一种用于高通量提取不同类型样本蛋白质组的方法与流程

1.本发明属于蛋白组学技术领域，具体地，涉及一种用于高通量提取不同类型样本蛋白质组的方法。


背景技术：

2.随着蛋白质组学的发展，其相应的液相质谱检测器也在快速发展，样本通量迅速变大，从以前单样本采集时间90
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180min，目前可以缩减到10min完成单样本数据采集，同时数据分析平台也在往云平台发展，上千样本同时处理仅需几天时间。然而，样本前处理目前还处在耗时长、效率低的单个样本操作阶段，此时，提高每批次样本数量及方法优化显得尤为重要。
3.目前提取样本蛋白质组的方法，需要每个样本单独操作，存在操作繁琐、耗时长、通量小等问题。比如：每个样本单独脱蜡复水工作需耗时至少60
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90分钟，而每个人每批次最多操作24个样本，同时耗时会增加为每批次2.5小时。后续接触性超声裂解每个样本耗时10分钟，并且通量受限于仪器数量。


技术实现要素：

4.发明目的：为解决上述技术问题，本发明提供了一种用于高通量提取不同类型样本蛋白质组的方法。
5.技术方案：为达到上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
6.一种用于高通量提取不同类型样本蛋白质组的方法，包括将样本置于带有疏水膜的多孔筛板中，然后使用dna酶进行样本裂解提取蛋白质组，选用微量滤板与可吸附蛋白的材料相结合的方法进行纯化除盐，最后解吸附，洗脱，即得。
7.优选的，所述样本为石蜡包埋样本，直接加入到多孔筛板中进行脱蜡复水。
8.更优选的，所述多孔筛板中进行脱蜡复水，是依次加入二甲苯、100％乙醇、75％乙醇、50％乙醇离心进行脱蜡复水。
9.可选的，所述样本为非石蜡包埋样本，经研磨后直接加入到多孔筛板中。
10.优选的，所述多孔筛板为96孔，可选8
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96孔。
11.优选的，所述的用于高通量提取不同类型样本蛋白质组的方法，包括以下步骤：
12.(1)将石蜡包埋样本置于带有疏水膜的多孔筛板，直接在多孔筛板中进行脱蜡复水。
13.(2)在每个孔中加入裂解液与dna酶孵育反应一段时间，离心收集每孔蛋白；
14.(3)将收集后样本加热进行解交联，测定蛋白浓度；
15.(4)选用还原烷基化试剂进行还原烷基化；
16.(5)将还原烷基化后蛋白溶液加入可吸附蛋白的材料及相应溶剂后混匀，转移到微量滤板上孵育、清洗及酶解；
17.(6)用溶剂对酶解后肽段样本进行清洗除盐、解吸附，使其从微量滤板上洗脱下
来。
18.进一步优选的：
19.步骤(1)中，采用96孔筛板时，优选1μm孔径具有疏水性筛板；依次加入二甲苯、100％乙醇、75％乙醇、50％乙醇离心进行脱蜡复水；实验过程中所有96孔板，均可改造为8联排、12联排、48孔等方式
20.步骤(1)也可适用于非石蜡包埋样本，非石蜡样本经研磨后可直接加入多孔筛板中进行后续步骤操作。
21.步骤(2)中，所述dna酶选自dnasei；
22.步骤(3)中，解交联的温度为95℃
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100℃。
23.步骤(4)中，所述还原烷基化试剂优选dtt与iam组合；
24.步骤(5)中，所述可吸附蛋白的材料选自sp3磁珠，所述微量滤板选自材质为sdb膜材质的微量滤板；所述酶解采用胰蛋白酶进行酶解。
25.本发明对蛋白质组提取方法及流程进行优化，实验流程如图1所示，使用如96孔筛板提高每批次处理样本数量，实现高通量，并且使用脱氧核糖核酸酶(即dna酶)裂解提取蛋白质组，摆脱仪器设备限制。同时使用可吸附蛋白的材料与膜相结合的方式进行酶解。该方法增加批次样本提取数量，有效缩短样本处理时间，摆脱了由仪器设备数量对实验通量的限制，同时提高酶解效率，并避免磁珠碎片进入后续步骤。
26.有益效果：与与现有单个样本操作方法相比，本方法具有以下优势：
27.(1)如使用的筛板具有96孔，单个筛板可载样本96个，同时可根据样本数量多少灵活调整，比如8孔、12孔等。
28.(2)采用脱氧核糖核酸酶处理样本进行蛋白质组提取，在不减少蛋白收率的情况下，有效节约操作时间。
29.(3)选用可吸附蛋白的材料与微量滤板结合的方法，材料上酶解可以提高酶解效率，微量滤板可避免材料碎片进入上机体系堵塞仪器。同时，微量滤板也可满足96孔高通量操作。
附图说明
30.图1为本发明方法实验流程示意图。
31.图2为样本相关性比较。
具体实施方式
32.以下对本发明方案进行全面的描述，所述的实施案例是本发明中最优选实施方式，但本发明并不限于以下实施例。
33.实验组
34.1.将石蜡卷样本放到疏水性96孔筛板中，依次加入二甲苯、100％乙醇、75％乙醇、50％乙醇，进行脱蜡复水
35.2.在每个孔中加入适量裂解液及dnasei反应
36.3.离心用新96孔板收集蛋白，95℃反应1h进行解交联
37.4.选用bca方法测定蛋白浓度
38.5.剩余样本加入dtt56℃反应30min
39.6.加入iam室温避光反应30min
40.7.将还原烷基化后蛋白溶液加入磁珠混匀
41.8.调节ph至酸性，立即加入一定体积乙腈，轻轻震荡混匀
42.9.将样本转移至已活化微量sdb筛板中，室温条件下孵育8min，离心弃滤液
43.10.使用试剂清洗后，加入酶解体系，37℃反应2
‑
4h
44.11.再次加入胰酶，37℃反应3h
45.12.酶解反应结束后，加入试剂清洗，离心弃滤液
46.13.加入洗脱液洗脱肽段，离心收集滤液
47.14.使用超高效液相联合orbitrap hf进行样本检测，90min梯度，60min有效梯度dda检测比较
48.对照组
49.1.将石蜡卷样本放入1.5ml离心管中，依次加入3次二甲苯、100％乙醇、75％乙醇、50％乙醇，每次孵育10min离心5min弃上清，进行脱蜡复水
50.2.加入适量裂解液，接触性超声破碎仪进行超声裂解
51.3.95℃反应1h进行样本解交联
52.4.bca方法测定蛋白浓度
53.5.剩余样本加入dtt，56℃反应30min
54.6.加入iam室温避光反应30min
55.7.将还原烷基化后蛋白溶液加入磁珠混匀
56.8.调节ph至酸性，立即加入一定体积乙腈，轻轻震荡混匀
57.9.室温条件下震荡反应8min，磁力分离，去上清，使用试剂清洗磁珠
58.10.在样本中加入适量酶解体系，37℃反应2
‑
4h
59.11.再次加入胰酶，轻轻混匀，37℃反应3h
60.12.向上述酶解产物中加入足量乙腈，轻轻震荡混匀，室温孵育8min
61.13.磁力分离去上清，清洗磁珠，加入洗脱液洗脱肽段，磁力分离，吸取上清上机。
62.实验结果：
63.在实验过程中，按对照组方法操作，完成一批次样本需要3天，每个人最多完成24个样本。而按实验组方法操作，每个人可在3天时间内完成96个样本。
64.蛋白定量结果显示，96孔筛板进行实验优化后，并不会增加蛋白损失，降低蛋白的收率(如表1所示)
65.表1.提取蛋白浓度与蛋白量比较
66.67.同时，对于上机数据分析表明实验组与对照组肽段及蛋白鉴定数相差不大(如表2)，样本间的相关性很高(如图2)
68.表2.肽段、蛋白鉴定数比较
[0069][0070]