一种糖基转移酶突变体及其催化合成莱鲍迪苷M的方法与流程

一种糖基转移酶突变体及其催化合成莱鲍迪苷m的方法
技术领域
1.本发明属于生物工程技术领域，具体涉及到一种糖基转移酶突变体催化合成莱鲍迪苷m的方法。


背景技术：

2.甜菊糖苷是一种二萜类化合物，以二萜类甜菊醇为基本骨架。甜菊糖苷主要存在于甜叶菊叶片中，其叶片中含有甜菊苷、莱鲍迪苷a、莱鲍迪苷b、莱鲍迪苷d、莱鲍迪苷e、莱鲍迪苷m等多种天然甜菊糖苷，其中莱鲍迪苷m在干叶片中含量甚微，但其甜度和口感皆佳，是目前公认最理想的甜菊糖苷产品。莱鲍迪苷m作为一种新型天然甜味剂，其来源于甜叶菊中，具有高甜度、低热量等优点，但目前报道合成莱鲍迪苷m的研究较少。
3.糖基转移酶主要存在于植物中，其能够将糖基连接到不同的受体分子中，发生糖基化反应，从而得到相应的糖苷类化合物。糖基转移酶依据糖基供体类型的不同可以分为“leloir”型糖基转移酶和非“leloir”型糖基转移酶。催化合成甜菊糖苷的糖基转移酶以尿苷二磷酸糖基转移酶(ugts)为主。甜叶菊来源的糖基转移酶ugt76g1属于“leloir”型糖基转移酶，糖基供体以udpg为主。ugt76g1具有较好的底物混杂性，主要是由于其晶体结构中的受体结合口袋较大，可以容纳多种糖基受体分子。ugt76g1不仅催化各类甜菊糖苷，其也催化姜黄素生成姜黄素糖苷类化合物。
4.利用定向进化理论对酶分子进行改造，从而获得催化效率较高的酶分子。对酶的结构特征与功能关系进行分析，是有效开展酶分子改造工作的前提和基础。首先，获得蛋白质的空间结构，其次，利用已知或预测出的蛋白质结构与配体进行模拟对接实验，可得到酶与配体的复合物模型。基于蛋白质结构的理性设计，通过对蛋白质结构分析找出其活性位点，对其活性位点进行突变，该类活性位点对于整个蛋白质的功能，及其与配体的结合都有影响。
5.糖基化反应过程中不可缺少的是糖基供体，主要的糖基供体包括udpg、udp
‑
半乳糖、udp
‑
葡萄糖醛酸等，其中应用最为广泛的就属udpg，但udpg价格高，不适用于在工业化生产中大规模应用。蔗糖合酶与糖基转移酶的偶联反应能够在糖基化反应中通过添加蔗糖来实现udpg原位再生循环。利用蔗糖合酶与糖基转移酶建立双酶偶联体系，双酶催化时，首先由蔗糖合酶催化蔗糖裂解生成udpg和果糖。随后由糖基转移酶催化进行糖基化反应。而糖基化过程中生成的udp又可被蔗糖合酶利用，再次转化为udpg，从而实现循环利用，同时也避免了udp的积累对酶活性的抑制。采用双酶偶联体系，只需添加廉价的蔗糖作为底物，而不需昂贵的udpg，因此可以达到控制生产成本的目的。
6.利用糖基转移酶ugt76g1与蔗糖合酶构成双酶催化体系，实现催化底物莱鲍迪苷e合成中间产物莱鲍迪苷d，再催化莱鲍迪苷d合成莱鲍迪苷m。由于中间产物莱鲍迪苷d分子量较大且水溶性较差，野生型酶ugt76g1催化莱鲍迪苷e合成莱鲍迪苷m的效率较低，需对糖基转移酶ugt76g1进行分子改造，提高其酶的催化效率。


技术实现要素：

7.本发明的目的是改造糖基转移酶ugt76g1，获得ugt76g1突变体，提高其催化合成莱鲍迪苷m的效率，解决目前酶法催化合成莱鲍迪苷m产量不足的问题，提供一种糖基转移酶突变体催化合成莱鲍迪苷m的方法。
8.为实现上述目的，本技术采用的技术方案为：
9.一种适用于合成莱鲍迪苷m的糖基转移酶突变体，糖基转移酶ugt76g1氨基酸序列如seqid no:1所示，其突变为g87d、s147d、s147n、s195q、l200y、t284s、s285w、g378p。
10.g87d为seq id no:1序列中第87位氨基酸由甘氨酸(g)突变成天冬氨酸(d)；
11.s147d为seq id no:1序列中第147位氨基酸由丝氨酸(s)突变成天冬氨酸(d)；
12.s147n为seq id no:1序列中第147位氨基酸由丝氨酸(s)突变成天冬酰胺(n)；
13.s195q为seq id no:1序列中第195位氨基酸由丝氨酸(s)突变成谷氨酰胺(q)；
14.l200y为seq id no:1序列中第200位氨基酸由亮氨酸(l)突变成酪氨酸(y)；
15.t284s为seq id no:1序列中第284位氨基酸由苏氨酸(t)突变成丝氨酸(s)；
16.s285w为seq id no:1序列中第285位氨基酸由丝氨酸(s)突变成色氨酸(w)；
17.g378p为seq id no:1序列中第378位氨基酸由甘氨酸(g)突变成脯氨酸(p)；
18.糖基转移酶ugt76g1的单点突变g87d、s147d、s147n、s195q、l200y、t284s、s285w、g378p。
19.一种表达基因，该基因编码上述任意一种糖基转移酶突变体。
20.一种重组质粒，该重组质粒上连接有上述糖基转移酶ugt76g1突变体和蔗糖合酶的编码基因。
21.所述蔗糖合酶编码基因为蔗糖合酶stsus1或蔗糖合酶mcsusy。
22.一种重组菌株，将上述合成的重组质粒在大肠杆菌bl21(de3)中转化得到。
23.一种利用糖基转移酶突变体合成莱鲍迪苷m的方法，包括如下步骤：
24.1)将糖基转移酶ugt76g1突变体的编码基因与蔗糖合酶基因克隆到表达载体上，得到其对应的重组质粒；
25.2)将重组质粒在大肠杆菌bl21(de3)中进行转化，得到含有双酶共表达的重组菌株；
26.3)将重组菌株在lb液体培养基中，加入诱导剂进行诱导表达，并低温离心收集菌体，菌体中加入适当缓冲液进行重悬，对菌液超声破碎后离心收集上清液即为粗酶液；
27.4)在催化反应体系中加入莱鲍迪苷e或者莱鲍迪苷d作为底物、蔗糖以及粗酶液，适当温度反应，取样高温灭活，离心得上清即为产物莱鲍迪苷m。
28.其中，糖基转移酶ugt76g1的氨基酸序列如seq id no:1所示，其核苷酸序列如seq id no:2所示；蔗糖合酶stsus1的核苷酸序列如seq id no:11所示；蔗糖合酶mcsusy的核苷酸序列如seq id no:12。
29.糖基转移酶ugt76g1的突变体g87d的核苷酸序列如seqidno:3所示，s147d的核苷酸序列如seqidno:4所示，s147n的核苷酸序列如seqidno:5所示，s195q的核苷酸序列如seqidno:6所示，l200y的核苷酸序列如seq id no:7所示，t284s的核苷酸序列如seqidno:8所示，s285s的核苷酸序列如seq id no:9所示，g378p的核苷酸序列如seqidno:10所示。
30.所使用的诱导剂为异丙基
‑
β
‑
d
‑
硫代半乳糖苷，用量为0.1～1.0mm，诱导时间20～
40h。
31.催化体系中以10～50g/l莱鲍迪苷e为底物，蔗糖浓度为10～200g/l，粗酶添加量为1～5g/l，温度为20～50℃，反应时间为2～32h。
32.催化体系中以1～5g/l莱鲍迪苷d为底物，蔗糖浓度为1～20g/l，粗酶添加量为1～5g/l，温度为20～50℃，反应时间为2～32h。
33.所述蔗糖合酶为蔗糖合酶stsus1或蔗糖合酶mcsusy，所述蔗糖合酶stsus1的核苷酸序列如seq id no.11所示，蔗糖合酶mcsusy核苷酸序列如seq id no.12所示。
34.优选地，将糖基转移酶ugt76g1突变体s195q与蔗糖合酶mcsusy共表达。
35.进一步优选地，一种利用糖基转移酶突变体s195q催化莱鲍迪苷e合成莱鲍迪苷m的方法，包括如下步骤：
36.1)将糖基转移酶ugt76g1突变体s195q的编码基因与蔗糖合酶mcsusy的编码基因克隆到表达载体上，得到其对应的重组质粒,；
37.2)将重组质粒在大肠杆菌bl21(de3)中进行转化，得到含有双酶共表达的重组菌株；
38.3)将重组菌株在lb液体培养基中，加入诱导剂进行诱导表达，并低温离心收集菌体，菌体中加入适当缓冲液进行重悬，对菌液超声破碎后离心收集上清液即为粗酶液；
39.4)在催化反应体系中加入莱鲍迪苷e、蔗糖以及粗酶液，适当温度反应，取样高温灭活，离心得上清即为产物莱鲍迪苷m。
40.进一步优选地，一种利用糖基转移酶突变体s195q催化莱鲍迪苷d合成莱鲍迪苷m的方法，包括如下步骤：
41.1)将糖基转移酶ugt76g1突变体s195q的编码基因与蔗糖合酶mcsusy的编码基因克隆到表达载体上，得到其对应的重组质粒；
42.2)将重组质粒在大肠杆菌bl21(de3)中进行转化，得到含有双酶共表达的重组菌株；
43.3)将重组菌株在lb液体培养基中，加入诱导剂进行诱导表达，并低温离心收集菌体，菌体中加入适当缓冲液进行重悬，对菌液超声破碎后离心收集上清液即为粗酶液；
44.4)在催化反应体系中加入莱鲍迪苷d、蔗糖以及粗酶液，适当温度反应，取样高温灭活，离心得上清即为产物莱鲍迪苷m。
45.本研究对于糖基转移酶ugt76g1进行酶分子改造。选择晶体结构，对接得到复合物模型。并对该结构中与rebe周围内的氨基酸残基进行单点突变。筛选出的突变体为g87d、s147d、s147n、s195q、l200y、t284s、s285w、g378p。优选为g87d、s195q、l200y、t284s、s285w，进一步优选为s195q和l200y，再进一步优选为s195q，与野生型相比，其比酶活提高了1.3倍。
46.野生型酶ugt76g1对于莱鲍迪苷e和莱鲍迪苷d的米氏常数分别为170.13
±
12.61μm和478.12
±
33.03μm，k
cat
/k
m
分别为11.76s
‑
1 mm
‑1和0.42s
‑
1 mm
‑1；突变体s195q对于莱鲍迪苷e和莱鲍迪苷d的米氏常数分别为56.34
±
2.02μm和214.48
±
14.54μm，k
cat
分别为26.27s
‑
1 mm
‑1和1.17s
‑
1 mm
‑1。本发明突变体s195q对于底物莱鲍迪苷e和莱鲍迪苷d亲和力分别提高了3.0倍和2.2倍，催化效率提高了2.2倍和2.8倍。结合动力学参数结果，突变体s195q更易于与莱鲍迪苷e以及莱鲍迪苷d结合，有利于催化合成莱鲍迪苷m，这将为糖基转移酶的产业
化和在食品工业中的应用奠定优良的基础。
47.催化体系中以10～50g/l莱鲍迪苷e为底物，蔗糖浓度为10～200g/l，粗酶添加量为1～5g/l，20～50℃，反应时间为2～32h；优选条件为：反应温度40℃；最适粗酶液浓度为5mg/ml；最适reb e与蔗糖浓度比为1:5。
48.有益效果：
49.本发明通过定向进化方法对糖基转移酶ugt76g1进行分子改造，提高了其酶活以及催化效率，利用突变体实现了高效催化合成莱鲍迪苷m。为糖基转移酶的改造提供指导方法，操作简单，催化效率较高。也提高了酶法合成莱鲍迪苷m的产量以及对于底物莱鲍迪苷e和莱鲍迪苷d的亲和力和催化效率。
附图说明
50.图1重组酶对rebe的转化率；
51.图2重组酶对rebd的转化率；
52.图3突变体与野生型ugt76g1的酶活力；
53.图4不同来源蔗糖合酶与糖基转移酶偶联对reb m产物合成的影响；
54.图5不同反应温度对reb m产物合成的影响；
55.图6不同粗酶液浓度对reb m产物合成的影响；
56.图7不同reb e与蔗糖浓度配比对reb m产物合成的影响；
57.图8最适条件下reb m产物合成情况。
具体实施方式
58.下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护的范围不限于此。
59.实施例1糖基转移酶ugt76g1突变位点筛选
60.通过定向进化理论方法进行改造。选择晶体结构并对接得到复合物模型。并对该结构中与rebe周围内的氨基酸残基进行单点突变。测定结构中活性中心关键残基his25的ne2与底物rebe的c13糖苷的o原子之间距离的距离(distance)。按照亲和力(affinity)值大小进行排序。结合affinity和distance，筛选出的突变体为g87d、s147d、s147n、s195q、l200y、t284s、s285w、g378p，如表1所示。
61.表1 突变体亲和力值数据
[0062][0063]
注释：affinity代表亲和力；distance代表原子之间距离；vdw代表范德华力。
[0064]
实施例2双酶表达体系的构建
[0065]
选择双基因表达载体prsfduet
‑
1，在载体的ndei/xhoi位点插入甜叶菊来源的糖基转移酶ugt76g1，核苷酸序列如seq id no:2所示；在位点ncoi/ecori分别插入蔗糖合酶stsus1或蔗糖合酶mcsusy，核苷酸序列如seq id no:11和seq id no:12所示，构成对应的两种重组表达质粒，将重组质粒分别导入至大肠杆菌bl21(de3)中进行转化，得到两种双酶共表达重组菌株。
[0066]
实施例3糖基转移酶ugt76g1突变体的制备
[0067]
利用pcr扩增技术，以野生型ugt76g1
‑
stsus1重组质粒作为模版dna进行碱基定点突变。
[0068]
对g87d定点突变的引物：
[0069]
正向引物：5
’‑
ccgctggcggacatgcgtattccgattatcaacgaa
‑3’
(下划线为突变碱基)，如seqidno:13所示。
[0070]
反向引物：5
’‑
aatacgcatgtccgccagcgggccgtgggtcggcag
‑3’
(下划线为突变碱基)，如seq id no:14所示。
[0071]
对s147d定点突变的引物：
[0072]
正向引物：5
’‑
ctgatgaccgacagcctgttcaattttcatgcccac
‑3’
(下划线为突变碱基)，如seqidno:15所示。
[0073]
反向引物：5
’‑
gaacaggctgtcggtcatcaggaccaggcgacgcag
‑3’
(下划线为突变碱基)，如seq id no:16所示。
[0074]
对s147n定点突变的引物：
[0075]
正向引物：5
’‑
ctgatgaccaacagcctgttcaattttcatgcccac
‑3’
(下划线为突变碱基)，如seqidno:17所示。
[0076]
反向引物：5
’‑
gaacaggctgttggtcatcaggaccaggcgacgcag
‑3’
(下划线为突变碱基)，如seq id no:18所示。
[0077]
对s195q定点突变的引物：
[0078]
正向引物：5
’‑
tcagcgtaccaaaactggcagattctgaaagaaatc
‑3’
(下划线为突变碱基)，如seq id no:19所示
[0079]
反向引物：5
’‑
ctgccagttttggtacgctgacttaatatccttgac
‑3’
(下划线为突变碱基)，如seq id no:20所示
[0080]
对l200y定点突变的引物：
[0081]
正向引物：5
’‑
tggcagatttacaaagaaatcctgggtaaaatgatt
‑3’
(下划线为突变碱基)，如seq id no:21所示
[0082]
反向引物：5
’‑
gatttctttgtaaatctgccagttcgagtacgctga
‑3’
(下划线为突变碱基)，如seq id no:22所示
[0083]
对t284s定点突变的引物：
[0084]
正向引物：5
’‑
ttcggtagtagctcggaagtggatgaaaaggacttt
‑3’
(下划线为突变碱基)，如seq id no:23所示
[0085]
反向引物：5
’‑
cacttccgagctactaccgaagctaacatacagcac
‑3’
(下划线为突变碱基)，如seq id no:24所示
[0086]
对s285w定点突变的引物：
[0087]
正向引物：5
’‑
ggtagtacctgggaagtggatgaaaaggactttctg
‑3’
(下划线为突变碱基)，如seq id no:25所示
[0088]
反向引物：5
’‑
atccacttcccaggtactaccgaagctaacatacag
‑3’
(下划线为突变碱基)，如seq id no:26所示
[0089]
对g378p定点突变的引物：
[0090]
正向引物：5
’‑
tcagattttccactggaccagccgctgaatgcacgt
‑3’
(下划线为突变碱基)，如seq id no:27所示
[0091]
反向引物：5
’‑
ctggtccagtggaaaatctgagaaaatcatcgggac
‑3’
(下划线为突变碱基)，如seq id no:28所示
[0092]
pcr扩增反应体系：10μm正向引物和反向引物各2μl；dntpmix 1μl；2
×
maxbuffer 25μl；模板质粒1μl；2u/50μl super
‑
fidelitydna聚合酶1μl，加灭菌水ddh2o补足至50μl。
[0093]
pcr扩增反应条件：95℃预变性30s；30个循环(95℃变性15s；65℃退火15s；72℃延伸7min)；72℃彻底延伸5min；最后16℃保温。pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶核酸电泳检测。
[0094]
将1μldpni加入至确定已突变的pcr扩增产物中，后将反应体系置于37℃恒温反应1～2h，转入大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞中，冰上放置30min，42℃热激45～90s，冰上放置2min，加入600μl lb培养基(配方：nacl 10g/l，酵母粉5g/l，蛋白胨10g/l)，37℃摇床200rpm，45min，取全部菌液均匀涂布于含有卡那霉素抗性的lb平板上，37℃过夜培养。挑取平板上2个单菌落，接入lb液体培养基(配方：nacl 10g/l，酵母粉5g/l，蛋白胨10g/l)，9h后
保存菌液甘油管并测序，将测序结果正确的菌液甘油管涂布于含有卡那霉素抗性的lb平板(配方：nacl 10g/l，酵母粉5g/l，蛋白胨10g/l，琼脂20g/l)，摇管活化提取质粒，将突变重组质粒以及野生型重组质粒导入大肠杆菌bl21(de3)中得到相应的重组菌株g87d
‑
stsus1、s147d
‑
stsus1、s147n
‑
stsus1、s195q
‑
stsus1、l200y
‑
stsus1、t284s
‑
stsus1、s285w
‑
stsus1、g378p
‑
stsus1以及野生型菌株ugt76g1
‑
stsus1。
[0095]
利用pcr扩增技术，以野生型ugt76g1
‑
mcsusy重组质粒作为模版dna进行碱基定点突变。
[0096]
对s195q定点突变的引物：
[0097]
正向引物：5
’‑
tcagcgtaccaaaactggcagattctgaaagaaatc
‑3’
(下划线为突变碱基)，如seq id no:19所示
[0098]
反向引物：5
’‑
ctgccagttttggtacgctgacttaatatccttgac
‑3’
(下划线为突变碱基)，如seq id no:20所示
[0099]
pcr扩增反应体系：10μm正向引物和反向引物各2μl；dntpmix 1μl；2
×
maxbuffer 25μl；模板质粒1μl；2u/50μl super
‑
fidelitydna聚合酶1μl，加灭菌水ddh2o补足至50μl。
[0100]
pcr扩增反应条件：95℃预变性30s；30个循环(95℃变性15s；65℃退火15s；72℃延伸7min)；72℃彻底延伸5min；最后16℃保温。pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶核酸电泳检测。
[0101]
将1μl dpni加入至确定已突变的pcr扩增产物中，后将反应体系置于37℃恒温反应1～2h，转入大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞中，冰上放置30min，42℃热激45～90s，冰上放置2min，加入600μl lb培养基(配方：nacl 10g/l，酵母粉5g/l，蛋白胨10g/l)，37℃摇床200rpm，45min，取全部菌液均匀涂布于含有卡那霉素抗性的lb平板上，37℃过夜培养。挑取平板上2个单菌落，接入lb液体培养基(配方：nacl 10g/l，酵母粉5g/l，蛋白胨10g/l)，9h后保存菌液甘油管并测序，将测序结果正确的菌液甘油管涂布于含有卡那霉素抗性的lb平板(配方：nacl 10g/l，酵母粉5g/l，蛋白胨10g/l，琼脂20g/l)，摇管活化提取质粒，将突变重组质粒以及野生型重组质粒导入大肠杆菌bl21(de3)中得到相应的重组菌株s195q
‑
mcsusy以及野生型菌株ugt76g1
‑
mcsusy。
[0102]
实施例4重组菌株的诱导表达
[0103]
挑取重组菌株g87d
‑
stsus1、s147d
‑
stsus1、s147n
‑
stsus1、s195q
‑
stsus1、l200y
‑
stsus1、t284s
‑
stsus1、s285w
‑
stsus1、g378p
‑
stsus1、s195q
‑
mcsusy以及野生型菌株ugt76g1
‑
stsus1和ugt76g1
‑
mcsusy的单菌落分别接种至装有5ml液体培养基且含有50mg/l抗性的摇管中，放置在37℃、200rpm摇床中活化12h，培养后其作为种子液按照3％(v:v)的接种量加入至100ml lb液体培养基且含有抗性的摇瓶中，将摇瓶放置于37℃、200rpm摇床中培养活化2h，待其菌液od
600
达到0.6～0.8时，降低摇床温度至20℃后，使摇瓶内菌液浓度在20℃，放缓菌生长，在摇瓶中加入0.1 mm的iptg进行诱导表达36h。
[0104]
收集菌液并冷冻离心(4℃，7000rpm，6min)，弃上清得到菌泥，用磷酸钾缓冲液冲洗两遍。再加入适量磷酸钾缓冲液，放置在冰水混合物中，用超声破碎仪超声破碎菌体，参数设置为ф6，300w，30min。再用冷冻离心机离心，参数设置为4℃，8000rpm，30min，取上清即为粗酶液，放置4℃冰箱保存待用。
[0105]
实施例5催化反应初筛突变位点
[0106]
用突变菌株g87d
‑
stsus1、s147d
‑
stsus1、s147n
‑
stsus1、s195q
‑
stsus1、l200y
‑
stsus1、t284s
‑
stsus1、s285w
‑
stsus1、g378p
‑
stsus1以及野生型菌株ugt76g1
‑
stsus1分别制备重组酶，用以转化rebe或rebd，初步筛选较优突变位点。
[0107]
以10g/l rebe为底物，蔗糖30g/l，粗酶5mg/ml，用100mm磷酸钾缓冲液(ph 7.2)补齐至3ml。在40℃、200rpm摇床中进行反应，反应12h后的转化率如图1所示，结果表明，s147n
‑
stsus1与g378p
‑
stsus1对于rebe基本无催化活性，s147d
‑
stsus1对于rebe转化率较低，而s195q
‑
stsus1、l200y
‑
stsus1、t284s
‑
stsus1以及s285w
‑
stsus1的底物转化率均高于90％，且高于ugt76g1
‑
stsus1的转化率，是ugt76g1
‑
stsus1的1.1倍。
[0108]
以1g/l rebd为底物，蔗糖3g/l，粗酶5mg/ml，用100mm磷酸钾缓冲液(ph 7.2)补齐至3ml。在40℃、200rpm摇床中进行反应，反应6h以及20h后的转化率如图2所示,反应6h时，l200y
‑
stsus1的催化效果最高，此时仅有s195q
‑
stsus1和l200y
‑
stsus1的底物转化率超过70％。当反应20h时，s195q
‑
stsus1、l200y
‑
stsus1、t284s
‑
stsus1、s285w
‑
stsus1等4个反应体系的底物转化率均超过95％，且s195q
‑
stsus1和l200y
‑
stsus1的转化率相当，为ugt76g1
‑
stsus1的1.3倍。
[0109]
实施例6糖基转移酶粗酶酶活复筛突变位点
[0110]
对突变酶以及野生型酶的糖基转移酶酶活力进行测定，在3ml的酶催化反应体系中加入1.2mm莱鲍迪苷e，2mm udpg，3mm mgcl2，粗酶1mg，再用100mm、ph 7.2磷酸钾缓冲液补充剩余部分。反应在37℃、200rpm摇床中进行，取样时间为0min、30min。样品处理：吸取500μl放置于ep管中，放入95℃沸水中15min，终止反应，将ep管至于离心机中(12000rpm、1min)，取上清液置于新的ep管中，过有机滤膜(0.45μm)放入液相样品瓶中，待hplc检测。糖基转移酶酶活力定义(u)：1分钟内转化生成1μmol产物所需的酶量为1个酶活单位。
[0111]
由上述转化实验筛选出的4个突变菌株s195q
‑
stsus1、l200y
‑
stsus1、t284s
‑
stsus1、s285w
‑
stsus1。对其表达的ugt76g1野生型和突变酶进行酶活力测定。结果如图3所示，其中l200y的比酶活较低，且低于ugt76g1野生型的酶活力，而s195q则显示出最高的比酶活，是ugt76g1野生型的1.3倍。因此，筛选出最佳突变菌株s195q
‑
stsus1。
[0112]
实施例7不同来源蔗糖合酶与糖基转移酶偶联对reb m产物合成的影响
[0113]
催化反应总体系3ml，以1g/l莱鲍迪苷d为底物，蔗糖5g/l，粗酶5mg/ml，用100mm磷酸钾缓冲液(ph 7.2)补充剩余部分。催化反应在30℃、200rpm摇床中进行，反应6h，按照一定时间间隔取样500μl，样品经95℃沸水中15min，终止反应，将ep管至于离心机中离心(12000rpm、1min)，取上清液置于转到新的ep管中处理后，稀释样品浓度低于1g/l，用hplc检测分析。如图4所示，反应6h后，s195q
‑
mcsusy转化合成1.27g/l rebm，分别是ugt76g1
‑
mcsusy、s195q
‑
stsus1以及ugt76g1
‑
stsus1的1.6倍、2.6倍和2.7倍；而ugt76g1
‑
mcsusy转化合成的rebm产量为ugt76g1
‑
stsus1的1.8倍。因此相比于蔗糖合酶stsus1，mcsusy更适合于与ugt76g1以及s195q共表达而提高rebm的合成。
[0114]
实施例8不同反应温度对reb m产物合成的影响
[0115]
催化反应总体系3ml，莱鲍迪苷e 20g/l，蔗糖100g/l，粗酶3mg/ml，用100mm磷酸钾缓冲液(ph 7.2)补充剩余部分。催化反应在20℃～50℃、200rpm摇床中进行，反应22h，按照一定时间间隔取样500μl，样品经95℃沸水中15min，终止反应，将ep管至于离心机中离心(12000rpm、1min)，取上清液置于转到新的ep管中处理后，稀释样品浓度低于1g/l，用hplc检测分析。如图5所示，当反应温度为40℃时，重组酶s195q
‑
mcsusy合成rebm产量最高，产量
为8.162g/l，与原始酶ugt76g1
‑
mcsusy的产量相比，提高了1.3倍。因此选取40℃作为最适温度。
[0116]
实施例9不同粗酶液浓度对reb m产物合成的影响
[0117]
催化反应总体系3ml，莱鲍迪苷e 20g/l，蔗糖100g/l，粗酶1～5mg/ml，用100mm磷酸钾缓冲液(ph 7.2)补充剩余部分。催化反应在40℃、200rpm摇床中进行，反应22h，按照一定时间间隔取样500μl，样品经95℃沸水中15min，终止反应，将ep管至于离心机中离心(12000rpm、1min)，取上清液置于转到新的ep管中处理后，稀释样品浓度低于1g/l，用hplc检测分析。如图6所示，当重组s195q
‑
mcsusy粗酶液浓度为5mg/ml时，转化生成的rebm产量最高，产量为9.756g/l，与原始酶ugt76g1
‑
mcsusy在相同反应条件下的产量相比，提高了1.5倍。因此选取最适重组s195q
‑
mcsusy粗酶液浓度为5mg/ml。
[0118]
实施例10不同reb e与蔗糖浓度配比对reb m产物合成的影响
[0119]
催化反应总体系3ml，莱鲍迪苷e 20g/l，蔗糖20～200g/l，粗酶5mg/ml，用100mm磷酸钾缓冲液(ph 7.2)补充剩余部分。催化反应在40℃、200rpm摇床中进行，反应22h，按照一定时间间隔取样500μl，样品经95℃沸水中15min，终止反应，将ep管至于离心机中离心(12000rpm、1min)，取上清液置于转到新的ep管中处理后，稀释样品浓度低于1g/l，用hplc检测分析。如图7所示，当reb e与蔗糖浓度配比为1:5时，重组酶s195q
‑
mcsusy合成rebm产量最高产量为10.270g/l，与原始酶ugt76g1
‑
mcsusy在相同反应条件下的产量相比，提高了1.6倍。所以选取reb e与蔗糖最适浓度配比为1:5，即取reb e浓度为20g/l，蔗糖浓度为100g/l。
[0120]
实施例11最适条件下由莱鲍迪苷e合成reb m产物
[0121]
催化反应总体系3ml，莱鲍迪苷e 20g/l，蔗糖100g/l，粗酶5mg/ml，用100mm磷酸钾缓冲液(ph 7.2)补充剩余部分。催化反应在40℃、200rpm摇床中进行，反应0～32h，按照一定时间间隔取样500μl，样品经95℃沸水中15min，终止反应，将ep管至于离心机中离心(12000rpm、1min)，取上清液置于转到新的ep管中处理后，稀释样品浓度低于1g/l，用hplc检测分析。如图8所示，催化反应0h至32h，重组酶s195q
‑
mcsusy在不断的积累合成rebm，说明该酶可在较长时间内不断积累产物rebm，具有良好的应用前景。反应32h时，其合成产物rebm浓度为12.8g/l，是野生型ugt76g1
‑
mcsusy合成rebm浓度的2倍。
[0122]
实施例12糖基转移酶的动力学参数的测定
[0123]
莱鲍迪苷e终浓度设置为10～2000μm或者莱鲍迪苷d终浓度设置为50～2000μm，不同浓度梯度的莱鲍迪苷e或者莱鲍迪苷d分别与适量纯化的野生型ugt76g1和突变体s195q混合，按照上述糖基转移酶纯酶的酶活测定方法测定酶活性。应用michaelis menten方程计算纯化的野生型和突变体的k
m
、v
max
、k
cat
和k
cat
/k
m
。如表1所示，突变体s195q对于莱鲍迪苷e和莱鲍迪苷d的k
m
分别为56.34
±
2.02μm和214.48
±
14.54μm，k
cat
分别为26.27s
‑1mm
‑1和1.17s
‑
1 mm
‑1。与野生型ugt76g1(k
m
分别为170.13
±
12.61μm和478.12
±
33.03μm以及k
cat
/k
m
分别为11.76s
‑
1 mm
‑1和0.42s
‑
1 mm
‑1)相比，本发明所产的突变酶对于底物莱鲍迪苷e和莱鲍迪苷d亲和力分别提高了约3.0倍和2.2倍，催化效率分别提高了2.2倍和2.8倍。这将为糖基转移酶的产业化和在食品工业中的应用奠定优良的基础。
[0124]
表1野生型ugt76g1和突变体s195q的动力学参数
[0125]