一种葡糖酸醋杆菌及其应用的制作方法

1.本发明涉及微生物技术领域，更具体地，涉及一种葡糖酸醋杆菌及其应用。


背景技术：

2.中国每年烟叶产量为450
‑
500万吨，在烟草种植和加工过程中产生的低次烟叶、茎秆、杈烟等烟草废弃物可达烟叶总产量的25％。目前国内外对废、次烟叶产品的综合利用主要包括提取茄尼醇、烟碱和蛋白质等成分，以及制作有机肥料及鸡饲料。但仍有大量的废、次烟叶产品被作为废物丢弃或焚烧，造成了自然资源的浪费和极大的环境污染。
3.细菌纤维素(bc)具有与植物纤维素相似的化学成分，却具有更高的纯度、持水性、聚合度、结晶度，以及更良好的生物相容性和更高机械强度。基于其独特的优良性质，细菌纤维素作为一种新型纳米生物材料受到科学和工业界的广泛关注，并在食品工业、生物医学、造纸、声学器材、纺织等多个领域得到广泛研究和应用。细菌纤维素生产中培养基原料的成本偏高，尤其是碳源的成本偏高，制约了细菌纤维素的大规模生产和商业化进程。
4.烟草中富含糖、氨基酸、无机盐等组分，目前仅有的文献报道为利用木醋杆菌发酵烟草废料产生细菌纤维素。但是用于发酵的木醋杆菌在烟碱浓度高1.6mg/ml后生长受到抑制，产量降低，需要对烟草培养基进行降烟碱处理，这种处理方法不仅工艺复杂，而且成本较高。
5.因此，如何提供一种可利用烟草原料作为培养基发酵产生细菌纤维素的微生物菌株成为本领域亟需解决的技术难题。


技术实现要素：

6.本发明的一个目的是提供一种可利用烟草原料作为培养基发酵产生细菌纤维素的葡糖酸醋杆菌zt
‑
01的新技术方案。
7.根据本发明的第一方面，提供了一种葡糖酸醋杆菌zt
‑
01菌株。
8.该葡糖酸醋杆菌(gluconacetobacter sp.)zt
‑
01的保藏编号为cgmccno.21544。
9.根据本发明的第二方面，提供了一种微生物制剂。
10.该微生物制剂包括本公开所述的葡糖酸醋杆菌zt
‑
01。
11.根据本发明的第三方面，提供了一种本公开所述的葡糖酸醋杆菌zt
‑
01 或本公开所述的微生物制剂在制备细菌纤维素领域的应用。
12.根据本发明的第四方面，提供了一种细菌纤维素的制备方法。
13.该细菌纤维素的制备方法先将保藏编号为cgmcc no.21544的葡糖酸醋杆菌(gluconacetobacter sp.)zt
‑
01制成种子液，再将种子液接种于利用烟草原料制成的培养基中发酵。
14.可选的，所述烟草原料为烟末和/或烟梗。
15.可选的，包括如下步骤：
16.步骤(1)：配制含有葡萄糖、蛋白胨、酵母粉和一水合柠檬酸的水溶液，调节ph并灭
菌后，接种保藏编号为cgmcc no.21544的葡糖酸醋杆菌zt
‑
01，恒温震荡培养一段时间，制得种子液；
17.步骤(2)：以烟草提取液为烟草培养基，将种子液按照体积百分含量为6
‑
15％接种到烟草培养基中，培养一段时间。
18.可选的，所述步骤(1)具体如下：
19.配制含有20g/l葡萄糖、5g/l蛋白胨、5g/l酵母粉、1g/l一水合柠檬酸的水溶液，调节ph至4.8
‑
5，于121℃灭菌15min，接种保藏编号为cgmccno.21544的葡糖酸醋杆菌zt
‑
01后于25
‑
30℃，110
‑
150rmp的条件下恒温震荡培养24
‑
48h，制得种子液。
20.可选的，所述步骤(2)具体如下：
21.将卷烟厂废烟末和/或废烟梗按照料液比1:(5
‑
15)加入去离子水，于50℃
ꢀ‑
90℃下恒温加热提取0.5h
‑
2h，过滤得到的提取液于121℃下高温湿热灭菌 15min作为烟草培养基，将种子液按照体积百分含量为6
‑
15％接种到烟草培养基中，培养一段时间。
22.可选的，所述步骤(2)具体如下：
23.取薄片厂浓缩液稀释至薄片厂浓缩液的体积百分含量为10
‑
25％，于 121℃下高温湿热灭菌15min作为烟草培养基，将种子液按照体积百分含量为6
‑
15％接种到烟草培养基中，培养一段时间。
24.可选的，所述步骤(2)具体如下：
25.以烟草提取液为烟草培养基，将种子液按照体积百分含量为6
‑
15％接种到烟草培养基中，静置培养7
‑
14天；或者，
26.以烟草提取液为烟草培养基，将种子液按照体积百分含量为6
‑
15％接种到烟草培养基中，于50
‑
150rmp下震荡培养5
‑
8天。
27.本公开的葡糖酸醋杆菌可以耐受的烟碱浓度达到3.5mg/ml，无需对烟草培养基进行降烟碱处理，便可直接对烟草培养基进行发酵。不但细菌纤维素产量高，葡糖酸醋杆菌能够更直接更充分的利用烟草培养基底物，所得细菌纤维素含有烟草组分可部分或全部代替卷烟纸中木质纤维、再造烟叶粘合剂等，降低卷烟中杂气，在烟草废料综合利用方面具有较好的经济效益。
28.通过以下参照附图对本发明的示例性实施例的详细描述，本发明的其它特征及其优点将会变得清楚。
附图说明
29.被结合在说明书中并构成说明书的一部分的附图示出了本发明的实施例，并且连同其说明一起用于解释本发明的原理。
30.图1为本公开的葡糖酸醋杆菌zt
‑
01的菌株电镜图。
31.图2为葡糖酸醋杆菌zt
‑
01的进化树。
32.图3为实施例1中制得的细菌纤维素的电镜图。
33.图4为实施例1中制得的细菌纤维素的xrd图。
具体实施方式
34.现在将参照附图来详细描述本发明的各种示例性实施例。应注意到：除非另外具
体说明，否则在这些实施例中阐述的部件和步骤的相对布置、数字表达式和数值不限制本发明的范围。
35.以下对至少一个示例性实施例的描述实际上仅仅是说明性的，决不作为对本发明及其应用或使用的任何限制。
36.对于相关领域普通技术人员已知的技术、方法和设备可能不作详细讨论，但在适当情况下，所述技术、方法和设备应当被视为说明书的一部分。
37.在这里示出和讨论的所有例子中，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制。因此，示例性实施例的其它例子可以具有不同的值。
38.本公开提供了一种葡糖酸醋杆菌(gluconacetobacter sp.)zt
‑
01，现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏编号为cgmcc no.21544，菌种名称为葡糖酸醋杆菌，菌株编号为zt
‑
01，分类命名为葡糖酸醋杆菌,gluconacetobacter sp.，保藏时间为2020年12月 23日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
39.葡糖酸醋杆菌zt
‑
01的电镜图如图1所示，进化树如图2所示。
40.本公开还提供了一种微生物制剂，包括葡糖酸醋杆菌zt
‑
01。
41.本公开还提供了葡糖酸醋杆菌zt
‑
01或微生物制剂在制备细菌纤维素领域的应用。
42.本公开还提供了一种细菌纤维素的制备方法，其先将保藏编号为 cgmcc no.21544的葡糖酸醋杆菌(gluconacetobacter sp.)zt
‑
01制成种子液，再将种子液接种于利用烟草原料制成的培养基中发酵。
43.上述烟草原料可为烟末和/或烟梗。
44.本公开的细菌纤维素的制备方法可包括如下步骤：
45.步骤(1)：配制含有葡萄糖、蛋白胨、酵母粉和一水合柠檬酸的水溶液，调节ph并灭菌后，接种保藏编号为cgmcc no.21544的葡糖酸醋杆菌zt
‑
01，恒温震荡培养一段时间，制得种子液。
46.步骤(1)可具体如下：
47.配制含有20g/l葡萄糖、5g/l蛋白胨、5g/l酵母粉、1g/l一水合柠檬酸的水溶液，调节ph至4.8
‑
5，于121℃灭菌15min，接种保藏编号为cgmcc no.21544的葡糖酸醋杆菌zt
‑
01后于25
‑
30℃，110
‑
150rmp的条件下恒温震荡培养24
‑
48h，制得种子液。
48.步骤(2)：以烟草提取液为烟草培养基，将种子液按照体积百分含量为6
‑
15％接种到烟草培养基中，培养一段时间。
49.步骤(2)可具体如下：
50.将卷烟厂废烟末和/或废烟梗按照料液比1:(5
‑
15)加入去离子水，于50℃
ꢀ‑
90℃下恒温加热提取0.5h
‑
2h，过滤得到的提取液于121℃下高温湿热灭菌 15min作为烟草培养基，将种子液按照体积百分含量为6
‑
15％接种到烟草培养基中，培养一段时间。
51.步骤(2)可具体如下：
52.取薄片厂浓缩液稀释至薄片厂浓缩液的体积百分含量为10
‑
25％，于 121℃下高温湿热灭菌15min作为烟草培养基，将种子液按照体积百分含量为6
‑
15％接种到烟草培养基中，培养一段时间。
53.步骤(2)可具体如下：
54.以烟草提取液为烟草培养基，将种子液按照体积百分含量为6
‑
15％接种到烟草培养基中，静置培养7
‑
14天；或者，
55.以烟草提取液为烟草培养基，将种子液按照体积百分含量为6
‑
15％接种到烟草培养基中，于50
‑
150rmp下震荡培养5
‑
8天。
56.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所使用的材料和试剂，如无特殊说明，均可从商业途径得到，实验中使用的设备如无特殊说明，均为本领域技术人员熟知的设备。
57.烟草物料的获取方式如下：
58.烟草薄片浓缩液在河南中烟工业有限责任公司所属的某烟草薄片生产线上获得，由河南中烟有限责任公司提供；
59.烟粉由河南中烟工业有限责任公司所属的某卷烟厂获得，可根据需求按配方复配，由河南中烟有限责任公司提供。
60.实施例1
61.(1)种子液的制备：配制含有20g/l葡萄糖、5g/l蛋白胨、5g/l酵母粉、1g/l一水合柠檬酸的水溶液，ph4.8，121℃灭菌15min，接种葡糖酸醋杆菌zt
‑
01，于30℃、120rmp恒温震荡培养48h，形成种子液。
62.(2)烟草培养基制备：取薄片厂浓缩液稀释至10％，121℃高温湿热灭菌15min，作为烟草培养基。
63.(3)种子液按照体积比为6％接入到烟草培养基，30℃，110rmp，震荡培养6天，制得细菌纤维素t1。
64.获取细菌纤维素t1的电镜图及xrd图。
65.实施例2
66.(1)种子液的制备：配制含有20g/l葡萄糖、5g/l蛋白胨、5g/l酵母粉、1g/l一水合柠檬酸的水溶液，ph4.8，121℃灭菌15min，接种葡糖酸醋杆菌zt
‑
01，于30℃、110rmp恒温震荡培养24h，形成种子液。
67.(2)烟草培养基制备：卷烟厂废烟末按照料液比1:10，加入去离子水，于70℃下恒温加热提取2h，过滤得到提取液，121℃高温湿热灭菌15min，作为烟草培养基。
68.(3)种子液按照体积比为10％接入到烟草培养基，25℃静置培养14 天，制得细菌纤维素t2。
69.表1细菌纤维素产量
70.序号细菌纤维素产量(g/l)实施例14.3实施例25.6
71.由表1可见，利用葡糖酸醋杆菌zt
‑
01直接发酵烟草废料提取液或薄片浓缩液稀释液，所得细菌纤维产量较高。
72.由图3可以看出，发酵所得细菌纤维素呈网状结构，图4中的xrd图与典型的i型纤维素相同，使用segal方法基于峰强度计算结晶度指数(ci) 结晶度为90.04％，结晶度较高。
73.虽然已经通过例子对本发明的一些特定实施例进行了详细说明，但是本领域的技
术人员应该理解，以上例子仅是为了进行说明，而不是为了限制本发明的范围。本领域的技术人员应该理解，可在不脱离本发明的范围和精神的情况下，对以上实施例进行修改。本发明的范围由所附权利要求来限定。