氧杂蒽酮类化合物及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于生物医药技术领域，特别涉及氧杂蒽酮类化合物及其制备方法和应用。


背景技术：

2.氧杂蒽酮类化合物是一种异三环化合物。它是一种重要的有机合成中间体，其母体本身并不存在于植物体内，但其衍生物广泛存在于自然界中，这些衍生物统称为“氧杂蒽酮类化合物”，是药用植物的有效成分之一。这些化合物有不同的生物活性主要是因为其取代基上的基团不同。由于其结构多样且特殊，使得它们通常能够表现出调节机体免疫、抗肿瘤以及抗炎等多种生物活性，并且它们也是开发新型抗生素的重要物质。目前，氧杂蒽酮类化合物天然提取的主要来源是植物和微生物。近年来，由于从植物来源的天然产物中发现的氧杂蒽酮类化合物相对较少，因此微生物被认为是未来具有重要生物活性的氧杂蒽酮类化合物的主要来源。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于提供氧杂蒽酮类化合物，该系列氧杂蒽酮类化合物能够抗植物病原真菌并具备抗氧化活性，可用于制备农用抗菌剂以及抗氧化药物，具有较高的农用和医用商业价值。
4.本发明还提供了氧杂蒽酮类化合物的制备方法和应用。
5.本发明通过以下技术方案实现：
6.本发明提供氧杂蒽酮类化合物，所述氧杂蒽酮类化合物包括phomopsisxanthones a～g中的至少一种，phomopsisxanthones a～g的结构式分别如(i)～(vii)所示：
[0007][0008]
基于同一发明构思，本发明还提供一种氧杂蒽酮类化合物的制备方法，所述制备方法包括：
[0009]
将拟茎点霉菌进行发酵，发酵结束后收集发酵液和菌丝体；
[0010]
将所述发酵液进行萃取、将所述菌丝体进行浸提，合并提取液，后挥发溶剂，获得发酵粗提物；
[0011]
将所述发酵粗提物进行色谱分离，洗脱剂采用氯仿
‑
甲醇体系，收集粗组分fr.1～fr.3；
[0012]
将粗组分fr.1进行色谱分离，洗脱剂采用石油醚
‑
乙酸乙酯体系，获得化合物phomopsisxanthone a、phomopsisxanthone b和phomopsisxanthone c；
[0013]
将粗组分fr.2进行色谱分离，洗脱剂采用甲醇
‑
水体系，得到化合物phomopsisxanthone d和phomopsisxanthone e；
[0014]
将粗组分fr.3进行色谱分离，洗脱剂采用氯仿
‑
丙酮体系，得到化合物phomopsisxanthone f和phomopsisxanthone g。
[0015]
可选的，所述拟茎点霉菌为phomopsis sp.ye3350，菌株phomopsis sp.ye3350已于2020年8月3日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称为cctcc)，保藏编号为cctcc no.m2020394。保藏地址为中国，武汉，武汉大学，分类学命名为phomopsis sp.。
[0016]
可选的，所述将拟茎点霉菌进行发酵，发酵结束后收集发酵液和菌丝体，具体包括：
[0017]
将拟茎点霉菌置于pdb培养基中进行发酵，发酵结束后收集发酵液和菌丝体，其中，所述pdb培养基中马铃薯浓度为0.2～0.4g/ml，葡萄糖浓度为0.02～0.05g/ml；
[0018]
所述pdb培养基通过以下方法制备：
[0019]
取200～400份去皮马铃薯切块，加入1000份水煮沸后过滤，获得马铃薯滤液；
[0020]
向所述马铃薯滤液中加入葡萄糖20～50份，磷酸氢二钾3～5份,硫酸镁3～5份和维生素b
1 0.01～0.03份，获得所述pdb培养基。
[0021]
可选的，所述将所述发酵液进行萃取、将所述菌丝体进行浸提，合并提取液，后挥发溶剂，获得发酵粗提物，具体包括：
[0022]
采用乙酸乙酯萃取所述发酵液、采用甲醇浸提所述菌丝体，合并提取液，后挥发溶剂，获得发酵粗提物。
[0023]
可选的，所述将所述发酵粗提物进行色谱分离，洗脱剂采用氯仿
‑
甲醇体系，收集粗组分fr.1～fr.3，具体包括：
[0024]
将所述发酵粗提物进行色谱分离，洗脱剂采用氯仿
‑
甲醇体系，氯仿和甲醇体积比从95:5至1:1对所述发酵粗提物进行梯度洗脱，收集氯仿和甲醇体积比为95:5时洗脱得到的粗组分fr.1，收集氯仿和甲醇体积比为9:1时洗脱得到的粗组分fr.2,收集氯仿和甲醇体积比为8:2时洗脱得到的粗组分fr.3。
[0025]
可选的，所述将粗组分fr.1进行色谱分离，洗脱剂采用石油醚
‑
乙酸乙酯体系，获得化合物phomopsisxanthone a、phomopsisxanthone b和phomopsisxanthone c，具体包括：
[0026]
所述将粗组分fr.1进行色谱分离，洗脱剂采用石油醚
‑
乙酸乙酯体系，石油醚和乙酸乙酯从体积比95:5至6:4对所述粗组分fr.1进行梯度洗脱，收集石油醚和乙酸乙酯体积比为9:1时洗脱得到的馏分，挥发洗脱剂，获得氧杂蒽酮类化合物phomopsisxanthone a；收集石油醚和乙酸乙酯体积比为8:2时洗脱得到的馏分，挥发洗脱剂，获得氧杂蒽酮类化合物phomopsisxanthone b；收集石油醚和乙酸乙酯体积比为7:3时洗脱得到的馏分，挥发洗脱剂，获得氧杂蒽酮类化合物phomopsisxanthone c。
[0027]
可选的，所述将粗组分fr.2进行色谱分离，洗脱剂采用甲醇
‑
水体系，得到化合物
phomopsisxanthone d和phomopsisxanthone e，具体包括：
[0028]
将粗组分fr.2进行色谱分离，洗脱剂采用甲醇
‑
水体系，甲醇和水从体积比1:1至4:1对所述粗组分fr.2进行梯度洗脱，收集甲醇和水体积比为6:4时洗脱得到的馏分，挥发洗脱剂，获得氧杂蒽酮类化合物phomopsisxanthone d；收集甲醇和水体积比为7:3时洗脱得到的馏分，挥发洗脱剂，获得氧杂蒽酮类化合物phomopsisxanthone e。
[0029]
可选的，所述将粗组分fr.3进行色谱分离，洗脱剂采用氯仿
‑
丙酮体系，得到化合物phomopsisxanthone f和phomopsisxanthone g，具体包括：
[0030]
所述将粗组分fr.3进行色谱分离，洗脱剂采用氯仿
‑
丙酮体系，用氯仿和丙酮从体积比9:1至1:1对所述粗组分fr.3进行梯度洗脱，收集氯仿和丙酮体积比为8:2时洗脱得到的馏分，挥发洗脱剂，获得氧杂蒽酮类化合物phomopsisxanthone f；收集石油醚和乙酸乙酯体积比为7:3时洗脱得到的馏分，挥发洗脱剂，获得氧杂蒽酮类化合物phomopsisxanthone g。
[0031]
基于同一发明构思，本发明还提供氧杂蒽酮类化合物在制备农用抗菌剂和/或抗氧化药物中的应用。
[0032]
本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
[0033]
1.本发明氧杂蒽酮类化合物，提供了七种新的氧杂蒽酮类化合物phomopsisxanthones a～g，能够抗植物病原菌并具备抗氧化活性，为开发农用抗菌剂和抗氧化药物提供新的选择，具有较高的农用和医用商业价值。
[0034]
2.本发明氧杂蒽酮类化合物的制备方法，氧杂蒽酮类化合物通过菌株phomopsis sp.ye3350发酵制备得到，该方法具有周期短、培养条件温和、副产物少、成本低的优点，且具有较高的经济价值，成本低、操作简便，易于大规模生产，为获得天然来源的氧杂蒽酮类化合物提供了新途径。
附图说明
[0035]
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
[0036]
图1为本发明所述化合物phomopsisxanthone a的1h
‑
nmr谱；
[0037]
图2为本发明所述化合物phomopsisxanthone a的
13
c
‑
nmr和dept谱；
[0038]
图3为本发明所述化合物phomopsisxanthone b的1h
‑
nmr谱；
[0039]
图4为本发明所述化合物phomopsisxanthone b的
13
c
‑
nmr和dept谱；
[0040]
图5为本发明所述化合物phomopsisxanthone c的1h
‑
nmr谱；
[0041]
图6为本发明所述化合物phomopsisxanthone c的
13
c
‑
nmr和dept谱；
[0042]
图7为本发明所述化合物phomopsisxanthone d的1h
‑
nmr谱；
[0043]
图8为本发明所述化合物phomopsisxanthone d的
13
c
‑
nmr和dept谱；
[0044]
图9为本发明所述化合物phomopsisxanthone e的1h
‑
nmr谱；
[0045]
图10为本发明所述化合物phomopsisxanthone e的
13
c
‑
nmr和dept谱；
[0046]
图11为本发明所述化合物phomopsisxanthone f的1h
‑
nmr谱；
[0047]
图12为本发明所述化合物phomopsisxanthone f的
13
c
‑
nmr和dept谱；
[0048]
图13为本发明所述化合物phomopsisxanthone g的1h
‑
nmr谱；
[0049]
图14为本发明所述化合物phomopsisxanthone g的
13
c
‑
nmr和dept谱；
[0050]
图15为本发明氧杂蒽酮类化合物phomopsisxanthones a～g的结构式。
具体实施方式
[0051]
下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
[0052]
在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
[0053]
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
[0054]
下面将结合实施例及实验数据对本技术氧杂蒽酮类化合物进行详细说明。
[0055]
实施例1
[0056]
氧杂蒽酮类化合物phomopsisxanthones a～g的分离制备
[0057]
(1)配制pdb培养基：称量去皮马铃薯200g，切成小块，加入1000ml蒸馏水煮沸，纱布过滤，得马铃薯滤液，加入葡萄糖20g，ph自然，121℃灭菌30min，制得pdb培养基备用。其中pdb培养基中马铃薯的浓度为0.2g/ml，葡萄糖的浓度为0.02g/ml。
[0058]
配制改良pdb培养基：称量去皮马铃薯200g，切成小块，加入1000ml蒸馏水煮沸，纱布过滤，得马铃薯滤液，加入葡萄糖20g，磷酸氢二钾3g,硫酸镁3g,维生素b
1 10mg，ph自然121℃灭菌30min，制得改良pdb培养基备用。其中改良pdb培养基中马铃薯的浓度为0.2g/ml，葡萄糖的浓度为0.02g/ml。
[0059]
(2)将phomopsis sp.ye3350菌株接入pdb培养基中，在28
±
2℃、200r/min摇床培养4d，得种子液，再将制得的种子液按10％的接种量接入发酵培养基改良pdb培养基中，于28
±
2℃、200r/min摇床培养7～9d，得发酵产物。
[0060]
(3)将步骤(2)得到的发酵产物用纱布过滤，得发酵液和菌丝体，发酵液用乙酸乙酯萃取，菌丝体用甲醇浸提，合并提取液，减压浓缩得发酵粗提物。
[0061]
(4)将发酵粗提物用硅胶柱(200
‑
300目)进行色谱分离，以氯仿
‑
甲醇体系从体积比95:5至1:1对发酵粗提物进行梯度洗脱，收集氯仿
‑
甲醇体系体积比95:5洗脱得到的粗组分fr.1，收集氯仿
‑
甲醇体系体积比9:1洗脱得到的粗组分fr.2,收集氯仿
‑
甲醇体系体积比8:2洗脱得到的粗组分fr.3。
[0062]
以石油醚
‑
乙酸乙酯体系从体积比95:5至6:4对粗组分fr.1进行梯度洗脱，收集石油醚
‑
乙酸乙酯体积比为9:1时洗脱得到的馏分，可制备得到氧杂蒽酮类化合物phomopsisxanthone a；收集石油醚
‑
乙酸乙酯体积比为8:2时洗脱得到的馏分，可制备得到氧杂蒽酮类化合物phomopsisxanthone b；收集石油醚
‑
乙酸乙酯体积比为7:3时洗脱得到的馏分，可制备得到氧杂蒽酮类化合物phomopsisxanthone c。
[0063]
用甲醇
‑
水体系从体积比1:1至4:1对粗组分fr.2进行梯度洗脱，收集甲醇
‑
水体积
比为6:4时洗脱得到的馏分，可制备得到氧杂蒽酮类化合物phomopsisxanthone d；收集甲醇
‑
水体积比为7:3时洗脱得到的馏分，可制备得到氧杂蒽酮类化合物phomopsisxanthone e。
[0064]
用氯仿
‑
丙酮体系从体积比9:1至1:1对粗组分fr.3进行梯度洗脱，收集氯仿
‑
丙酮体积比为8:2时洗脱得到的馏分，可制备得到氧杂蒽酮类化合物phomopsisxanthone f；收集石油醚
‑
乙酸乙酯体积比为7:3时洗脱得到的馏分，可制备得到氧杂蒽酮类化合物phomopsisxanthone g。
[0065]
实施例2
[0066]
phomopsisxanthone a～g的结构鉴定，结果如图15所示。
[0067]
氧杂蒽酮类化合物phomopsisxanthone a的结构鉴定
[0068]
由实施例1制备得到的化合物phomopsisxanthone a，通过1d/2d nmr(一维核磁共振波谱和二维核磁共振波谱)以及hresi
‑
ms(高分辨电喷雾电离质谱)鉴定其结构。phomopsisxanthone a的分子式为c
15
h
12
o5；hresims m/z:271.0607[m
‑
h]
‑
，不饱和度为10。
[0069]
如图1、2，1h
‑
nmr图谱显示一个羟基质子(δ
h 13.00)，一个甲基质子(δ
h 2.37)，四个次甲基质子(δ
h 6.58,6.71,6.80,7.23)，一个连氧的亚甲基(δ
h 5.07)。根据其不饱和度为10，除一个羰基外，还应具有三个苯环。1h
‑1h cosy图谱显示了两组间位芳族氢质子，表明存在两个1,2,3,5
‑
四取代的芳环。从hmqc图谱中可以观察到在12
‑
oh(δ
h 5.39)和1
‑
oh(δ
h 12.94)的处的两个活泼氢质子，还显示出甲基质子ch3‑
11(δ
h 2.37)和连氧的羟基质子ch2‑
12(δ
h 5.07)与c
‑
11和c
‑
12的有相关点，表明了ch3‑
11和ch2‑
12分别与c
‑
11，c
‑
12相连。在它的hmbc图谱中观察到ch3‑
11对c
‑
1，c
‑
2，c
‑
4有相关，表明了与甲基在c
‑
3位。此外，还观察到连氧质子ch2‑
12与c
‑
7，c
‑
8和c
‑
8a有相关，表明了ch2oh与c
‑
8的连接方式。从hmbc图谱中可以看出δ
h 12.94位的羟基质子与c
‑
1,c
‑
2,c
‑
9a的相关点，可以确定1
‑
oh和c
‑
1的连接。从hmbc图谱和1h
‑1h cosy图谱以及间位取代的特性推测出6
‑
oh与c
‑
6的连接，进而推断出12
‑
oh与亚甲基c
‑
12的相关性。化合物1为氧杂蒽酮类化合物，在c
‑
3处和c
‑
8处分别被甲基和一个羟甲基取代，在c
‑
1和c
‑
6处被羟基取代，经检索为新化合物，命名为phomopsisxanthone a，其结构式如下式(i)所示：
[0070][0071]
氧杂蒽酮类化合物phomopsisxanthone b的结构鉴定
[0072]
由实施例1制备得到的化合物phomopsisxanthone b，通过1d/2d nmr(一维核磁共振波谱和二维核磁共振波谱)以及hresi
‑
ms(高分辨电喷雾电离质谱)鉴定其结构。phomopsisxanthone b的分子式为c
15
h
12
o5；hresims m/z 271.0506[m
‑
h]
‑
，不饱和度为10。
[0073]
如图3、4，与化合物phomopsisxanthone a相比，1h
‑
nmr图谱显示在δ
h 7.46和7.40处存在两个低场移位的芳族质子信号，计算它们的耦合常数，结果都为9.1hz，这表明在化合物的苯环上存在邻位取代现象。经过对比1h
‑1h cosy、hmbc和hmqc图谱比较发现，化合物
phomopsisxanthone a与化合物phomopsisxanthone b的a环和b环相同，也都存在间位取代。从hmbc图谱中可以观察到h
‑
2(δ
h 6.61)，h
‑
4(δ
h 6.83)与甲基碳c
‑
11(δ
c 22.4)有相关点，表明了c
‑
11与c
‑
3的连接。c
‑
8(δ
c 125.7),c
‑
6(δ
c 125.6),c
‑
12(δ
c 55.8)向低电场位移，c
‑
5(δ
c 111.8),c
‑
7(δ
c 152.7)向高电场位移，表明羟基质子在c
‑
7位，受到7
‑
oh的影响，它们的化学位移才发生改变。综合以上分析，确定化合物phomopsisxanthone a是氧杂蒽酮。在c
‑
3处和c
‑
8处分别被甲基和一个羟甲基取代，在c
‑
1和c
‑
7处被羟基取代，经检索为新化合物，命名为phomopsisxanthone b，其结构式如下式(ii)所示：
[0074][0075]
氧杂蒽酮类化合物phomopsisxanthone c的结构鉴定
[0076]
由实施例1制备得到的化合物phomopsisxanthone c，通过1d/2d nmr(一维核磁共振波谱和二维核磁共振波谱)以及hresi
‑
ms(高分辨电喷雾电离质谱)鉴定其结构。phomopsisxanthone c的分子式为c
15
h
12
o5；hresims m/z 271.0607[m
‑
h]
‑
，不饱和度为10。
[0077]
如图5、6，其氢谱和碳谱与化合物phomopsisxanthone a相比，多了一个甲氧基(δ
h 4.04；δ
c 62.8)，少了一个亚甲基。1h
‑
nmr图谱显示在δ
h 7.46和δ
h 7.40处存在两个低场位移的芳族质子信号，它们的耦合常数都为8.8hz，表明是邻位取代的苯环。从它的1h
‑1h cosy图谱中可以看到一组次甲基质子(δ
h 6.69；δ
h 6.60)，我们推断在苯环上存在间位取代。从hmbc图谱中可以观察到羟基质子6
‑
oh(δ
h 5.97)与c
‑
5(δ
c 118.8)，c
‑
6(δ
c 125.6)，c
‑
7(δ
c 152.7)有相关点，确定了羟基质子6
‑
oh与c
‑
6的连接。确定化合物phomopsisxanthone c的a环和b环的连接方式同化合物phomopsisxanthone a一样。综合以上分析确定化合物phomopsisxanthone c也属于氧杂蒽酮，在c
‑
3处和c
‑
5处分别被甲基和甲氧基取代，c
‑
1和c
‑
6处被羟基取代，经检索为新化合物，命名为phomopsisxanthone c,其结构式如下式(iii)所示：
[0078][0079]
氧杂蒽酮类化合物phomopsisxanthone d的结构鉴定
[0080]
由实施例1制备得到的化合物phomopsisxanthone d，通过1d/2d nmr(一维核磁共振波谱和二维核磁共振波谱)以及hresi
‑
ms(高分辨电喷雾电离质谱)鉴定其结构。
phomopsisxanthone d的分子式为c
15
h
12
o4；hresims m/z 257.0806[m
‑
h]
‑
，不饱和度为10。
[0081]
如图7、8，该化合物的图谱数据与化合物phomopsisxanthone a相比，少了一个羟基质子且分子量少了16。结合氢谱和碳谱的对比结果，判断化合物phomopsisxanthone a在δ
h 7.65处多了信号峰，为芳香次甲基。从hmbc图谱中可以观察到，质子h
‑
6(δ
h 7.65)与c
‑
10a(δ
c 157.9)和c
‑
8(δ
c 142.7)有远程相关。1h
‑1h cosy图谱可以观察到除了有一组间位取代环之外还有一个2,3,4
‑
取代环的存在。从核磁共振的一维二维图谱可以确定a环和b环的连接方式同化合物phomopsisxanthone a一样，而在c环的c
‑
6位上没有羟基的取代。综合以上分析确定化合物phomopsisxanthone d是c
‑
3和c
‑
8分别被甲基和羟甲基取代，在c
‑
1处被羟基取代的氧杂蒽酮类化合物。经检索为新化合物，命名为phomopsisxanthone d,其结构式如下式(iv)所示：
[0082][0083]
氧杂蒽酮类化合物phomopsisxanthone e的结构鉴定
[0084]
由实施例1制备得到的化合物phomopsisxanthone e，通过1d/2d nmr(一维核磁共振波谱和二维核磁共振波谱)以及hresi
‑
ms(高分辨电喷雾电离质谱)鉴定其结构。phomopsisxanthone e的分子式为c
15
h
12
o4；hresims m/z:311.0529[m
‑
h]
‑
，不饱和度为10。
[0085]
如图9、10，该化合物的图谱数据与化合物phomopsisxanthone a相比，多了一个连氧亚甲基，少了一个甲基。根据其1h
‑
nmr图谱的显示结果，可以看出在δ
h 7.50和δ
h 7.41处存在低电场位移的芳族质子信号，它们的耦合常数相同，为9.12hz，我们推断可能在苯环上发生了邻位取代。在δ
h 6.95和δ
h 6.72处有一对芳香质子信号，由1h
‑1h cosy图谱证实了是在苯环上存在了一组间位取代的芳香质子。从hmbc图谱中可以观察到次甲基ch2‑
11(δ
h 4.58)与c
‑
4(δ
c 103.9)，c
‑
2(δ
c 107.4)，和c
‑
3(δ
c 154.0)存在相关性，证实了ch2‑
11与c
‑
3的连接方式。此外，还观察到连氧质子ch2‑
12(δ
h 5.12)与c
‑
7(δ
c
152.7)，c
‑
8(δ
c 127.4)和c
‑
8a(δ
c 119.1)有相关，这也表明了ch2oh与c
‑
8的连接方式。从hmqc图谱可以观察到11
‑
oh和ch2‑
11以及12
‑
oh和ch2‑
12有相关性的点存在，确定了两个连氧亚甲基的连接方式。综上所述，确定化合物phomopsisxanthone e是氧杂蒽酮。在c
‑
3处和c
‑
8处分别被羟甲基取代，在c
‑
1处分别被羟基取代，经检索为新化合物，命名为phomopsisxanthone e,其结构式如下式(v)所示：
[0086][0087]
氧杂蒽酮类化合物phomopsisxanthone f的结构鉴定
[0088]
由实施例1制备得到的化合物phomopsisxanthone f，通过1d/2d nmr(一维核磁共振波谱和二维核磁共振波谱)以及hresi
‑
ms(高分辨电喷雾电离质谱)鉴定其结构。phomopsisxanthone f的分子式为c
15
h
12
o5；hresims m/z:271.0607[m
‑
h]
‑
，不饱和度为10。
[0089]
如图11、12，该化合物的与化合物phomopsisxanthone a相比，多了一个羟甲基(δ
h 4.69；δ
c 62.9)和次甲基(δ
h 7.70；δ
c 137.5)的信号，而少了一个甲基。分子式与化合物phomopsisxanthone a相同，说明亚甲基基团的连接位置发生了变化。从1h
‑1h cosy图谱可以观察到，除了有一组间位取代环之外还有一个2,3,4
‑
取代环的存在。在二维hmbc图谱中，显示亚甲基ch2‑
11(δ
h 4.68)与季碳c
‑
5(δ
c 113.2)，c
‑
6(δ
c 152.1)和c
‑
7(δ
c 119.6)之间有相关点，表明了次甲基ch2‑
11连接在c
‑
6的位置。ch2‑
12(δ
h 5.44)与c
‑
7,c
‑
8和c
‑
8a(δ
c 115.7)之间都有相关点的存在，确定了ch2‑
12连接在c
‑
12的位置上。根据两个取代环和以上数据确定了12
‑
oh，11
‑
oh分别与c
‑
12和c
‑
11连接。化合物phomopsisxanthone f在c
‑
6和c
‑
8位都有一个羟甲基取代，在c
‑
1处有一个羟基取代，经检索为新化合物，命名为phomopsisxanthone f,其结构式如下式(vi)所示：
[0090][0091]
氧杂蒽酮类化合物phomopsisxanthone g的结构鉴定
[0092]
由实施例1制备得到的化合物phomopsisxanthone g，通过1d/2d nmr(一维核磁共振波谱和二维核磁共振波谱)鉴定其结构。phomopsisxanthone g的分子式为c
15
h
10
o6；不饱和度为11。
[0093]
如图13、14，根据化合物phomopsisxanthone g与化合物phomopsisxanthone a的一维和二维核磁共振的数据对比，确定化合物phomopsisxanthone g是氧杂蒽酮。与化合物phomopsisxanthone a相比，化合物phomopsisxanthone g多了一个羧基(δ
c 168.7)，少了一个甲基和一个羟基，且相对分子质量多了14。从hmbc图谱中观察到，h
‑
5(δ
h 8.33)，h
‑
7(δ
h 9.27)的次甲基质子与羧基c
‑
11(δ
c 168.7)相关，表明了c
‑
11和c
‑
6的连接。综合以上分析，化合物phomopsisxanthone g在c
‑
1有一个羟基取代，在c
‑
6和c
‑
8处分别有一个羧基和羟甲
基取代，经检索为新化合物，命名为phomopsisxanthone g,其结构式如下式(vii)所示：
[0094][0095]
本实施例所述的七个氧杂蒽酮类化合物均为白色无定形粉末，溶解于甲醇、吡啶、二甲亚砜等，不溶于石油醚和水。化合物phomopsisxanthones a～g的1h nmr数据见表1，
13
cnmr数据见表2。
[0096]
表1氧杂蒽酮类化合物phomopsisxanthones a～g的1h nmr数据
[0097][0098][0099]
phomopsisxanthone a、b、f的测定溶剂为氘代二甲亚砜；phomopsisxanthone c、d的测定溶剂为氘代氯仿；phomopsisxanthone e、g的测定溶剂为氘代吡啶。
[0100]
表2氧杂蒽酮类化合物phomopsisxanthones a～g的
13
c nmr数据
[0101][0102][0103]
实施例3
[0104]
氧杂蒽酮类化合物phomopsisxanthones a～g的抗植物病原菌活性和抗氧化活性测定：
[0105]
(1)抗植物病原菌的活性测定：
[0106]
4株植物病原指示菌包括番茄灰霉菌(botrytis cinerea)、小麦赤霉菌(gibberella saubinetii)、马铃薯腐皮镰刀菌(fusarium solani)和新月弯孢霉(curvularia lunata)。培养基为pdb培养基。
[0107]
在无菌条件下，将生长良好的病原菌接入每瓶含有100ml液体培养基的250ml锥形瓶中。称取1024μg化合物后用dmso溶液溶解，在96孔板上用无菌水倍比稀释成516
‑
2μg/ml。每孔加入50μl菌悬液，吸打混合均匀。阳性对照为制霉菌素，每组病原菌做2组平行实验，于28℃培养24
‑
48h，每8h观察结果并记录一次。
[0108]
(2)dpph自由基清除能力：
[0109]
称1mg待测样品，加入2ml dmso溶解得到0.5mg/ml样品母液。然后再将所配制的母液稀释成5
‑
50μg/ml。称取7.886mg的dpph(1,1
‑
二苯基
‑2‑
三硝基苯肼)用100ml dmso溶液进行溶解，得到浓度为0.2mm的dpph母液。吸取1ml配置好的dpph母液加入不同浓度(3ml,5
‑
50μg/ml)的化合物溶液中，在暗条件下反应30分钟。取反应后的样品200μl于96孔板中，用
酶标仪测定其在517nm处的吸收值。以dmso为阴性对照，维生素c(v
c
)和维生素e(v
e
)为阳性对照。
[0110]
将所测得数据用公式[(ac
–
as)/ac]
×
100％分别计算出化合物的dpph自由基清除率k(％)。ac为阴性对照dmso在517nm处测定的吸收值，as为加入化合物或者阳性对照v
c
和v
e
在517nm处测定的吸收值。根据其自由清除率数据计算出该化合物的ic
50
(半数抑制浓度)值。
[0111]
(3)abts

自由基清除能力：
[0112]
称取1mg待测样品，加入2ml dmso溶解得到0.5mg/ml样品母液。然后再将所配制的母液稀释成5
‑
50μg/ml。称取109.736mg abts

(2,2
‑
联氮
‑
二(3
‑
乙基
‑
苯并噻唑
‑6‑
磺酸)二铵盐)和66.2284mg的过硫酸钾用100ml水进行溶解，在室温下避光反应12小时后得到abts

浓度为0.2mm的母液。吸取1ml配置好的abts

母液加入稀释好的不同浓度(3ml,5
‑
50g/ml)化合物溶液中，在暗条件下反应10分钟。取200μl反应后的样品于96孔板中，用酶标仪测定其在734nm处的吸收值。在本试验中dmso为阴性对照，v
c
和v
e
为阳性对照。将所测得数据用公式[(ac
–
as)/ac]
×
100％分别计算出化合物的dpph自由基清除率k(％)。ac为阴性对照dmso在517nm处测定的吸收值，as为加入化合物或者阳性对照v
c
和v
e
在734nm处测定的吸收值。根据其自由清除率数据计算出该化合物的ic
50
值。
[0113]
本发明的植物内生真菌phomopsis sp.ye3350产生的氧杂蒽酮类化合物phomopsisxanthones a～g对4种植物病原菌的最低抑菌浓度(mic)值如表3所示。
[0114]
表3化合物phomopsisxanthones a～g对4种植物病原菌的抑制活性
[0115][0116]
本发明的植物内生真菌phomopsis sp.ye3350产生的氧杂蒽酮类化合物phomopsisxanthones a～g对清除dpph自由基和abts

自由基的半数抑制浓度(ic
50
)如表4所示。
[0117]
表4化合物phomopsisxanthones a～g的自由基清除活性
[0118][0119]
实验结果表明，本发明所述的氧杂蒽酮类化合物phomopsisxanthones a～g对4种植物病原指示菌都显示不同程度的抗菌活性，其中对小麦赤霉菌均具有较强的抑制作用，尤其是化合物phomopsisxanthone b和phomopsisxanthone g对小麦赤霉菌的mic值仅为2μg/ml。在所测化合物中，phomopsisxanthone a对马铃薯腐皮镰刀菌的抑制作用最强，其mic值为4μg/ml，phomopsisxanthone e和phomopsisxanthone g对番茄灰霉菌的抑制活性最强，mic值均为4μg/ml。在抗氧化活性实验中，氧杂蒽酮类化合物phomopsisxanthones a～g显示不同程度的自由基清除能力，尤其是化合物phomopsisxanthone d、phomopsisxanthone e和phomopsisxanthone g的活性较强，表明它们的抗氧化能力较强。综上所述，本发明的氧杂蒽酮类化合物phomopsisxanthones a～g具有作为制备新的农用抗菌剂和抗氧化药物的潜在用途。
[0120]
本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
[0121]
(1)本发明氧杂蒽酮类化合物的制备方法，在制备发酵粗提物过程中，发酵液用乙酸乙酯萃取，菌丝体用甲醇浸提，其目的在于提取获得发酵液和菌丝体中的有效组分，带来的好处是将发酵产物中的有效物质与未利用完的培养基成分和水溶性杂质分开。
[0122]
(2)本发明氧杂蒽酮类化合物的制备方法，拟茎点霉菌的发酵培养基采用改良后的pdb培养基，相比现有常规pdb培养基而言，其带来的有益效果是能产生与常规pdb培养基不同的发酵产物，这是由于培养基成分的变化会影响微生物发酵产物的合成。
[0123]
(3)本发明氧杂蒽酮类化合物的制备方法，在收集粗组分fr.1
‑
fr.3，以及分离phomopsisxanthones a～g过程中，选择的各洗脱剂体系及洗脱剂的不同体积比，目的在于获得对应的目标馏分或目标产物，若采用其他的洗脱剂体系或其他的体积比，则获得目标产物phomopsisxanthones a～g的分离流程将会比现有技术繁琐，耗时更长或难以获得。
[0124]
最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的
要素。
[0125]
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
[0126]
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。