一种拮抗马铃薯多种病原真菌的木霉菌及其应用的制作方法

1.本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及一种拮抗马铃薯多种病原真菌的木霉菌及其应用。


背景技术：

2.马铃薯是世界上仅次于小麦、水稻和玉米的第四大粮食作物，而我国是世界上第一大马铃薯生产国。作为主要粮食、蔬菜和加工原料作物，马铃薯在我国广泛种植。马铃薯含有丰富的营养物质，因此在马铃薯种植过程中，常常遭受病害的困扰，尤其是长期连作种植导致病虫害大量聚集和流行，大大限制了马铃薯增产的潜能，同时也大大增加了马铃薯储藏损失。在我国广泛发生的病害中，以真菌危害为主，主要真菌病害包括晚疫病、早疫病、黑痣病、镰刀菌枯萎病等。
3.马铃薯早疫病主要由茄链格孢(alternaria solani)引起，病害可发生在叶片和块茎上，从而造成叶片死亡和块茎坏死。
4.马铃薯黑痣病是由立枯丝核菌(rhizoctonia solani)引起，主要危害马铃薯幼芽、茎基部及块茎。在马铃薯种植区，黑痣病日趋严重，发病较为普遍，一般可造成15％左右的减产。造成黑痣病的致病菌分类复杂，根据菌丝亲和力，立枯丝核菌被分为13个不同的融合群，其中，ag3被认为是引起马铃薯黑痣病的主要融合群类型；而ag5、ag7等也可以侵染马铃薯，但侵染症状不明显，同时，对马铃薯生产造成的危害远远低于ag3。
5.马铃薯镰刀菌枯萎病是由接骨木镰刀菌(fusarium sambucinum)、茄病镰刀菌(fusarium solani)等多种镰刀菌引起的一种真菌病害，其发生分布广泛，危害严重。该病一般从根部开始发病，引起维管束坏死，从而造成地上部的植株枯萎。
6.不同病害对马铃薯造成不同程度的危害，而目前发现的拮抗马铃薯晚疫病的生防菌种较多，而针对其他马铃薯的真菌病害的拮抗菌种相对较少，因此，提供一种除了能防治马铃薯晚疫病，还能防治其他的多种马铃薯真菌病害的生防菌种对解决马铃薯种植所存在的问题具有重要意义。


技术实现要素：

7.本发明的目的是提供一种拮抗马铃薯多种病原真菌的木霉菌及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，该木霉菌可以抑制多种真菌，降低马铃薯多种真菌病害的发生。
8.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
9.本发明提供一种木霉菌，分类命名为拟康氏木霉(trichoderma koningiopsis)，所述木霉菌于2021年07月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.23070，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。本发明还提供一种根据所述的木霉菌在防治植物病害中的应用。
10.优选的是，所述植物病害包括：马铃薯早疫病、马铃薯黑痣病以及马铃薯镰刀菌枯萎病。
11.本发明还提供一种根据所述的木霉菌在抑菌中的应用。
12.优选的是，所述木霉菌抑制茄链格孢菌、立枯丝核菌、接骨木镰刀菌以及茄病镰刀菌。
13.本发明还提供一种微生物菌剂，包含所述的木霉菌。
14.优选的是，其含有木霉菌孢子的浓度为1
×
106‑3×
108个/ml。
15.本发明还提供一种根据所述的微生物菌剂在防治植物病害中的应用，所述微生物菌剂应用于防治植物病害马铃薯早疫病、马铃薯黑痣病以及马铃薯镰刀菌枯萎病。
16.本发明还提供一种根据所述的微生物菌剂在抑菌中的应用，所述微生物菌剂应用于抑制茄链格孢菌、立枯丝核菌、接骨木镰刀菌以及茄病镰刀菌。
17.本发明公开了以下技术效果：
18.(1)本发明公开的木霉菌tc24菌株是从土壤中分离得到的真菌，实验证明，该菌可以通过抑制及寄生的方式，抑制茄链格孢菌、立枯丝核菌、接骨木镰刀菌以及茄病镰刀菌多种真菌菌丝的正常生长，且平均抑制率均在50％以上。
19.(2)该木霉菌对马铃薯无害，可以防治马铃薯早疫病、枯萎病、黑痣病多种病害，在应用中具有安全性，适合用于马铃薯多种病害的生物防治。
附图说明
20.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
21.图1为木霉菌tc24与接骨木镰刀菌和马铃薯茄链格孢菌对峙培养10d后培养情况；a为tc24与接骨木镰刀菌对峙培养；b为tc24与马铃薯茄链格孢菌对峙培养；
22.图2为木霉菌tc24与立枯丝核菌(ag3和ag5)对峙培养10d后培养情况；a为木霉菌tc24与ag3型立枯丝核菌对峙培养，a
‑
1为对照，a
‑
2为对峙培养；b为木霉菌tc24与ag5型立枯丝核菌对峙培养，b
‑
1为对照，b
‑
2为对峙培养；
23.图3为木霉菌tc24微生物菌剂抑制病原真菌发病情况(培养7d)；a为接种马铃薯茄链格孢菌；b为接种ag3型立枯丝核菌；c为接种ag5型立枯丝核菌；d为接种接骨木镰刀菌；e为空白对照和阴性对照；
24.图4为its1基因序列构建的系统发育树(最大似然法)；注:其余序列为ncbi上公布的its1基因序列；
25.图5为tef1基因序列构建的系统发育树(最大似然法)；注：其余序列为ncbi上公布的tef1基因序列。
具体实施方式
26.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
27.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每
个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
28.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
29.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本技术说明书和实施例仅是示例性的。
30.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
31.实施例1木霉菌得到分离、纯化及鉴定
32.1、从黑龙江省哈尔滨市呼兰地区的玉米田中均匀取土壤样品，称取10g采集的土壤样品，加入90ml无菌水，室温下150rpm振荡培养30min。之后，吸取上清液采用10倍梯度稀释法进行生防木霉菌的分离，每个选择性培养基(孟加拉红培养基：蛋白胨5g、葡萄糖10g、磷酸二氢钾1g、硫酸镁0.5g、琼脂20g、1/3000孟加拉红溶液100ml、蒸馏水1000ml)平板上均匀涂布100μl土壤稀释液。而后，在10
‑3稀释液平板上挑取单菌落在pda培养基(马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15g，蒸馏水定容至1000ml)上进行纯化，用于分类鉴定。根据《真菌鉴定手册》对菌株进行形态学测定。
33.形态学特征：
34.tc24在pda培养基上，25℃时气生菌丝生长迅速且茂盛，初为白色，后有绿色分生孢子产生，菌落无明显的环纹出现，培养72h菌株直径可长满9cm的培养皿。分生孢子梗直立，分生孢子梗直接产生瓶梗或产生二级分枝，二级分枝倾向于对生。分生孢子单孢，椭圆形，壁光滑。
35.2、分子生物学方法鉴定上述分离的菌种
36.(1)材料与方法
37.使用takara公司的plant dna kit试剂盒提取所分离的菌种的基因组，方法参照试剂盒说明书。以提取的dna为模板，利用its通用引物(its1/its4)和tef引物(tef728/tef1)进行pcr扩增鉴定种类。
38.其中各条引物序列如下：
39.its1为tccgtaggtgaacctgcgg；
40.its4为tcctccgcttattgatatgc；
41.tef728为gccatccttggagataccagc；
42.tef1为catcgagaagttcgagaagg。
43.pcr扩增条件：94℃预变性5min；94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸2min，35个循环，72℃延伸7min，4℃保存。pcr产物进行测序，并在ncbi网站上进行blast(www.ncbi.nlm.nih.gov/)比对。
44.(2)结果与分析
45.以提取的dna为模板，利用its通用引物进行pcr扩增，pcr产物连接至pmd18
‑
t载体后进行测序，获得大小为606bp的片段；而利用tef引物的pcr产物测序，连接t载体后则获得大小为640bp的片段。二者经过blast后，its1片段与trichoderma koningiopsis菌株tk1(mt111912.2)的序列相似度达到99％，tef1基因片段与t.koningiopsis菌株18asma006(mt671926.1)的序列相似度达到99％。应用dnaman软件与ncbi公布的t.koningiopsis菌株的基因序列，利用最大似然法分别构建系统发育树。its1系统发育树表明，tc24与t.koningiopsis的菌株同为一个分支(见图4)。进一步利用tef1基因的系统发育树分析发现，tc24仍然与t.koningiopsis为同一分支，而与近源的t.koningii为不同分支(见图5)。因此，经通用引物及看家基因同时鉴定，结果显示所分离的菌种属于trichoderma koningiopsis，将其命名为木霉菌tc24。
46.上述tc24的its1基因序列(长606bp，提交至genbank，登录号为mz669206)(seq id no：1)
47.ttccgtaggtgaacctgcggagggatcattaccgagtttacaactcccaaacccaatgtgaaccataccaaactgttgcctcggcggggtcacgccccgggtgcgtcgcagccccggaaccaggcgcccgccggagggaccaaccaaactctttctgtggtcccctcgcggacgttatttcttacagctctgagcaaaaattcaaaatgaatcaaaactttcaacaacggatctcttggttctggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgtgataagtaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgaatctttgaacgcacattgcgcccgccagtattctggcgggcatgcctgtccgagcgtcatttcaaccctcgaacccctccggggggtcggcgttggggatcgggaacccctaagacgggatcccggccccgaaatacagtggcggtctcgccgcagcctctcctgcgcagtagtttgcacaactcgcaccgggagcgcggcgcgtccacgtccgtaaaacacccaacttctgaaatgttgacctcggatcaggtaggaatacccgctgaacttaagcatatcaataagcggaggaa
48.tc24的tef1基因序列(seq id no：2)
49.tcatcgagaagttcgagaaggtaagctcatttcactactttttctaccacgcttggcacaattgtgcccgacaattctgttctcagtcttgtctgtttccctcgcagcgtcacaccccgcttggcctgtctacccctcctttggcagcaaatttttctgctgcctcgtttgactttagtggggtgtcaattttttttggcaacccccgctatcgccactgtccctcatcaatcgtcccaacaaaatgcactcattcaatcgcatcgtcttttgactcgatttctctgtggttcgttgtgctaatcatgcttcaatcaataggaagccgccgaactcggcaagggttccttcaagtacgcgtgggttcttgacaagctcaaggccgagcgtgagcgtggtatcaccatcgacattgccctctggaagttcgagactcccaagtactatgtcaccgtcattggtatgttattcctggctcttgacatgtcgaaatcatcatcctaacgtgccaatacagacgctcccggccaccgcgatttcatcaagaacatgatcactggtacctcccaggctgactgcgctatcctgattatcgctgccggtactggtgagttcgaggctggtatctccaaggatggca
50.实施例2本发明木霉菌tc24的抑菌效果
51.1、材料与方法
52.供试病原真菌：融合群分别为ag3和ag5的2株立枯丝核菌；1株接骨木镰刀菌；1株茄链格孢菌。
53.方法：平皿对峙培养法进行木霉菌tc24对4种供试病原真菌抑制作用的鉴定。
54.利用打孔器分别取木霉菌tc24和病原真菌的菌饼(直径约为6mm)用于对峙培养。处理组：在pda平板(直径为80mm)上，1个木霉菌tc24菌饼与1个病原真菌菌饼对峙接种，二
者之间的距离为40mm。对照组：木霉菌tc24和病原真菌分别接种于独立的pda平板上。接种物除茄链格孢菌在23℃下培养外，其余3种病原真菌的对峙培养在25℃下进行。拮抗试验重复3次，每次处理组和对照组各接种3个平板。
55.待空白对照长满整个培养皿时，测量靶标菌的对照组菌落直径和处理组菌落直径(接种木霉菌后的靶标菌直径)，计算抑制率并调查覆盖率级别。抑制率的计算公式为：
56.以覆盖率表示木霉菌株对靶标菌的寄生能力，其分级标准设为3级：ⅰ级：木霉菌菌落与病原菌菌落不接触，菌丝不能覆盖病原菌菌落；ⅱ级：木霉菌菌丝覆盖病原菌菌落1/2以下，病原菌菌落健康，颜色无变化；ⅲ级：木霉菌菌丝全部覆盖病原菌菌落，并在病原菌菌落上大量产孢，病原菌菌落萎缩，颜色变暗。
57.2、结果与分析
58.通过木霉菌与病原真菌的对峙培养，测量和统计对照组与处理组各菌落的直径，计算出木霉菌tc24的平均抑菌率和平均覆盖率指数(见表1)。
59.表1 木霉菌tc24对4种马铃薯病原真菌对峙培养中的抑菌率和覆盖率指数
60.病原真菌抑制组平均直径(cm)平均抑制率(％)平均覆盖率指数接骨木镰刀菌3.4257.50ii级ag3立枯丝核菌2.8965.63iii级ag5立枯丝核菌4.0651.70iii级茄链格孢菌2.8666ii级
61.表1对峙培养结果表明，木霉菌tc24对4种马铃薯病原真菌生长具有抑制作用，菌丝生长抑制效果即平均抑制率均超过50％。同时木霉菌tc24还可以寄生在4种马铃薯病原真菌的菌丝上，覆盖率指数分别ⅱ级和ⅲ级，其中，对于ag3和ag5 2种立枯丝核菌的覆盖率可达100％，同时，可以完全抑制丝核菌产生菌核(如图1和图2)。以上结果表明，通过抑制及寄生的方式，木霉菌tc24可以抑制4种马铃薯病原真菌菌丝的正常生长。
62.实施例3木霉菌tc24微生物菌剂抑制病原真菌发病
63.1、木霉菌tc24微生物菌剂的制备
64.上述分离纯化的木霉菌tc24接种到pda液体培养基(马铃薯200g，葡萄糖20g，蒸馏水定容至1000ml)，25℃，150rpm振荡培养1d，用无菌滤纸过滤掉菌丝后制备成木霉孢子悬浮液，即得到木霉菌tc24微生物菌剂。
65.2、木霉菌tc24微生物菌剂的抑菌效果
66.2.1材料与方法
67.用切块器将马铃薯块茎切成20mm
×
20mm，厚10mm的均匀薯块，去离子水浸泡冲洗掉表面的淀粉，1％naclo表面灭菌5min，用无菌去离子水冲洗3次。木霉孢子悬浮液浸泡薯块30min，取出后在超净工作台晾干。灭菌密封盒内放置无菌滤纸后，将晾干的薯块放置于密封盒中滤纸之上。每个薯块中心滴加10μl的1种病原真菌的孢子悬浮液(孢子浓度为1
×
107个/ml)。每种病原真菌3次重复，以无菌去离子水浸泡的薯块为空白对照，以木霉孢子悬浮液浸泡的薯块但不滴加病原真菌孢子悬浮液的处理为阴性对照，以无菌去离子水浸泡的薯块并滴加病原真菌孢子悬浮液为阳性对照。将密封盒放置于恒温培养箱中，25℃培养7d。
68.按照以下标准统计发病：0级：未见明显病斑；1级：病斑面积≤25％；2级：25％＜病斑面积≤50％；3级：50％＜病斑面积≤75％；4级：病斑面积大于75％。
69.2.2结果与分析
70.如图3所示，经过木霉菌tc24孢子悬浮液浸泡后的薯块分别接种不同病原真菌的孢子悬浮液后，与相应的病原真菌阳性对照薯块相比较，发病情况均有所降低。其中，阳性对照发病较轻的茄链格孢菌、ag3丝核菌和ag5丝核菌中，阳性对照发病为1级，而木霉菌tc24处理后的薯块发病为0级(图3a、b和c)；接骨木镰刀菌的阳性对照发病为2级，但经过木霉菌tc24孢子悬浮液处理后发病级别降为1级(图3d)。以上活体试验的结果表明，木霉菌tc24能够抑制4种马铃薯病原真菌的发病。
71.同时，经过木霉菌tc24孢子悬浮液浸泡后的薯块与空白对照一致(图3e)，即木霉菌tc24不会引起马铃薯病害。
72.以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。