检测CDR1as表达水平的试剂的新用途的制作方法

检测cdr1as表达水平的试剂的新用途
技术领域
1.本发明属于生物医学领域，具体涉及检测cdr1as表达水平的试剂的新用途。


背景技术：

2.脊髓损伤(spinal cord injury，sci)是一种高致残性、不可逆的中枢神经系统损伤，带来较高的经济压力和社会负担。脊髓损伤有许多潜在的原因，包括创伤、血管病变、感染和肿瘤，最常见的原因是交通事故，然而随着社会的老龄化，跌落伤导致的病例每年都在增加。脊髓在受损后很难进行自我修复，超过一半的脊髓损伤患者在受损部位下方的神经控制区域丧失了全部的运动和感觉功能。4500年来，医生们一直在努力改善脊髓损伤后的恢复，而实用的、有意义的、可临床实践的确切治疗方法依旧没有发展起来。
3.脊髓损伤后，损伤部位周围的脊膜和血管成纤维细胞从所在处分离并迁移至损伤中心部位，与大量成纤维细胞分泌的细胞外基质，如纤维连接蛋白、胶原蛋白和层粘连蛋白等纤维化相关蛋白共同形成纤维瘢痕。研究发现，成纤维细胞活化增殖形成的纤维瘢痕是阻碍sci后轴突再生和功能恢复的主要物质，如果能阻止成纤维细胞的纤维化进程，抑制脊髓的纤维化，将会对脊髓损伤预后的改善起到非常重要的作用。
4.非编码核糖核酸(non
‑
coding ribonucleic acids,ncrna)是一类在各种生理和病理过程中发挥重要作用的遗传、表观遗传和翻译调节因子。环状rna(circular rnas,circrnas)是一种新进入学者视野的内源性ncrna，在哺乳动物细胞中丰富存在，它是通过反向连接形成的，没有开放阅读框、5'帽和聚a尾巴，所以能形成首尾相接、单链闭合的连续环状结构。已有研究显示circrnas在多种人类疾病，例如恶性肿瘤的发生发展、心血管疾病的诊治中扮演着重要的角色。
5.cdr1as是最早报道功能机制的circrna分子，也是目前研究最广泛的circrna。现有研究证实，它能够通过海绵微rna(mirna)或直接结合rna结合蛋白(rbp)，调控其下游基因的表达，激活相关信号通路，从而促进或抑制肿瘤的进展，甚至影响肿瘤的化疗敏感性。此外，cdr1as与癫痫、细胞分化的关联也有报道。
6.不过，目前尚未见现有技术报道cdr1as与脊髓损伤、脊髓纤维化的关系。


技术实现要素：

7.本发明提供了检测cdr1as表达水平的试剂在预测或辅助预测脊髓损伤预后的试剂盒中的用途，所述cdr1as为序列如seq id no.1所示的环状rna。
8.本发明还提供了一种预测或辅助预测脊髓损伤预后的试剂盒，它含有检测cdr1as表达水平的试剂，所述cdr1as为序列如seq id no.1所示的环状rna。
9.进一步地，上述检测cdr1as表达水平的试剂包括扩增cdr1as的引物和/或检测cdr1as的探针。
10.本发明还提供了cdr1as的表达抑制剂在制备治疗脊髓损伤的药物中的用途，所述cdr1as为序列如seq id no.1所示的环状rna。
11.进一步地，上述表达抑制剂是沉默或敲除cdr1as的试剂。
12.更进一步地，上述表达抑制剂为cdr1as的sirna，序列如seq id no.2所示。
13.更进一步地，上述治疗脊髓损伤的药物为抗脊髓纤维化的药物；优选地，所述抗脊髓纤维化的药物是抑制脊髓成纤维细胞粘连蛋白和/或i型胶原分泌的药物。
14.本发明还提供了一种治疗脊髓损伤的药物，它含有cdr1as的表达抑制剂，所述cdr1as为序列如seq id no.1所示的环状rna；优选地，所述表达抑制剂是沉默或敲除cdr1as的试剂。
15.进一步地，上述表达抑制剂为cdr1as的sirna，序列如seq id no.2所示。
16.更进一步地，上述药物为抗脊髓纤维化的药物；优选地，所述抗脊髓纤维化的药物是抑制脊髓成纤维细胞粘连蛋白和/或i型胶原分泌的药物。
17.实验结果表明，cdr1as在损伤脊髓和正常脊髓中差异表达，cdr1as的表达抑制剂能够抗脊髓纤维化，改善脊髓损伤的预后。说明cdr1as表达的降低可改善脊髓损伤的预后，因而对cdr1as表达的检测将有助于对脊髓损伤预后进行预测。
18.环状rna的表达抑制剂是指：抑制环状rna的表达的物质或试剂，比如，抑制环状rna转录和/或翻译的物质或试剂。
19.显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
20.以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
21.图1为cdr1as的一代测序结果。
22.图2为rt
‑
pcr验证脊髓中cdr1as的存在的结果。
23.图3为脊髓损伤后环状rna差异表达。红色像素表示丰度增加，而绿色像素表示丰度减少，p<0.05。
24.图4为在脊髓损伤后3天，通过qrt
‑
pcr检测脊髓损伤中心cdr1as的相对表达。
25.图5为脊髓纤维化指标的蛋白：粘连蛋白和i型胶原的检测结果；sicirc
‑
nc为cdr1as的sirna的对照组，sicirc为cdr1as的sirna组。
具体实施方式
26.本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。
27.实验例1、cdr1as在脊髓组织中存在验证及脊髓损伤后的差异表达
28.1.1cdr1as环状结构的验证
29.1.1.1组织rna提取
30.新鲜脊髓组织样品研磨后加入magzol裂解，加氯仿萃取，取水相，加异丙醇沉淀rna，进而加入75％乙醇洗涤rna，最后超纯水溶解rna。rna浓度利用紫外分光光度计进行od值的质检。
31.1.1.2cdna反转录、pcr扩增及一代测序
32.所用引物序列见表1的f1和r1。反转录采用10μl的体系，其中：rtase mix 2μl，rt primer(c)*(10μm)1μl,rna template 1μg，5x rtase buffer 2μl，最后加入dd水补足10μl。反转录条件是42℃ 60min，72℃ 10min反应，得到cdna。pcr扩增的体系为30μl体系，具体：2
×
kofu mix 15μl，forward primer(10μm)1.5μl，reverse primer(10μm)1.5μl，cdna 3μl，h2o 9μl。pcr扩增程序为：95℃3min 1个循环；95℃30s，60℃30s，72℃2min 30个循环；72℃5min 1个循环，然后停留在4℃。pcr跑胶的条件为：120v恒压条件下1.5％琼脂糖凝胶电泳30min。切胶回收并进行一代测序，测序用引物为：
33.m
‑
cdr1as
‑
validation
‑
219bp
‑
r1：actgaatttactggaagactctgag。
34.测序结果见图1，结果示：cdr1as的结构存在首尾相连位点，符合环状rna的特征。
35.1.1.3背靠背引物验证实验
36.所用引物序列见表1的f1、r1、f2和r2，pcr扩增体系、程序和凝胶电泳方法同1.2.2，结果见图2，结果证实小鼠脊髓组织可表达出成环的rna，其成环拼接位点与预期一致，本实验说明脊髓组织表达出正确的cdr1as环状rna。
37.表1
[0038][0039][0040]
以上结果证明，cdr1as成环拼接位点与预期一致，证实了脊髓组织可表达出环状cdr1as，可以实现对脊髓组织中环状cdr1as的表达检测。
[0041]
1.2脊髓组织损伤前后的测序分析
[0042]
采用trizol法提取脊髓标本总rna，包括：均质、相分离、rna沉淀、rna清洗和rna增溶，用1％琼脂糖凝胶监测rna降解和污染。使用分光光度计在260/280nm波长下用紫外吸收法测定rna浓度和质量，rna完整性使用bioanalyzer 2100和rna 6000nano labchip kit(agilent,ca,usa)分析rna完整性。对于环状rna的文库构建，poly(a)
‑
or poly(a) rna在高温下使用二价阳离子分裂成小片段。将裂解后的rna片段按照rna
‑
seq样品制备试剂盒(illumina,san diego,usa)的方案进行逆转录，建立最终cdna文库，对端文库的平均插入长度为300bp(
±
50bp)。然后在lc
‑
bio上使用illumina hiseq4000进行配对测序。circ
‑
explorer被用来读取识别环状rna。从所有样本中识别环状rna，计算和比较来自不同样本或组的环状rna表达，p<0.05的设为差异表达。结果如图3所示，识别出脊髓损伤后cdr1as(又名mmu_circ_0001878和cis
‑
7)较损伤前的表达显著下降。
[0043]
1.3脊髓损伤后cdr1as表达差异
[0044]
参照现有技术公开的方法构建脊髓损伤动物模型，并在脊髓损伤后3天，通过qrt
‑
pcr检测脊髓损伤中心cdr1as的相对表达，结果如图4所示。从图中可以看出，脊髓损伤3天后，cdr1as的表达显著下降，进一步证实了cdr1as在脊髓损伤前后存在差异性表达。
[0045]
实验例2、cdr1as的抑制剂在抗脊髓纤维化中的应用
[0046]
1.1sirna
‑
cdr1as转染和体外损伤模型构建
[0047]
脊髓成纤维细胞的培养基含有10％胎牛血清和100iu/ml青霉素
‑
链霉素双抗，培养温度为37℃，co2浓度为5％。当脊髓成纤维细胞融合率为30％
‑
50％时进行转染处理，各组处理方式为：sicirc
‑
nc：转染sicirc
‑
nc作为cdr1as的sirna的对照；sicirc：转染cdr1as的sirna(序列：gccgtatccagggtttcca)抑制cdr1as的表达。48小时后，使用tgf
‑
β(10ng/ml)刺激细胞模拟损伤状态，继续培养48h。
[0048]
1.2蛋白分离和western blot
[0049]
提取总蛋白，在十二烷基硫酸钠
‑
聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，然后转移到0.22mm聚偏氟乙烯膜上。用5％脱脂牛奶在室温下封闭薄膜1小时。然后，细胞膜与抗黏连蛋白(fibronectin)和抗一型胶原(collagen i)的一抗在4℃孵育过夜。第二天在室温下用二抗)孵育2小时。使用western pico ecl底物观察蛋白水平，并将gapdh作为内源性对照物(内参)进行归一化比较。得到结果如图5所示，sirna
‑
cdr1as的使用，在体外脊髓成纤维细胞损伤模型中对纤维化标志性蛋白成纤维细胞粘连蛋白、i型胶原的表达有拮抗作用，证明sirna
‑
cdr1as的使用可起到抗纤维化的作用。
[0050]
上述结果说明，抑制cdr1as的表达可以抗脊髓纤维化，改善脊髓损伤的预后。而cdr1as在脊髓损伤后表达量显著降低，说明在脊髓损伤后，机体一定程度上开启了抗纤维化的调节机制，而通过对脊髓损伤后cdr1as表达水平的检测，可以预测脊髓损伤的预后情况——cdr1as表达量低，则脊髓损伤预后好。
[0051]
综上，本发明证实了cdr1as在脊髓损伤前后的差异性表达，并使用与cdr1as配对的sirna对其进行抑制，验证了cdr1as抑制剂对脊髓纤维化进程的改善作用，说明cdr1as表达的降低可改善脊髓损伤的预后，同时，对cdr1as表达的检测将有助于对脊髓损伤预后进行预测。