养皿时，将关于上述分散成单个细胞的人ips细胞的铺板细胞数目调整为1.3x104。接种后一天，将全部量的培养基更换为不含y27632的stem fit培养基。然后，1
‑
2天一次，将全部量的培养基更换为不含y27632的stem fit培养基。之后，接种后6天，细胞培养至亚汇合(60％的培养面积被细胞覆盖)。
[0341]
通过使用tryple select(由life technologies制造)，将这样制备的亚汇合的人ips细胞用细胞分散液处理，通过吹吸操作进一步分散成单个细胞，并且将上述分散成单个细胞的人ips细胞以1.0
×
104个细胞/孔悬浮在非细胞粘附性的96孔培养板(sumilon spheroid v型底平板primesurface96v型底平板，sumitomo bakelite)中的100μl无血清培养基中。然后，将细胞在37℃，5％co2进行悬浮培养。关于用于此的无血清培养基(gfcdm ksr)，使用作为补充了10％ksr、450μm 1
‑
一硫代甘油、1x化学成分确定的脂质浓缩物的f
‑
12培养基与imdm培养基的1∶1混合物的无血清培养基。在悬浮培养开始时(在悬浮培养开始后的第0天，步骤2开始)，使用补充了y27632(终浓度为20μm)并进一步补充了sag(终浓度为30nm)、purmorphamine(由wako制造，终浓度为0.2μm)或人重组shh(由r&d制造，重组n
‑
端，终浓度为50ng/ml)(作为shh信号转导途径激活物质)的上述无血清培养基(图8)。在悬浮培养开始后第2天，形成细胞聚集体。在悬浮培养开始后第3天，加入不含y27632、sag，purmorphamine和重组shh但是包含人重组bmp4的培养基(50μl)，以将外源性人重组bmp4的终浓度调整为1.5nm(55ng/ml)。在悬浮培养开始后第6天，将一半量的培养基更换为不含y27632、sag、purmorphamine、重组shh和人重组bmp4的无血清培养基。然后，将一半量的培养基更换为上述不含y27632、sag和人重组bmp4的无血清培养基，每2
‑
4天更换一次。将在悬浮培养开始后第18天的这样制备的细胞聚集体在倒置显微镜(biorevo，由keyence制造)下进行亮视野观察。结果，发现形成了神经上皮。
[0342]
将在开始悬浮培养后第18天的细胞聚集体用4％多聚甲醛固定，产生冷冻切片。将这些冷冻切边针对chx10(抗
‑
chx10抗体，exalpha，绵羊)(其是一种视网膜组织标记)免疫染色。结果，发现在涉及在悬浮培养的第0天添加sag、pma或shh作为shh信号转导途径激活物质和在悬浮培养的第3天添加bmp4的条件下，总细胞中chx10
‑
阳性细胞的比例不大于30％(图8，d
‑
f)。从这些结果，发现通过在步骤2开始悬浮培养时添加sag、purmorphamine和重组shh中的任一种作为shh信号转导途径激活物质，并且在步骤3的悬浮培养过程中添加bmp信号转导途径激活物质作为分化诱导物质，能够由无饲养细胞培养的人ips细胞有效地产生视网膜组织。
[0343]
实施例7：通过在步骤2中使用sag、purmorphamine或重组shh蛋白作为sonic hedgehog信号转导途径激活物质并且在步骤3中使用bmp4由人ips细胞产生视网膜组织的实施例
[0344]
按照“scientific reports，4，3594(2014)”中所述的方法，在无饲养细胞的条件下培养人ips细胞(1231a3株，获自京都大学(kyoto university))。关于无饲养细胞的培养基，使用stem fit培养基(ak03；由ajinomoto co.，inc.制造)，并且关于无饲养细胞的构架，使用层粘连蛋白511
‑
e8(由nippi，inc.制造)。
[0345]
通过使用tryple select(由life technologies制造)，将按照实施例6所述的方法制备的亚汇合的人ips细胞用细胞分散液处理，通过吹吸操作进一步分散成单个细胞，并且将上述分散成单个细胞的人ips细胞以1.0x104个细胞/孔悬浮在非粘附性96孔培养板(sumilon spheroid v型底平板primesurface 96v型底平板，sumitomo bakelite)中的100μl无血清培养基中。然后，将细胞在37℃，5％co2进行悬浮培养。关于用于此的无血清培养基(gfcdm ksr)，使用作为补充了10％ksr、450μm 1
‑
一硫代甘油、1x化学成分确定的脂质浓缩物的f
‑
12培养基与imdm培养基的1∶1混合物的无血清培养基。在悬浮培养开始时(在悬浮培养开始后的第0天，步骤2开始)，使用补充了y27632(终浓度为20μm)并进一步补充了sag(终浓度为30nm)、purmorphamine(pma，由wako制造，终浓度为0.2μm)或人重组shh(由r&d制造，重组n
‑
端，终浓度为300ng/ml)(作为shh信号转导途径激活物质)的上述无血清培养基或不含shh信号转导途径激活物质的无血清培养基(图9)。在悬浮培养开始后第2天，细胞聚集体形成。在悬浮培养开始后第3天，加入不含y27632、sag、purmorphamine和shh蛋白但是包含人重组bmp4(r&d)的培养基(50μl)，以将外源性人重组bmp4的终浓度调整为1.5nm(55ng/ml)。在开始悬浮培养后第6天，将一半量的培养基更换为不含y27632、sag、purmorphamine、shh蛋白和人重组bmp4的无血清培养基。然后，将一半量的培养基更换为上述不含y27632、sag、purmorphamine、重组shh和人重组bmp4的无血清培养基，每2
‑
4天更换一次。在悬浮培养开始后第18天，将这样制备的细胞聚集体在倒置显微镜(biorevo，由keyence制造)下进行亮视野观察。结果，发现在步骤2不添加外源性shh信号转导途径激活物质的条件下，细胞聚集体不生长并且没有形成神经上皮(图9：对照)，而在步骤2添加sag、pma或重组shh蛋白的条件下，细胞聚集体生长并且形成了神经上皮(图9：sag，pma，shh)。
[0346]
将在开始悬浮培养后第18天的细胞聚集体用4％多聚甲醛固定，产生冷冻切片。将这些冷冻切边针对chx10(抗
‑
chx10抗体，exalpha，绵羊)(其是一种视网膜组织标记)免疫染色。结果，发现在涉及在悬浮培养的第0天添加pma，和在悬浮培养的第3天添加bmp4的条件下，总细胞中chx10
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阳性细胞的比例不大于60％(图9，下部的图pma)。另外，发现甚至在悬浮培养的第0天添加sag或shh的条件下，细胞聚集体包含chx10
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阳性细胞。从这些结果，发现通过在步骤2悬浮培养开始时添加sag、purmorphamine和重组shh中的任一种作为shh信号转导途径激活物质并且在步骤3的悬浮培养过程中添加bmp信号转导途径激活物质作为分化诱导物质，可以由无饲养细胞的人ips细胞产生视网膜组织。
[0347]
实施例8：通过在悬浮培养开始时使用shh信号转导途径激活物质并且在步骤3中使用bmp4使由仙台病毒建立的人ips细胞进行无饲养细胞的培养产生视网膜组织的实施例
[0348]
使用商购的仙台病毒载体(4种因子：oct3/4，sox2，klf4，c
‑
myc，由dnavec(现在的id pharma)制造的cytotune试剂盒)、stemfit培养基(ak03；由ajinomoto co.，inc.制造)
和层粘连蛋白511
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e8(由nippi，inc.制造)，并且基于life technologies的公布流程(ips 2.0仙台重新编程试剂盒(sendai reprogramming kit)，publication number man0009378，revision 1.0)和京都大学(kyoto university)的公布的流程(在无饲养细胞的条件下建立
·
维持培养人ips细胞，cira_ff
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ipsc_protocol_jp_v140310，http：//www.cira.kyoto
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u.ac.jp/j/research/protocol.html)中所述的方法，建立人ips细胞(dspc
‑
3株，由sumitomo dainippon pharma co.，ltd.建立)。
[0349]
按照scientific reports，4，3594(2014)中所述的方法，将人ips细胞(dspc
‑
3株)进行无饲养细胞培养。作为无饲养细胞的培养基，使用stemfit培养基(由ajinomoto co.，inc.制造)，并且作为无饲养细胞的构架，使用层粘连蛋白511
‑
e8(由nippi，inc.制造)。
[0350]
关于具体的维持培养操作，首先将亚汇合的人ips细胞用pbs洗涤，并且通过使用tryple select(由life technologies制造)分散成单个细胞。然后，将上述分散成单个细胞的人ips细胞接种在用层粘连蛋白511
‑
e8包被的塑料培养皿中，并且在存在y27632(rock途径抑制物质，10μm)的条件下，在stem fit培养基中进行无饲养细胞的培养。当使用6孔平板(由1waki制造，对于细胞培养，培养面积为9.4cm2)作为上述塑料培养皿时，将关于上述分散成单个细胞的人ips细胞的铺板细胞数目调整为1.3x104。接种后一天，将全部量的培养基更换为不含y27632的stem fit培养基。然后，1
‑
2天一次，将全部量的培养基更换为不含y27632的stem fit培养基。之后，接种后6天，细胞培养至亚汇合(60％的培养面积被细胞覆盖)。
[0351]
通过使用tryple select(由life technologies制造)，将这样制备的亚汇合的人ips细胞用细胞分散液处理，通过吹吸操作进一步分散成单个细胞，并且将上述分散成单个细胞的人ips细胞以1.2x104个细胞/孔悬浮在非细胞粘附性的96孔培养板(sumilon spheroid v型底平板primesurface 96v型底平板，sumitomo bakelite)中的100μl无血清培养基中。然后，将细胞在37℃，5％co2进行悬浮培养。关于用于此的无血清培养基(gfcdm ksr)，使用作为补充了10％ksr、450μm 1
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一硫代甘油、1x化学成分确定的脂质浓缩物的f
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12培养基与imdm培养基的1∶1混合物的无血清培养基。在悬浮培养开始时(在悬浮培养开始后的第0天，步骤2开始)，使用补充了y27632(终浓度为20μm)并进一步补充了作为外源性shh信号转导途径激活物质的sag(终浓度为300nm)或没有补充sag(终浓度为0nm)的上述无血清培养基(图10)。在悬浮培养开始后第2天，形成细胞聚集体。在悬浮培养开始后第3天，加入不含y27632和sag但是包含或不包含人重组bmp4的培养基(50μl)，以将外源性人重组bmp4的终浓度调整为1.5nm(55ng/ml)或0nm。在悬浮培养开始后第6天，将一半量的培养基更换为不含y27632、sag和bmp4的无血清培养基。然后，将一半量的培养基更换为上述不含y27632、sag和bmp4的无血清培养基，每2
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4天更换一次。在悬浮培养开始后第22天，将这样制备的细胞聚集体在倒置显微镜(biorevo，由keyence制造)下进行亮视野观察。结果，发现在不添加shh信号转导途径激活物质的条件下，细胞聚集体的形成效率低(图10，对照)。另一方面，发现在悬浮培养开始时添加sag的条件下，细胞聚集体得以维持，并且形成神经上皮(图10，sag 300nm)。
[0352]
将在开始悬浮培养后第22天的细胞聚集体用4％多聚甲醛固定，产生冷冻切片。将这些冷冻切边针对chx10(抗
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chx10抗体，exalpha，绵羊)(其是一种视网膜组织标记)或rx(抗
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rx抗体，由takara制造，豚鼠)(其是一种视网膜组织标记)免疫染色。结果，发现在涉及
在悬浮培养的第0天添加sag并且在悬浮培养的第3天添加bmp4的条件下，总细胞中rx
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阳性细胞的比例为约10％，并且总细胞中chx10
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阳性细胞的比例也为约10％(图10)。此外，从连续切片分析来看，发现在chx10
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阳性细胞的神经组织中，rx也是强阳性的(图10)。从这些结果，可以证实通过在步骤2中的悬浮培养开始时添加shh信号转导途径激活物质和在步骤3中的悬浮培养过程中添加bmp信号转导途径激活物质作为分化诱导物质，也可以由使用仙台病毒建立的不含饲养细胞的人ips细胞产生视网膜组织。
[0353]
[工业实用性]
[0354]
根据本发明的制备方法，可以在不存在饲养细胞的条件下诱导多能干细胞向视网膜细胞分化，从而产生视网膜组织。本发明的制备方法是有用的，原因在于其能够产生用作药物产品候选化合物和其他化学物质的毒性和功效评价的材料、用于视网膜移植治疗的移植材料的应用测试或治疗的视网膜组织。
[0355]
本文引用的任何公布中公开的内容，包括专利、专利申请的说明书和科学文献，通过引用以它们在本文中公开的程度完全结合在本文中。
[0356]
本技术是基于在日本提交的专利申请号2014
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217868(申请日期：2014年10月24日)，其内容完全结合在本文中。