亚洲玉米螟NPFR蛋白、相关生物材料及应用的制作方法

亚洲玉米螟npfr蛋白、相关生物材料及应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及亚洲玉米螟npfr蛋白、相关生物材料及应用。


背景技术：

2.亚洲玉米螟(ostrinia furnacalis)属鳞翅目螟蛾科，是我国玉米生产上的重要害虫，严重影响玉米产量和质量。亚洲玉米螟分布广，南自海南三亚，北至黑龙江的黑河均有分布，分布区跨越的纬度很大，地理环境差异也很大。幼虫共5个龄期，低龄幼虫多潜藏在含糖量高、阴湿背光的幼嫩植物组织取食，而高龄幼虫则主要以钻蛀的方式在玉米茎杆、穗轴内取食，危害玉米的各个部位，使受害部分丧失功能，降低籽粒产量。
3.目前对亚洲玉米螟的防治措施主要是农业综合防治、生物防治和化学防治，其中化学防治的效果最快，广泛应用于实际生产中，但高毒高残留化学杀虫剂的大量使用使得玉米螟产生抗性并使天敌昆虫数量大大减少，因此玉米螟的绿色防控技术需要大力关注。


技术实现要素：

4.本发明提供了蛋白质或调控所述蛋白质编码基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在调控昆虫生长或制备调控昆虫生长的产品中的应用，所述蛋白质为如下a1)
‑
a3)任一种蛋白质：
5.a1)氨基酸序列如seq id no.2所示的蛋白质；
6.a2)将seq id no.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同生物学功能的蛋白质；
7.a3)与seq id no.2所示的氨基酸序列具有80％或80％以上同一性，来源于亚洲玉米螟且具有相同生物学功能的蛋白质。
8.将上述蛋白质命名为npfr蛋白。
9.上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existence cost，perresidue gap cost和lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
10.上述蛋白质中，所述80％以上的同一性可为至少81％、82％、85％、86％、88％、89％、91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。
11.上述应用中，所述调控蛋白质编码基因的表达物质可为进行如下6种调控中至少一种调控的物质：1)在所述基因转录水平上进行的调控；2)在所述基因转录后进行的调控(也就是对所述基因的初级转录物的剪接或加工进行的调控)；3)对所述基因的rna转运进行的调控(也就是对所述基因的mrna由细胞核向细胞质转运进行的调控)；4)对所述基因的
翻译进行的调控；5)对所述基因的mrna降解进行的调控；6)对所述基因的翻译后的调控(也就是对所述基因翻译的蛋白质的活性进行调控)。
12.可选地，根据上述的应用，所述调控昆虫生长为抑制昆虫生长，调控所述蛋白质编码基因的表达物质为抑制或降低npfr蛋白编码基因表达的核酸分子。
13.本发明还提供了npfr蛋白的相关生物材料在制备调控昆虫生长的产品中的应用，
14.所述相关生物材料为下述任一种：
15.a1)抑制或降低npfr蛋白编码基因表达的核酸分子；
16.a2)表达a1)所述核酸分子的编码基因；
17.a3)表达a1)所述核酸分子的表达盒、或含有a2)所述编码基因的表达盒；
18.a4)表达a1)核酸分子的重组载体、含有a2)所述编码基因的重组载体、或含有a3)所述表达盒的重组载体；
19.a5)表达a1)核酸分子的重组微生物、含有a2)所述编码基因的重组微生物、含有a3)所述表达盒的重组微生物、或含有a4)所述重组载体的重组微生物。
20.其中，所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因组dna或重组dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna或hnrna等。
21.a1)所述核酸分子抑制或降低npfr蛋白编码基因表达可通过基因敲除或基因沉默实现。
22.所述基因敲除(geneknockout)是通过dna序列的改变使特定靶基因失活。
23.所述基因沉默是指在不损伤原有dna的情况下使基因不表达或低表达的现象。基因沉默以不改变dna序列为前提，使基因不表达或低表达。基因沉默可发生在两种水平上，一种是由于dna甲基化、异染色质化以及位置效应等引起的转录水平的基因沉默，另一种是转录后基因沉默，即在基因转录后的水平上通过对靶标rna进行特异性抑制而使基因失活，包括反义rna、共抑制(co
‑
suppression)、基因压抑(quelling)、rna干扰(rnai)和微小rna(mirna)介导的翻译抑制等。
24.可选地，根据上述的应用，a1)所述核酸分子为双链rna分子。所述双链rna分子的一条链序列可为npfr蛋白编码基因中的200
‑
500bp片段转录得到的序列，例如可为seq id no.1所示序列的第87位
‑
第648位片段转录得到的序列。所述双链rna分子还可由相互互补的茎部和环部组成，所述茎部的序列可为npfr蛋白编码基因中的200
‑
500bp片段转录得到的序列，例如可为seq id no.1所示序列的第87位
‑
第558位片段转录得到的序列。
25.可选地，根据上述的应用，a2)所述编码基因如式(i)所示：seq反向
‑
x
‑
seq正向(i)；所述seq正向的序列为权利要求1所述蛋白质编码基因中的200
‑
500bp片段序列；所述seq反向的序列与所述seq正向的序列反向互补；所述x是所述seq正向与所述seq反向之间的间隔序列，所述x与所述seq正向及所述seq反向均不互补。例如a2)所述编码基因序列如seq id no.5所示。
26.可选地，根据上述的应用，npfr蛋白编码基因为如下b1)或b2)所述基因：
27.b1)编码区序列为seq id no.1所示的dna分子；
28.b2)序列为genbank登录号为xm_028321656.1所示的dna分子。
29.本发明还提供了蛋白质或dna分子，所述蛋白质为上述a1)所述蛋白质；所述dna分子为上述b1)所述基因。
30.本发明还提供了生物材料或含有所述生物材料的调控昆虫生长的产品，所述生物材料为上述a1)
‑
a5)中的任一种所述的相关生物材料。
31.本发明还提供了调控昆虫生长的方法，包括采用所述调控npfr蛋白编码基因的表达物质或调控npfr蛋白活性或含量的物质饲喂所述昆虫。
32.所述所述调控npfr蛋白编码基因的表达物质可为上述双链rna分子，具体可为上述双链rna分子和人工饲料按比例混合凝固后饲喂所述昆虫幼虫。这也是一种对幼虫持续影响且无虫体损伤的抑制目的基因表达方法。
33.上文中，所述调控昆虫生长可通过调控所述昆虫的取食量、调控所述昆虫的体长、调控所述昆虫的体重和/或抑制或降低所述昆虫中npfr蛋白编码基因表达实现。
34.上文中，所述昆虫可为如下任一种：
35.鳞翅目昆虫；
36.天蛾科昆虫；
37.螟蛾科昆虫；
38.亚洲玉米螟。
39.本发明实施例成功克隆获得了亚洲玉米螟神经肽受体基因(npfr基因)的编码区序列，并提供了一种亚洲玉米螟npfr基因的干扰rna(dsrna)，该干扰rna不仅显著抑制npfr基因的表达，而且对亚洲玉米螟取食也有显著的抑制作用。证明神经肽受体在昆虫取食方面发挥重要的作用。
40.本发明实施例使用工程菌高效大量合成dsrna，较传统试剂盒合成dsrna相比，不仅可以通过饲喂昆虫干扰掉目的基因，避免注射的方法对昆虫造成机械损伤，而且大大降低了生产成本，推动田间dsrna试剂的开发和害虫防治新技术的发展，为绿色环保抗虫试剂的开发提供理论依据，最终达到绿色防治害虫的目的。
41.本发明实施例从分子层次研究npfr对亚洲玉米螟幼虫取食的调控和影响，对害虫防治新技术的开发奠定基础和提供理论依据。
附图说明
42.图1为实施例1npfr基因编码区pcr产物电泳图。
43.图2为实施例1npfr蛋白跨膜区预测图。
44.图3为实施例1npfr蛋白与其它昆虫氨基酸序列多重比对图，其中，tm为跨膜区。
45.图4为实施例2npfr片段1和npfr片段2pcr产物电泳图。
46.图5为实施例2npfr片段1、npfr片段2和pet28a( )双酶切产物电泳图。
47.图6为实施例2实验主要流程。
48.图7为实施例2pet28a( )
‑
npfr载体菌液pcr产物鉴定电泳图。
49.图8为实施例2pet28a( )
‑
npfr载体双酶切产物鉴定电泳图。
50.图9为实施例2dsnpfr/gfp诱导表达提取总rna鉴定电泳图。
51.图10为实施例4npfr定量引物验证鉴定图。
52.图11为实施例4npfr和gfp定量标准曲线图。
53.图12为实施例4亚洲玉米螟的脂肪体与中肠的npfr基因相对表达量检测。
54.图13为实施例4亚洲玉米螟5龄幼虫饲喂dsnpfr人工饲料对取食量的影响。
55.图14为实施例5亚洲玉米螟5龄幼虫饲喂dsnpfr/gfp人工饲料后饲料示意图。
56.图15为实施例5亚洲玉米螟5龄幼虫饲喂dsnpfr/gfp人工饲料形态比较。
57.图16为实施例5亚洲玉米螟5龄幼虫饲喂dsnpfr/gfp人工饲料体长比较。
58.图17为实施例5亚洲玉米螟5龄幼虫饲喂dsnpfr/gfp人工饲料体重比较。
59.ns表示无差异，*表示p＜0.05，****表示p＜0.0001。
具体实施方式
60.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
61.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
62.采用graphpad prism8.0.2统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值
±
标准偏差表示，采用ttests检验。
63.pet28a( )载体，厂家tiandz，货号60908
‑
2793y。
64.实施例1、亚洲玉米螟npfr基因编码区cdna的克隆与分析
65.a总rna提取
66.(1)取5头正常生长的亚洲玉米螟5龄幼虫，置于1.5ml无酶离心管中，加入100μlrnaiso plus(takara，大连)，置于冰上用电动研磨棒充分研磨，再加入400μlrnaiso plus，上下晃动混匀后，室温静置5min，使核酸蛋白复合物完全分离。
67.(2)加入100μl氯仿，剧烈涡旋震荡15sec，室温静置5min，使有机相和无机相迅速分离，从而使蛋白和rna脱离，rna进入水相。
68.(3)12000rpm、4℃离心15min，离心后样品分成三层：上层无色的水相，中间层和下层黄色有机相。rna主要分布在上层水相中，小心吸取200μl上层水相移至新的rnase
‑
free离心管中(移取时枪头不能触碰管壁和中间层)。
69.(4)缓慢向离心管中加入500μl的异丙醇，混匀，室温放置10min，沉淀rna。
70.(5)12000rpm、4℃离心10min，弃上清。
71.(6)加入500μl75％乙醇(rnase
‑
free dh2o配置)洗涤沉淀，7500rpm、4℃离心5min，倒出液体(注意不要倒出沉淀)，剩余少量液体用枪头缓慢吸出(注意不要吸到沉淀)。
72.(7)重复步骤(6)。
73.(8)打开离心管盖，室温干燥后，加入20μl rnase
‑
free dh2o溶解沉淀，所得溶液即为总rna。
74.(9)提取的总rna用核酸蛋白测定仪检测浓度和纯度，并记录数据；用1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性。
75.b第一链cdna的合成
76.以提取的总rna为模板，按照primescript
tm rt reagent kit with gdna eraser(perfect real time)反转录试剂盒说明书(takara，大连)合成单链cdna，具体步骤如下：
77.(1)去除基因组dna反应：试剂盒要求20μl反转录反应体系中，总rna最多可使用1μ
g。去除基因组dna的10μl反应体系为：2μl 5
×
gdna eraser buffer、1μl gdna eraser、v(1μg)总rna、10
‑
vμl rnase
‑
free dh2o。将反应液顺时离心，置于pcr仪中42℃，反应2min。
78.(2)反转录反应：20μl反转录体系为：10μl步骤1反应液、1μl primescript rt enzyme mix i、1μl rt primer mix、4μl 5
×
primerscript buffer 2(for real time)、4μl rnase
‑
free dh2o。将上述反应液混合均匀，置于pcr仪中42℃15min，85℃5s进行反转录反应，反应产物(即第一链cdna)
‑
20℃保存。
79.c npfr基因编码区的pcr扩增
80.从ncbi数据库中下载亚洲玉米螟npfr基因的序列(genbank accession number：xm_028321656.1，2019年3月12日)，orffinder在线网站预测其编码区，按照引物设计要求，利用primer premier 5.0软件设计编码区的序列引物npfr
‑
cds
‑
f和npfr
‑
cds
‑
r。
81.npfr
‑
cds
‑
f：atgcctttttatgatgatatgacc
82.npfr
‑
cds
‑
r：tcagaaaatctgagagcactggg
83.pcr反应体系：10μl 2
×
taq mastermix、8μlrnase
‑
free dh2o、0.5μl npfr
‑
cds
‑
f/r引物、1μl第一链cdna。吸打混匀后瞬时离心，然后置于pcr仪中进行扩增。
84.pcr扩增程序：95℃预变性3min；95℃变性30s，60℃退火1min，72℃延伸30s，共35个循环；72℃终延伸10min，4℃保存。
85.d pcr产物纯化
86.用1％的琼脂糖凝胶检测pcr产物，结果如图1所示，左侧条带为marker，右侧条带为pcr产物电泳条带，在1000bp处出现单一条带，对其切胶回收，具体步骤按照omega gel extraction kit试剂盒说明书进行。
87.e pcr产物与
‑
blunt zero cloning kit载体连接
88.反应体系为4μl胶回收产物和1μl
ꢀ‑
blunt zero cloning vector，吸打混匀，37℃反应30min。
89.f转化
90.将5μl连接产物于50μl trans1
‑
t1感受态细胞中，轻弹混匀后冰浴20min，42℃金属浴热激30s，立即置于冰上2min，加250μl lb液体培养基，200rpm、37℃培养1h。取200μl菌液涂于氨苄培养基，37℃倒置过夜培养。
91.待单菌落长至0.5mm时，挑取白色菌落(选择靠近培养基边缘，较大的菌落)，置于加入1 000μl lb(含抗生素氨苄)的1.5ml离心管中，37℃，220rpm，培养7
‑
8h。
92.g菌落pcr检测与测序
93.取1μl培养的菌液与5μl 2
×
taq master mix、3μl ddh2o、0.5μl m13f、0.5μl m13r混合均匀，94℃预变性5min；94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min进行pcr反应，用1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，如果含有目的条带(即长度约为1149bp的条带)，挑选三个pcr克隆菌液送公司测序。
94.引物m13f：cgccagggttttcccagtcacgac
95.引物m13r：agcggataacaatttcacacagga
96.成功获得长度为1149bp的cdna编码区序列如seq id no.1所示；利用expasy数据库的translate工具(http://www.expasy.org/translate)将核苷酸序列翻译成氨基酸序列如seq id no.2所示，其编码382个氨基酸残基；用protparam工具(http://
web.expasy.org/protparam/)预测氨基酸组成、分子量和等电点，编码蛋白的分子量为42.86kda，等电点为9.33；conserved domains(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/structure/cdd/wrpsb.cgi)进行蛋白功能域预测，发现ofnpfr(即序列如seq id no.2所示的蛋白质)与报道的g蛋白偶联受体结构一样，含有7个跨膜结构域，见图2；多重比较显示ofnpfr与家蚕(bmnpfr)、二化螟(csnpfr)、烟草天蛾(msnpfr)和蜡螟(gmnpfr)的相似性较高，分别为86.20％、90.84％、91.10％和91.62％，见图3。
97.实施例2、工程菌高效合成dsnpfr/gfp
98.本实施例实验主要流程如图6所示，反向连接片段1(npfr片段1或gfp片段1)和片段2(npfr片段2或gfp片段2)获得目的条带，将目的条带替换pet28a( )空载质粒的xhoi/ecori(npfr)和xhoi/xbai(gfp)识别位点间的小片段获得连接产物pet28a( )
‑
npfr和pet28a( )
‑
gfp，pet28a( )
‑
npfr和pet28a( )
‑
gfp分别转入表达感受态细胞后经iptg诱导，产生带有茎环结构的dsrna(dsnpfr或dsgfp)。
99.a分别按照实施例1的步骤c
‑
g对npfr片段1、npfr片段2、gfp片段1和gfp片段2进行扩增转化和测序。npfr片段1所使用的引物为npfr
‑1‑
f和npfr
‑1‑
r，npfr片段1序列如seq id no.1第87位
‑
第648位所示。npfr片段2所使用的引物为npfr
‑2‑
f和npfr
‑2‑
r，npfr片段2序列如seq id no.1第87位
‑
第558位所示。gfp片段1所使用的引物为gfp
‑1‑
f和gfp
‑1‑
r，gfp片段1序列如seq id no.3所示。gfp片段2所使用的引物为gfp
‑2‑
f和gfp
‑2‑
r，gfp片段2序列如seq id no.4所示。
100.上述使用的引物序列具体如下(下划线部分为酶切位点)：
101.npfr
‑1‑
f：ccggaattcaggcatacaggacccaaacg
102.npfr
‑1‑
r：tctagatgccttgatgggccagtcttctat
103.npfr
‑2‑
f：ccgctcgagaggcatacaggacccaaacg
104.npfr
‑2‑
r：tctagatgcaggggaggcgagggtgaag
105.gfp
‑1‑
f：atatctagacacaagttcagcgtgtcc
106.gfp
‑1‑
r：tataagcttgatatggctaacctggttcaccttgatgccgtt
107.gfp
‑2‑
f：tatctcgagcacaagttcagcgtgtcc
108.gfp
‑2‑
r：atcaagcttacctgccaaaacgaacgttgtggctgttgtagt
109.pcr产物用1％的凝胶电泳检测，结果如图4所示，图4中npfr片段1(片段1)和npfr片段2(片段2)分别在500bp有单一条带，将测序正确的菌液按照steadypure plasmid dna extraction kit ag21001试剂盒说明书提取质粒。
110.b将上步得到的片段质粒以及pet28a( )空载质粒分别进行双酶切，酶切体系如下：
[0111][0112]
混匀，37℃孵育1.5h，65℃加热10min使酶失活。
[0113]
用1％的琼脂糖凝胶检测酶切产物，结果如图5所示，npfr片段1(片段1)和npfr片段2(片段2)在500bp处有单一条带，说明酶切成功。将目的条带切下，按照omega gel extraction kit试剂盒说明书对其进行产物纯化。
[0114]
c使用t4连接酶将酶切后的两个目的条带(即npfr片段1和npfr片段2)与相应线性pet28a( )载体连接，连接体系如下：
[0115][0116]
混匀，20℃孵育1h，65℃加热10min使酶失活，获得连接产物pet28a( )
‑
npfr。pet28a( )
‑
npfr是将pet28a( )空载质粒的xhoi和ecori识别位点间的小片段替换成序列为seq id no.5所示的片段，并保持pet28a( )空载质粒的其它核苷酸不变得到的重组载体。
[0117]
使用t4连接酶将酶切后的gfp片段1和gfp片段2与相应线性pet28a( )载体连接，含有gfp片段1和gfp片段2的连接体系与前述含有npfr片段1和npfr片段2的连接体系类似，不同之处仅在于将npfr片段1和npfr片段2替换为gfp片段1和gfp片段2。混匀，20℃孵育1h，65℃加热10min使酶失活，获得连接产物pet28a( )
‑
gfp。pet28a( )
‑
gfp是将pet28a( )空载质粒的xhoi和xbai识别位点间的小片段替换成序列为seq id no.6所示的片段，并保持pet28a( )空载质粒的其它核苷酸不变得到的重组载体。
[0118]
d将连接产物pet28a( )
‑
npfr和pet28a( )
‑
gfp分别转化至trans1
‑
t1感受态细胞中，涂于含kan抗性的固体培养基中，并将菌落培养在含kan抗性的液体培养基中，摇好的菌液分别进行pcr验证。
[0119]
pet28a( )
‑
npfr pcr验证体系：
[0120][0121]
引物t7：taatacgactcactataggg
[0122]
pet28a( )
‑
gfp pcr验证体系与上述pet28a( )
‑
npfr pcr验证体系类似，不同之处仅在于将反向引物npfr
‑1‑
r和菌液替换成gfp
‑1‑
r和pet28a( )
‑
gfp的菌液。
[0123]
用1％的琼脂糖凝胶检测pcr产物，pet28a( )
‑
npfr pcr验证结果如图7所示，在750bp处有单一条带(泳道t71
‑
r)。
[0124]
e菌液按照steadypure plasmid dna extraction kit ag21001试剂盒说明书提取质粒。对pet28a( 、)
‑
npfr进行双酶切验证，体系为：
[0125][0126][0127]
将酶切产物用1％的凝胶验证，ecori和xhoi双酶切后长度为npfr片段1和npfr片段2的总长，为1034bp，ecori和xhai双酶切后为npfr片段1的长度，为562bp。如图8所示，ecori和xhoi双酶切的pcr产物在1000bp处有单一条带，ecori和xhai双酶切在500bp有单一条带。结合pcr和双酶切验证证明表达载体构建成功。将构建成功的表达载体转入表达感受态细胞bl21中，转入方法与连接产物转化至trans1
‑
t1感受态细胞一致，得到大量扩繁，过夜培养的菌液，按75％甘油：菌液＝1∶2的比例保存菌种。
[0128]
f dsrna的诱导表达
[0129]
成功转入表达载体的菌种按1∶1000的比例接种到含kan抗性的lb液体培养基中，37℃220rpm过夜培养。过夜培养的菌液按1∶150的比例接种到400ml具有kan抗性的lb液体培养基中，37℃220rpm培养3
‑
4h，使od值达到0.4左右。加入iptg，使其工作浓度为1mm，37℃220rpm诱导表达5h，诱导的菌液用75％乙醇固定法提取总rna，具体操作步骤如下：
[0130]
(1)诱导的菌液80℃水浴20min，使细胞破裂。
[0131]
(2)降至室温后，倒入250ml离心瓶中集菌，4℃6000g离心10min，弃上清。
[0132]
(3)加入15ml 75％乙醇(10
×
pbs配制)，涡旋振荡后静置5min，4℃6000g离心
10min，弃上清。
[0133]
(4)加入10ml 100mm nacl溶液，4℃静置2h。
[0134]
(5)4℃8000g离心10min，取上清。
[0135]
上清即为dsrna，对上清进行电泳检测，如图9所示，dsgfp(gfp)和dsnpfr(npfr)分别在500bp处有单一明亮条带，且与序列长度一致，说明dsrna诱导成功。
[0136]
实施例3、dsrna的饲喂
[0137]
先配制人工饲料，然后以人工饲料：干扰双链dsrna＝1g∶0.2mg的比例，将处理组dsnpfr和对照组dsgfp饲喂刚孵化的亚洲玉米螟5龄幼虫。
[0138]
亚洲玉米螟干扰双链dsrna人工饲料的配制如下：
[0139]
(1)称取大豆粉、玉米粉各150g，酵母粉90g，混匀，置于烘箱中，120℃烘1
‑
2h。
[0140]
(2)分别称取75g葡萄糖，4g抗坏血酸，加入400ml水充分搅拌并溶解后，倒入步骤1中的混合粉内，充分搅拌，发酵2h。
[0141]
(3)称量750ml水，倒入部分水溶解40g玉米粉，置于电磁炉上加热，不停搅拌防止糊锅，剩余的水溶解22g琼脂糖，待锅中沸腾后分几次加入，持续搅拌，直至液体沸腾且黏稠。待其冷切至60℃左右时，将其倒入步骤2的混合物中，充分搅拌。
[0142]
(4)称取5g山梨酸混入步骤3的混合物中，充分搅拌，获得人工饲料。
[0143]
(5)量取100g步骤4制备的人工饲料，加入10ml浓度为2000ng/μl的dsrna，混匀，获得0.02质量％干扰双链dsrna人工饲料，将其倒入铺有保鲜膜的盒中，放入4℃冰箱保存待用。用时取适量0.02质量％干扰双链dsrna人工饲料切成块状置于培养皿中，在亚洲玉米螟培养箱中放置一晚，去除多余水分，第二天饲喂刚孵化出的5龄幼虫。
[0144]
处理组的5龄幼虫采用实施例2获得的dsnpfr所制备的0.02质量％dsnpfr干扰双链dsrna人工饲料(下述简称dsnpfr人工饲料)饲喂，对照组的5龄幼虫采用实施例2获得的dsgfp所制备的0.02质量％dsgfp干扰双链dsrna人工饲料(下述简称dsgfp人工饲料)饲喂。
[0145]
实施例4、实时荧光定量pcr检测npfr基因的mrna水平
[0146]
a引物设计
[0147]
根据克隆获得的npfr基因序列设计特异性定量引物q
‑
npfr
‑
f和q
‑
npfr
‑
r，内参actin使用引物序列actin
‑
f和actin
‑
r。
[0148]
引物序列具体如下：
[0149]
q
‑
npfr
‑
f：atagaagactggcccatcaagaatg
[0150]
q
‑
npfr
‑
r：ctcgtggtccttcttctccc
[0151]
actin
‑
f：acggaggtggtaaccatcaaca
[0152]
actin
‑
r：acgcctccttcttggtgtcg
[0153]
b引物验证
[0154]
利用rt
‑
pcr技术对采用npfr基因引物对cdna模板(即实施例1制备的第一链cdna)进行扩增，20μl反应体系：10μl 2
×
taq mastermix、8μlrnase
‑
free dh2o、0.5μl q
‑
npfr
‑
f和q
‑
npfr
‑
r定量引物、1μl cdna模板。反应程序如下：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；72℃终延伸10min；4℃保存10min。用1％琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物条带是否单一。结果如图10所示，在200bp有单一明亮条带，说明引物特异性较好。
[0155]
c标准曲线
[0156]
用rnase
‑
free dh2o将cdna原液(即实施例1制备的第一链cdna)稀释为5个浓度梯度(30、3
‑1、3
‑2、3
‑3、3
‑4)，
[0157]
使用superreal荧光定量预混试剂(天根)配制20μl的反应体系：
[0158][0159][0160]
反应程序为：95℃预变性30s；95℃变性15min，60℃退火30s，72℃延伸30s，共40个循环；熔解曲线分析。结果如图11所示，左侧图为内参actin的标准曲线图，右侧图为npfr的标准曲线图。npfr和内参的扩增效率均在95％
‑
100％，符合要求。综合上述检测，引物特异性和扩增效率较好，可用于定量检测。
[0161]
d实时荧光定量pcr
[0162]
解剖获得实施例3中饲喂6h的干扰双链dsrna人工饲料幼虫脂肪体和中肠，分别提取总rna并反转为cdna。以cdna为模板，按照上步c中的定量反应体系和程序检测npfr的表达情况。处理组(dsnpfr)和对照组(dsgfp)每组处理10头幼虫，共3次生物学重复。采用2
‑
δδct
法(livak et al.2001)对数据分析。结果如图12所示，其中，a为脂肪体中npfr基因相对表达量，b为中肠中npfr基因相对表达量。脂肪体中对照组(dsgfp)的npfr表达量为0.94，处理组(dsnpfr)为0.15，中肠中对照组(dsgfp)的npfr表达量为1.00，处理组(dsnpfr)为0.62，饲喂dsnpfr处理组的npfr基因显著下调，说明dsnpfr干扰抑制亚洲玉米螟脂肪体和中肠中npfr基因的表达。
[0163]
实施例5、npfr干扰后幼虫取食量和形态的变化
[0164]
将刚孵化的体长和形态无差异的亚洲玉米螟5龄幼虫随机分为两组，处理组(dsnpfr)饲喂实施例3制备的dsnpfr人工饲料，对照组(dsgfp)饲喂实施例3制备的dsgfp人工饲料，每组处理10头幼虫，共3次生物学重复。两组幼虫饲喂6h后转移至含2.5％亮蓝染料的人工饲料中，饲喂15min后取中肠在pbs缓冲液中研磨充分，13000离心10min，将上清转移到新的离心管中，并用0.22μm的滤膜过滤上清，酶标仪检测625nm处的吸光值。
[0165]
通过od值的大小来反映幼虫的取食量。结果如图13所示，对照组的od值为0.04，处理组为0.01，处理组幼虫的取食量显著低于对照组，说明npfr对亚洲玉米螟的取食有影响。体长和形态无差异的幼虫饲喂dsnpfr/gfp人工饲料后，饲料取食量如图14所示，幼虫取食dsnpfr人工饲料较取食dsgfp人工饲料减少，对形态观察如图15所示，饲喂dsnpfr人工饲料较dsgfp人工饲料的幼虫生长受到明显抑制，图15和图16分别表示饲喂dsgfp/npfr后幼虫体长和体重的变化，饲喂dsgfp/npfr后10头幼虫体长的平均值分别为1.25cm，1.02cm；体重的平均值分别为0.26g，0.22g，处理组的体长和体重均相较对照组显著下降，说明npfr对亚洲玉米螟的生长有影响。
[0166]
上述实施例证明，亚洲玉米螟npfr蛋白结构上与报道的g蛋白偶联受体一样，含有
7个跨膜结构域，且与鳞翅目的其它昆虫的npfr蛋白序列相似性较高。在功能上，给亚洲玉米螟幼虫饲喂dsnpfr可以显著抑制npfr基因的表达，并且干扰npfr基因的表达，亚洲玉米螟幼虫的取食量明显降低，生长也受到抑制。
[0167]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。