一株产虾青素菌株及其应用的制作方法

1.本发明属于生物发酵技术领域，具体涉及一株产虾青素菌株及其应用。


背景技术：

2.虾青素作为一种天然类胡萝卜素，具有很强的清除自由基的活性，可以保护脂质过氧化和低密度脂蛋白
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胆固醇、细胞膜、细胞和组织的氧化损伤。此外，虾青素还具有许多基本的生物学功能，包括防止必需的多不饱和脂肪酸氧化和防止紫外线效应，支持良好的视力和眼睛健康，以及增强免疫反应，因其具有较高的抗氧化活性，已被广泛应用于食品添加剂、色素或抗氧化剂以及营养食品。
3.酵母，相较其他微生物，具有培养简单、生物量大、底物利用谱广泛，以及工业化中适应性强等众多优点。由于化学合成的虾青素不能够用于人类，能够生物合成虾青素的微生物成为虾青素生产的研究热点。雨生红球藻、红法夫酵母菌等是目前研究较多的产虾青素菌株，目前用于虾青素生产的微生物主要是雨生红球藻，但由于其生产周期长，需要充足光照等不利条件，但红法夫酵母生长周期短，发酵条件简单，因此是生物法生产虾青素的潜力菌株。，目前一般是通过优化发酵条件或筛选/诱变结合发酵条件优化的方式以获得更高的虾青素产量，但选育富含虾青素的菌株仍是最重要的研究方向。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一株产虾青素菌株及其应用。
5.本发明的目的通过下述技术方案实现：一株产虾青素菌株，分类命名为红法夫酵母（xanthophyllomyces dendrorhous）dw6，保藏号为cctcc no：m 2021732。
6.本发明的另一目的在于提供上述菌株在生产虾青素中的应用。
7.作为一种优选的实施方式，本发明通过微生物发酵的方式生产虾青素，包括：将所述产油酵母菌接种至ym固体培养基上培养进行菌种活化后，取单菌落接种至种子培养基进行二代种子培养，种子培养得到的种子液接种至发酵培养基培养，获取虾青素产品。
8.进一步的，所述菌株发酵的碳源选自葡萄糖、蔗糖、果糖、阿拉伯糖、甘油、木糖、甘露糖、麦芽糖、纤维二糖中的一种或多种。
9.进一步的，发酵培养基中氮源为硫酸铵、酵母粉和玉米浆粉。
10.进一步的，所述两代种子培养的方式为：1）一代种子培养：从ym固体培养基上取单菌落，接种于种子培养基恒温培养；2）二代种子培养：取一代种子培养的培养液按10%接种量接种于新的种子培养基，和步骤1）同样条件下恒温培养，得到用于发酵培养的种子液。
11.进一步的，所述恒温培养的条件为20℃
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22℃，200 rpm下培养24h。
12.进一步的，发酵培养的温度为20℃
‑
22℃。
13.进一步的，在500rpm下发酵培养。
14.进一步的，发酵培养时，从第二天起每天补充碳源至初始浓度。
15.进一步的，发酵液离心处理后获得含虾青素的菌体，在经由分离得到虾青素产品。
16.虾青素的提取方式有很多，本发明的提取方式为：取发酵液离心洗涤，收集菌体，破碎菌体，萃取，离心收集上清液，获得虾青素。
17.本发明相对于现有技术，具有如下的有点及效果：本发明提供一株高产虾青素的红法夫酵母菌，为生物生产虾青素提供了新的高产菌株，将本发明的菌株在5l发酵罐中发酵，所得产品中虾青素含量为300 mg/l，细胞干重达36 g/l，发酵提取出的虾青素可用于饲料、保健品、化妆品等，而提取完的菌体可作为蛋白添加进动物饲料，提升了饲料的品质，缓解了饲料生产对于粮食的巨大需求压力。
附图说明
18.图1是实施例2菌株摇瓶发酵的虾青素产量示意图。
19.图2是实施例3菌株发酵罐发酵的虾青素产量示意图。
20.图3是实施例4菌株利用不同碳源发酵产虾青素示意图。
21.本发明所述的生物材料，其分类命名为红法夫酵母(xanthophyllomyces dendrorhous)dw6，于2021年6月18日保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏编号为cctcc no：m 2021732，地址：中国.武汉.武汉大学。
具体实施方式
22.下面结合实例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。此外，实施例所描述的仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
23.实施例中使用的培养基如下：ym培养基：葡萄糖10g/l、蛋白胨5g/l、酵母粉3g/l、麦芽提取物3 g/l、其余为水；ym固体培养基额外添加琼脂粉20 g/l。配制方法为：称取葡萄糖1g，蛋白胨0.5 g，酵母粉0.3 g，麦芽提取物0.3 g，溶于100 ml蒸馏水中，5m naoh和5 m的h3po4调节ph至5.5
±
0.2。ym固体培养基再加入2 g琼脂粉，摇匀，115℃灭菌20 min。
24.发酵培养基：葡萄糖30 g/l，硫酸铵1.5 g/l，磷酸二氢钾1.5 g/l，七水硫酸镁1.5 g/l，酵母粉1.5 g/l，玉米浆粉10 g/l。葡萄糖配置成母液单独灭菌。
25.种子培养基和发酵培养基相同。
26.实施例中微生物细胞干重、虾青素含量测定方法为：微生物细胞干重测定方法：用提前称量好的离心管取适量发酵液，离心洗涤两次，然后放置烘箱65℃烘干至恒重。
27.虾青素的提取及测定方法：紫外分光光度测定法测定虾青素含量。
28.取1ml发酵液于12000rpm下离心2min，去离子水洗涤两次，收集菌体，用滤纸吸干管壁水滴，加入1ml 55℃预热的二甲亚砜 (dmso)，振荡悬浮，加入丙酮 2ml，漩涡振荡20
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30s，然后避光静置15分钟，4℃，12000r/m 离心 2min，上清液用分光光度计测od474。如菌泥仍有色可重复抽提至白色为止，虾青素含量计算公式如下：
虾青素（mg/l）=式中：a—od
474mm
值v1—有机溶剂的总体积(ml)；2150——比消光系数v2——发酵液体积(ml)；10000：单位换算后的作数(mg/l)实施例1本实施例具体说明红法夫酵母dw6菌株的筛选方式。
29.利用取自南京工业大学君子湖边的土壤，进行微生物重悬后，划线于含有氨苄抗性的ypd平板上，挑取颜色为红色的菌落再划线，20℃培养分离获得单菌落，再将菌液稀释涂布于含有适量二苯胺的ym平板，选取颜色深红的菌落进行发酵测定，获得高产虾青素的菌株，经鉴定为红法夫酵母（xanthophyllomycesdendrorhous）菌株，命名为dw6。
30.实施例2红法夫酵母dw6菌株摇瓶发酵生产虾青素。
31.（1）将实施例1选育出的红法夫酵母（xanthophyllomycesdendrorhous）dw6接种至ym固体培养基，20℃
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22℃培养2
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3天，进行菌种活化；（2）种子培养，包括：a.一代种子培养：从ym固体培养基上取单菌落，接种于种子培养基20℃
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22℃，200rpm下恒温培养48h；b.二代种子培养：取一代种子培养的培养液按10%接种量接种于新的种子培养基，和a同样条件下恒温培养，得到用于发酵培养的种子液。
32.（3）种子培养得到的种子液接种至装有发酵培养基的三角瓶中发酵，21℃
±
1℃，200rpm，发酵时第二天起每天补充葡萄糖至浓度为30g/l，培养五天，测定细胞干重，提取发酵液中虾青素，测定虾青素含量，重复实验，如图1所示，发酵五天后虾青素含量可达87mg/l（每l发酵液产虾青素的量），且产量仍在增长。
33.实施例3红法夫酵母dw6菌株发酵罐发酵生产虾青素。
34.（1）将实施例1选育出的红法夫酵母（xanthophyllomycesdendrorhous）dw6接种至ym固体培养基，20℃
‑
22℃培养2
‑
3天，进行菌种活化；（2）种子培养，包括：a.一代种子培养：从ym固体培养基上取单菌落，接种于种子培养基20℃
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22℃，200rpm下恒温培养48h；b.二代种子培养：取一代种子培养的培养液按10%接种量接种于新的种子培养基，和a同样条件下恒温培养，得到用于发酵培养的种子液。
35.（3）种子培养得到的种子液接种至装有发酵培养基的5l发酵罐中，21℃
±
1℃，500rpm，发酵时第二天起每天补充葡萄糖至浓度为30g/l，培养八天，测定细胞干重，提取发酵液中虾青素，测定虾青素含量，重复实验，如图2其虾青素含量达到300mg/l（每l发酵液
产虾青素的量）。
36.实施例4红法夫酵母dw6菌株利用不同碳源发酵生产虾青素。
37.（1）将实施例1选育出的红法夫酵母（xanthophyllomyces dendrorhous）dw6接种至ym固体培养基，20℃
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22℃培养2
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3天，进行菌种活化；（2）种子培养，包括：a. 一代种子培养：从ym固体培养基上取单菌落，接种于种子培养基20℃
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22℃，200 rpm下恒温培养48h；b. 二代种子培养：取一代种子培养的培养液按10%接种量接种于新的种子培养基，和a同样条件下恒温培养，得到用于发酵培养的种子液。
38.（3）种子培养得到的种子液接种至装有发酵培养基的500ml摇瓶发酵罐中，21℃
±
1℃，200rpm，培养五天，测定细胞干重，提取发酵液中虾青素，测定虾青素含量，重复实验，如图3以葡萄糖为底物作为对照，其虾青素含量均达到70 mg/l（每l发酵液产虾青素的量），细胞干重与以葡萄糖为底物相近。