一种靶向mesothelin的嵌合抗原受体及其应用的制作方法

1.本发明涉及一种嵌合抗原受体，尤其涉及一种靶向mesothelin的嵌合抗原受体及其应用。


背景技术：

2.嵌合抗原受体(car)是模拟t细胞受体功能的人工受体，其融合了抗原与抗体或配体与受体的识别和结合特异性以及效应t细胞对被识别的肿瘤细胞的杀伤能力。car由cd8a引导肽、抗原识别区(配体或单链抗体或fab片段)、跨膜区、以及t细胞的一系列信号转导区(cd28，cd3，cd137胞内信号传导结构域)依次连接而成。t细胞经修饰后，表面表达的car首先通过抗原识别区与肿瘤细胞表面抗原结合，然后通过其信号转导区将活化信号传递至胞内，靶向地激活t细胞对肿瘤细胞杀伤活性。将表达car的dna序列克隆入慢病毒表达载体，并感染从患者血中分离出的t细胞，使t细胞表面表达相应的car，再将此修饰的t细胞再输回患者体内，修饰后的t细胞可以在患者体内靶向性地杀伤表达相关抗原的肿瘤细胞，达到清除肿瘤细胞的效果。
3.mesothelin是一种肿瘤相关抗原，在大多数的恶性胸膜间皮瘤、胰腺癌、卵巢癌及某些肺癌中有表达，并且正常组织中表达范围窄、表达量低。因而可以作为恶性胸膜间皮瘤、胰腺癌、卵巢癌的免疫治疗靶点。
4.目前car
‑
t技术的应用还局限于白血病、骨髓瘤、淋巴瘤等血液系统肿瘤，在诸如胰腺癌等实体肿瘤中的应用较少。


技术实现要素：

5.发明目的：本发明的目的提供一种靶向mesothelin的嵌合抗原受体；本发明的另一目的提供一种靶向mesothelin的嵌合抗原受体的应用。
6.技术方案：本发明第一方面提供一种靶向mesothelin的嵌合抗原受体，包括依次连接的胞外区、跨膜区和胞内结构域；胞外区包括胞外信号肽、抗原识别区和铰链区，抗原识别区为全人源anti
‑
mesothelin scfv；胞内结构域包括胞内信号结构域和胞内共刺激信号结构域。
7.优选的，所述跨膜区选自cd4、cd8a、cd28、4
‑
1bb跨膜区中的一种；胞内信号结构域选自cd27、cd28、4
‑
1bb、ox40、cd3ζ结构域中的一种；胞内共刺激信号结构域选自cd27、cd28、4
‑
1bb、ox40、cd3ζ结构域中的一种。
8.优选的，全人源anti
‑
mesothelin scfv的重链氨基酸序列如seq no.1所示。
9.seq no.1：
10.qlqlqesgpglvkpsetlsltctvsggsissssyywgwirqtpekglewia yiynsgttkfnpslkgrvtismdasknqlsmklssvtsadtavyfcardqgns pypdafdvwgqgtlvtvss
11.全人源anti
‑
mesothelin scfv的轻链氨基酸序列如seq no.2所示。
12.seq no.2：
13.qsaltqppsasgspgqsvtisctgtssdvggynyvswyqqhpgkapklmiyevskrpsgvpdrfsgsksgntasltvsglqaedeadyycssyagsnnyvfgtgtkvtvl
14.优选的，胞内信号结构域cd3ζ进行突变，突变后的cd3ζ的氨基酸序列如seqno.3所示。
15.seq3:
16.rvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrqnpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgqghdglyqglstatkdtydalhmqalppr
17.优选的，胞外信号肽为cd8a信号肽，cd8a信号肽的氨基酸序列如seqno.4所示。
18.seq4：
19.malpvtalllplalllhaarp
20.优选的，铰链区为cd8a铰链区，cd8a铰链区氨基酸序列如seqno.5所示。
21.seq5：
22.tttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacd
23.优选的，跨膜区为cd8a跨膜区，cd8a跨膜区的氨基酸序列如seqno.6所示。
24.seq6：
25.iyiwaplagtcgvlllslvitlyc
26.优选的，胞内共刺激信号结构域包含4
‑
1bb共刺激信号区，4
‑
1bb共刺激信号区的氨基酸序列如seqno.7所示。
27.seq7：
28.krgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeggcel
29.本发明第二方面提供一种多核苷酸序列，所述多核苷酸序列选自：(1)编码上述的嵌合抗原受体的多核苷酸序列；和(2)上述的嵌合抗原受体的多核苷酸序列的互补序列。
30.优选的，所述多核苷酸序列如seqno.8或seqno.9所示。
31.seq8：
32.malpvtalllplalllhaarpqlqlqesgpglvkpsetlsltctvsggsissssyywgwirqtpekglewiayiynsgttkfnpslkgrvtismdasknqlsmklssvtsadtavyfcardqgnspypdafdvwgqgtlvtvssggggsggggsggggsqsaltqppsasgspgqsvtisctgtssdvggynyvswyqqhpgkapklmiyevskrpsgvpdrfsgsksgntasltvsglqaedeadyycssyagsnnyvfgtgtkvtvltttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeggcelrvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrqnpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgqghdglyqglstatkdtydalhmqalppr
33.seq9:
34.atggccctgcccgtgaccgccctgctgctgcccctggccctgctgctgca50cgccgcccgcccccagctgcagctgcaggagagcggccccggcctggtga100agcccagcgagaccctgagcctgacctgcaccgtgagcggcggcagcatc150agcagcagcagctactactggggctggatccgccagacccccgagaaggg200cctggagtggatcgcctacatctacaacagcggcaccaccaagttcaacc250ccagcctgaagggccgcgtgaccatcagcatggacgccagcaagaaccag300ctgagcatgaagctgagcagcgtgaccagcgccgacaccgccgtgtactt350ctgcgcccgcgaccagggcaacagcccctaccccgacgccttcgacgtgt400ggggccagggcaccctggtgaccgtgagcagcggcggcggcggcagcggc450ggcggcggcagcggcggcggcggcagccag
agcgccctgacccagccccc500cagcgccagcggcagccccggccagagcgtgaccatcagctgcaccggca550ccagcagcgacgtgggcggctacaactacgtgagctggtaccagcagcac600cccggcaaggcccccaagctgatgatctacgaggtgagcaagcgccccag650cggcgtgcccgaccgcttcagcggcagcaagagcggcaacaccgccagcc700tgaccgtgagcggcctgcaggccgaggacgaggccgactactactgcagc750agctacgccggcagcaacaactacgtgttcggcaccggcaccaaggtgac800cgtgctgaccaccacccccgccccccgcccccccacccccgcccccacca850tcgccagccagcccctgagcctgcgccccgaggcctgccgccccgccgcc900ggcggcgccgtgcacacccgcggcctggacttcgcctgcgacatctacat950ctgggcccccctggccggcacctgcggcgtgctgctgctgagcctggtga1000tcaccctgtactgcaagcgcggccgcaagaagctgctgtacatcttcaag1050cagcccttcatgcgccccgtgcagaccacccaggaggaggacggctgcag1100ctgccgcttccccgaggaggagggcggctgcgagctgcgcgtgaagttca1150gccgcagcgccgacgcccccgcctaccagcagggccagaaccagctgtac1200aacgagctgaacctgggccgccgcgaggagtacgacgtgctggacaagcg1250ccgcggccgcgaccccgagatgggcggcaagccccgccgccagaaccccc1300aggagggcctgtacaacgagctgcagaaggacaagatggccgaggcctac1350agcgagatcggcatgaagggcgagcgccgccgcggccagggccacgacgg1400cctgtaccagggcctgagcaccgccaccaaggacacctacgacgccctgc1450acatgcaggccctgcccccccgc
35.本发明第三方面提供一种载体，所述载体含有上述的多核苷酸序列。
36.本发明第四方面提供一种宿主细胞，所述细胞含有上述多核苷酸序列，或含有上述载体。
37.本发明第五方面提供上述的嵌合抗原受体、上述多核苷酸序列、上述载体、上述的宿主细胞用于制备预防或治疗肿瘤药物中的应用。
38.有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：本发明的嵌合抗原受体t细胞对mesothelin阳性肿瘤细胞有很强的杀伤活性，使用全人源抗体做为scfv,不具有免疫原性，可以重复进行给药，增强car
‑
t细胞的治疗效果。
附图说明
39.图1为本发明中嵌合抗原受体的示意图；
40.图2为mesothelin
‑
car
‑
t细胞对靶细胞bxpc
‑
3的裂解杀伤能力对比结果图；
41.图3为mesothelin
‑
car
‑
t细胞对靶细胞skov
‑
3的裂解杀伤能力对比结果图；
42.图4为mesothelin
‑
car
‑
t细胞分泌ifn
‑
γ和il
‑
2能力对比结果图；
43.图5为mesothelin
‑
car
‑
t在胰腺癌动物模型中的体内药效结果图；
44.图6为小鼠肿瘤接种位置示意图。
具体实施方式
45.下面对本发明的技术方案作进一步说明。
46.实施例1嵌合抗原受体(car)慢病毒表达载体构建
47.以cd137的胞内结构域和cd3zeta的itam区作为激活信号，与mesothelin的单链抗体进行融合，构建嵌合抗原受体表达载体，并亚克隆至plvx
‑
ef1a载体中。构建的嵌合抗原受体慢病毒表达载体中各个元件的组合顺序如图1所示：
48.所构建的嵌合抗原受体中各元件氨基酸序列分别为：
49.信号肽：seq no.4
50.胞外抗原结合区重链序列：seq no.1
51.胞外抗原结合区轻链序列：seq no.2
52.cd8铰链区：seq no.5
53.cd8跨膜区：seq no.6
54.cd137胞内域：seq no.7
55.cd3ζ(zeta)：seq no.3
56.实施例2慢病毒制备
57.具体实验步骤如下：
58.s1、准备15cm皿，接种5*106个细胞，加入完全培养基(dmem高糖、 10％fbs、双抗)，置于37℃、5％co2培养箱，过夜培养。
59.s2、从冰箱中取出100μm pei及慢病毒包装质粒(lenti
‑
ef1a
‑
car、pgp、 pvsvg)，室温解冻后，用移液枪上下吹打完全混匀。取出pbs或hbss缓冲液，温热至室温。取2ml pbs至6孔板的一个孔，分别加入10μg plvx
‑
ef1a
‑
car、 4μg pgp、2μg pvsvg，移液枪上下吹打充分混匀后，加入18μl 100μm pei，立即用移液器上下吹打混匀，室温下静置10分钟。
60.s3、将上述dna/pei复合物逐滴加入到15cm培养皿中，轻轻晃动培养皿，充分混匀。将培养皿置于37℃、5％co2培养箱，培养6～8小时后，将含有转染试剂的培养基去掉，更换为新鲜的完全培养基。
61.连续培养48小时后，收集培养皿中含有病毒的培养基上清，用0.45μm的滤膜过滤，加入20％体积的50％peg6000溶液，4度孵育2h，转至离心管中，配平后，3000xg 4℃离心0.5小时。离心结束后，在生物安全柜中，小心将离心管中的液体吸去，加入500μl pbs缓冲液将沉淀重悬，将病毒置于
‑
80℃保存。
62.实施例3原代t细胞的分离
63.具体实验步骤如下：
64.s1、将淋巴细胞分离液上下颠倒数次，充分混匀lymphoprep试剂。
65.s2、在生物安全柜中，向50ml离心管(或15ml离心管，视分离血样的体积而定)中加入15ml lymphoprep试剂，备用。
66.s3、将血样使用等体积的pbs 2％fbs进行稀释。
67.s4、使用移液枪小心的将稀释后的血样沿管壁缓慢添加至分离试剂的上层，避免分离试剂与血样的混合。
68.s5、将离心机设置为800xg，转速下降速度设为最慢，室温离心20分钟。
69.s6、离心结束后，收集上层浅黄色血清至另一个无菌离心管中，贮存于
‑
80℃。
70.s7、轻轻的将处于血清与分离试剂界面的单核细胞层吸至一个新的离心管中，使用培养基洗涤细胞一次。
71.s8、将细胞密度调整至1*108细胞/ml(总体积不超过2.5ml)，重悬于5ml 的圆底管中。
72.s9、加入100μl/ml的抗体cocktail，充分混匀后，室温孵育15分钟。
73.s10、取出磁珠，用移液枪上下吹打至少5次，充分混匀。
74.s11、吸取50μl磁珠/ml至上述样品中，充分混匀后，室温孵育10分钟。
75.s12、添加完全培养基至管内总体积为2.5ml，将管子(开盖)插入磁极中，室温静置5分钟。
76.s13、孵育完毕后，管子继续留在磁极中，轻轻倒置，将管内的细胞倒出。
77.s14、将细胞重悬于x
‑
vivo 15培养基中，并添加10％fbs，300u/ml il
‑
2, 5ng/ml il
‑
15和10ng/ml il
‑
7。
78.实施例4原代t细胞的激活与慢病毒感染
79.具体实验步骤如下：
80.s1、调整细胞密度至1*106细胞/ml，加入细胞因子及抗体复合物(终浓度为300u/ml的il
‑
2、10ng/ml il
‑
7、5ng/ml il
‑
15、500ng/ml anti
‑
cd3(okt3)、2ug/ml anti
‑
cd28)，连续培养48小时。
81.s2、按照moi＝20，计算所需要的病毒量。计算公式如下：所需病毒量(ml) ＝(moi*细胞数量)/病毒滴度
82.s3、从
‑
80℃冰箱取出病毒后，迅速在37℃水浴锅中融化。在六孔板中加入上述计算所得的病毒量，添加终浓度为6μg/ml的polybrene，充分混匀后，使用封口膜将六孔板四边密封，800xg离心1小时。
83.s4、离心结束后，撕掉封口膜，将六孔板置于37℃5％co2的培养箱中，继续培养24小时。
84.s5、250xg离心10分钟，去掉含有病毒的培养基上清，用新鲜培养基重悬细胞沉淀，将细胞转移至新的六孔板中，继续培养3
‑
6天备用。
85.实施例5 car
‑
t细胞对靶细胞裂解
86.具体实验步骤如下：
87.s1、调整靶细胞状态至对数生长期，在进行实验前需连续传代2次；
88.s2、用胰酶将贴壁的靶细胞消化重悬于完全培养基中，调整细胞密度至5*105个/ml，取一块新的96孔板，按照100μl/孔的量接种靶细胞。96孔板四周未用的孔，每孔加入100μl无菌水，以防中间的实验孔水分蒸发。将孔板置于5％co
2 37℃培养箱中，过夜培养。
89.s3、离心收集上述制备的car
‑
t细胞，使用无血清的1640培养基重悬；从培养箱中取出96孔板，将孔中的培养基完全吸出，用无菌pbs轻轻将细胞洗涤一遍，然后按照上述e/t比例，加入car
‑
t细胞，并将最终体积补至100μl/孔； maxi lysis和mini lysis为接种同样数量的靶细胞，但是不加car
‑
t细胞。将孔板置于5％co
2 37℃培养箱中，培养6小时。
90.s4、培养结束后，将孔板从培养箱中取出，向maxi lysis孔加入ldh检测试剂盒中的裂解液，将其中的靶细胞完全裂解后，1200xg室温离心96孔板5 分钟，轻轻的将板取出，从每孔中转移50μl至另一个新的96孔板中，加入ldh 检测试剂后，使用酶标仪读取od值。
91.靶细胞裂解百分数计算公式：
[0092][0093]
s5、将上述处理后的数据使用graphpad 6.0进行作图。
[0094]
实验结果：
[0095]
以car
‑
t细胞为效应细胞，以天然表达mesothelin的胰腺癌细胞株和卵巢癌细胞株为靶细胞，按照不同的效靶比例建立共培养体系，即96孔板中，每个孔内固定靶细胞的数
量为50000个，分别加入不同数量的car
‑
t细胞，共培养体系用无血清培养基进行培养，连续培养8小时后，取出孔板，室温1200xg离心10分钟，使悬浮的细胞全部沉淀到孔板底部，然后从每个孔中取出30微升上清，检测培养基上清中ldh的释放量，以此反映car
‑
t细胞对靶细胞的裂解能力，结果如图2至4所示，靶向mesothelin的嵌合抗原受体t细胞，在效靶比为 1：1时即可高效的介导t细胞对肿瘤细胞或重组细胞的杀伤；随着效靶比的升高，mesothelin
‑
car
‑
t细胞对靶细胞bxpc3及skov3的杀伤作用也随之升高，在效靶比为8:1时达到最高。
[0096]
实施例6 car
‑
t细胞因子分泌水平检测
[0097]
具体实验步骤如下：
[0098]
s1、调整靶细胞状态至对数生长期，在进行实验前需连续传代2次；
[0099]
s2、用胰酶将贴壁的靶细胞消化重悬于完全培养基中，调整细胞密度至5*105个/ml，取一块新的96孔板，按照100μl/孔的量接种靶细胞。96孔板四周未用的孔，每孔加入100μl无菌水，以防中间的实验孔水分蒸发。将孔板置于5％co
2 37℃培养箱中，过夜培养。
[0100]
s3、离心收集上述制备的car
‑
t细胞，使用无血清的1640培养基重悬；从培养箱中取出96孔板，将孔中的培养基完全吸出，用无菌pbs轻轻将细胞洗涤一遍，然后按照上述e/t比例，加入car
‑
t细胞，并将最终体积补至100μl/孔；将孔板置于5％co
2 37℃培养箱中，培养6小时。同时设置对照t细胞组。
[0101]
s4、培养结束后，将孔板从培养箱中取出，1200xg室温离心96孔板5分钟，轻轻的将板取出，从每孔中转移50μl培养基上清，使用elisakit检测ifn
‑
γ和il
‑
2的表达，使用酶标仪读取od值。
[0102]
s5、将上述获取的数据使用graphpad 6.0进行作图。
[0103]
实验结果：
[0104]
以car
‑
t细胞为效应细胞，以天然表达mesothelin的胰腺癌细胞株bxpc3 为靶细胞，按照不同的效靶比例建立共培养体系，即96孔板中，每个孔内固定靶细胞的数量为50000个，分别加入不同数量的car
‑
t细胞，共培养体系用无血清培养基进行培养，连续培养8小时后，取出孔板，室温1200xg离心10分钟，使悬浮的细胞全部沉淀到孔板底部，然后从每个孔中取出30微升上清，用elisa 的方法检测培养基上清中由car
‑
t细胞被肿瘤细胞激活后分泌的ifn
‑
γ和il
‑
2 的表达量；结果如图5所示，靶向mesothelin的嵌合抗原受体t细胞与靶向肿瘤细胞结合后，可以有效的激活原代t细胞，并引起细胞因子分泌表达量的升高；在效靶比为1:1时，car
‑
t细胞被肿瘤细胞激活后，即可分泌大量的和il
‑
2,显著高于对照t细胞；在效靶比为8:1时分泌量达到最高值。
[0105]
实施例7 car
‑
t体内药效实验
[0106]
s1、收集对数生长期的bxpc3细胞，去除培养液并用pbs洗两次后接种(荷瘤前、荷瘤后细胞存活率为97.3％、94.6％)。肿瘤细胞通过皮下接种ncg小鼠，每只小鼠接种1x107个细胞/100ul。接种位点如图6所示1号位。
[0107]
s2、分组给药，小鼠平均肿瘤体积为100.91mm3，根据肿瘤体积进行随机化分组。每组6只，2组，共12只小鼠。分组当天定义为d0天，并在分组当天给药处理。
[0108]
s3、实验观察和数据采集，细胞接种后，每周常规监测肿瘤对动物正常行为的影响。具体内容有实验动物的活动性，摄食和饮水情况，体重增加或降低情况，眼睛、被毛及其它异常情况。
[0109]
开始给药后，观测肿瘤大小并称量小鼠体重。瘤体积计算方式为：肿瘤体积 (mm3)＝0.5
×
(肿瘤长径
×
肿瘤短径2)。
[0110]
实验结果：msln
‑
cart细胞在小鼠肿瘤模型中有显著药效。