一种植物叶际表面微生物宏基因组检测方法与流程

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种植物叶际表面微生物宏基因组检测方法。


背景技术：

2.植物叶际存在着丰富多样的微生物群体，植物为叶际微生物提供了必要的生活场所和营养物质，叶际微生物影响着植物的生长发育和代谢活动，宿主植物和叶际微生物之间互相影响，双方处在一个动态平衡的过程当中。目前，植物叶片或者根系菌群的分离和鉴定主要采用琼脂平板扩散、滤纸贴片等方法。近些年，随着分子生物学技术的发展，利用序列分析、荧光定量pcr(rt
‑
pcr)等技术对微生物的种群进行分析鉴定越来越受到重视。随着基因测序技术的发展，高通量测序技术凭借其独特优势也被引入微生物多样性的研究技术中。但对于植物叶际表面微生物的检测目前存在以下问题：(1)传统的培养基培养方法操作繁琐，花费时间长并且污染严重，难以发现低丰度的微生物种类；(2)高通量测序时同一泳道的容量很小，不能被充分利用，降低数据的准确性，使后续测序数据不能准确分离。
3.中国专利201611081097.9中公开了陈化烟叶表面微生物的宏基因组测序与鉴定方法。基于微生物的种类和数量与烤烟品种、产地、时间、等级及发酵条件有关，利用高通量基因测序技术，对不同烤烟品种、产地、时间、等级的微生物菌群结构进行分析，绘制优质烟叶表面微生物菌群结构图。该发明利用宏基因组测序技术鉴定烟叶表面微生物的方法，对宣威地区3种代表性烟叶样品表面微生物进行otu聚类分析、物种注释，获得微生物多样性信息。结果显示，芽孢杆菌属菌株在陈化烟叶中为主要优势菌，在提高陈化烟叶品质中具有一定利用价值；烟叶样品中另一较多的菌种是假单胞菌属，这一大类的细菌有生物防治、微生态调节等功能。利用该方法获得的烟叶表面微生物多样性信息，有助于发挥微生物在烟叶陈化及提高品质方面的作用。但该专利在进行文库构建时采用的引物为细菌16s rdna引物，在检测时容易遗漏细菌外的微生物种类，导致检测结果不精准。
4.中国专利202110099309.0中公开了一种基于宏基因组学分析精准识别水体中未知微生物群落的方法，所述方法包括步骤(1)自水样提取宏基因组dna；(2)dna测序；(3)根据目标群落选择性构建参考数据库；(4)对测序数据进行组装获得组装数据；(5)对组装数据进行分箱；(6)对分箱数据进行质量测试，标记mags的质量，并计算测序深度；(7)根据构建的参考数据库对组装数据进行注释；(8)对mags做进化关系分析，进而做出宏基因组群落结构分析。该方法不依赖更新速度较慢的大型软件配套数据库，适合处理未知物种较多的样本，且可检测极低丰度物种，检测全面、快速。但该方法步骤较为繁琐，有很大的优化空间。


技术实现要素：

5.为了解决上述问题，本发明在现有的通用引物基础上进行改进，提供了一款准确高效的引物序列，节约成本和时间，从而实现植物叶际表面微生物大批量检测。
6.一方面，本发明提供了一组用于微生物宏基因组检测的引物组合物。
7.所述的引物选自seq id no.1
‑
10。
8.所述的引物为正向引物，选自seq id no.1
‑
5中的一种或多种；
9.所述的引物为反向引物，选自seq id no.6
‑
10中的一种或多种。
10.优选地，所述的引物组合物中包括正向引物seq id no.1
‑
5中的一种或多种和反向引物seq id no.6
‑
10中的一种或多种。
11.优选地，所述的引物组合物中包括正向引物seq id no.1
‑
5和反向引物seq id no.6
‑
10。
12.优选地，所述的seq id no.1和seq id no.6为一对；所述的seq id no.2和seq id no.7为一对；所述的seq id no.3和seq id no.8为一对；所述的seq id no.4和seq id no.9为一对；所述的seq id no.5和seq id no.10为一对。
13.另一方面，本发明提供了一种植物叶际表面微生物宏基因组检测方法。
14.所述的植物叶际表面微生物宏基因组检测方法中包括使用前述的引物进行扩增。
15.所述的植物叶际表面微生物宏基因组检测方法包括以下步骤：
16.(1)总dna提取；
17.(2)使用前述的引物组合物进行pcr文库富集；
18.(3)电泳检测pcr文库富集产物；
19.(4)pcr文库富集产物纯化；
20.(5)文库浓度检测合格后上机测序。
21.所述的步骤(1)中总dna提取中使用提取液完成，所述的提取液中包括：25mm edta、120mm tris
‑
hcl、2.0m nacl、2％ctab、1.5％sds、1％β
‑
巯基乙醇；所述的tris
‑
hcl的ph为7.8。
22.所述的步骤(2)中pcr扩增的条件为：
[0023] 温度时间预变性94℃3min变性94℃40s退火42℃45s延伸72℃50s(36个循环)延伸72℃6min
[0024]
所述的步骤(2)的扩增体系中包括但不限于：dna聚合酶、dntp、色素marker、比重增加物、稳定剂。
[0025]
所述的稳定剂包括但不限于：亚磷酸酯、多元醇、环氧化合物。
[0026]
再一方面，本发明提供了前述的引物在制备用于微生物宏基因组检测的试剂和/或试剂盒中的应用。
[0027]
又一方面，本发明提供了前述的植物叶际表面微生物宏基因组检测方法在制备用于微生物宏基因组检测的试剂和/或试剂盒中的应用。
[0028]
又一方面，本发明提供了一种微生物宏基因组检测试剂盒。
[0029]
所述的微生物宏基因组检测试剂盒中包括前述的引物。
[0030]
所述的微生物宏基因组检测试剂盒中还包括前述的植物叶际表面微生物宏基因
组检测方法中使用的试剂。
[0031]
又一方面，本发明提供了前述的试剂盒在检测土壤环境微生物宏基因组或水环境微生物宏基因组中的应用。
[0032]
本发明的有益效果：
[0033]
1、本发明的引物序列避免连续出现3或3个以上相同碱基，降低了样品扩增和测序过程中的错误率。
[0034]
2、本发明的引物加大同一次的测序量、测序快、污染少、可以鉴别未知的菌。
[0035]
3、本发明的dna提取方法所提取的基因组dna完整性较好，纯度较高。且进行pcr扩增时产物的杂带较少、亮度较高。
附图说明
[0036]
图1为对9种完整叶片基因组进行比较基因组分析的电泳结果。泳道1为marker，从左到右dna大小在600bp左右。
[0037]
图2为马瑟兰样品的测序结果图。
[0038]
图3为黑虎香样品的测序结果图。
[0039]
图4为使用对比例1的引物进行检测的gc含量图。
[0040]
图5为使用实施例1的引物进行检测的gc含量图。
[0041]
图6为使用对比例1的引物进行检测的atcg含量图。
[0042]
图7为使用实施例1的引物进行检测的atcg含量图。
[0043]
需要特别说明的是，图2
‑
7为仪器直出图，保留了灰度图片，相关数据已在实施例中公开，不影响结果的判定。
具体实施方式
[0044]
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0045]
实施例1一种植物叶际表面微生物宏基因组检测方法
[0046]
按以下步骤进行：
[0047]
1、总dna提取
[0048]
(1)将多品种葡萄叶样品解冻，样品信息见下表：
[0049][0050]
[0051]
称取葡萄叶片1.5g，充分切碎，放入50ml离心管中。
[0052]
(2)加入10ml提取液，充分混匀；提取液由以下成分组成：25mm edta、120mm tris
‑
hcl(ph7.8)、2.0m nacl、2％ctab、1.5％sds、1％β
‑
巯基乙醇。
[0053]
(3)70℃水浴20min，加入15ml氯仿：异戊醇＝24:1，充分混匀，室温下12000r/min离心8min，取上清液。
[0054]
(4)加入等体积体积的异丙醇，
‑
20℃冰浴40min，4℃，12000r/min离心8min，弃上清液。
[0055]
(5)用75％酒精清洗沉淀物2次，吹干。
[0056]
(6)沉淀物用ddh2o溶解，
‑
20℃冰箱下备用。
[0057]
2、pcr文库富集
[0058]
pcr的反应体系为25μl，包括12.5μl premix taq(购自北京睿博兴科生物技术有限公司，货号：rb
‑
pcrd01a，其中包括dna聚合酶、dntp、色素marker、比重增加物、稳定剂)、2μl dna模板、上下游引物(上游引物为seq id no.1
‑
5的混合物，下游引物为seq id no.6
‑
10的混合物)各1μl(100μm)，由无菌水补至25μl。期间避免产生气泡，瞬离后将反应管置于pcr仪中，扩增得到pcr文库富集产物(扩增产物)，扩增条件如下：
[0059] 温度时间预变性94℃3min变性94℃40s退火42℃45s延伸72℃50s(36个循环)延伸72℃6min
[0060]
3、电泳检测pcr文库富集产物
[0061]
对pcr富集产物进行电泳检测，根据电泳结果对文库片段分布以及文库浓度进行初步评估。吸取10μl pcr产物、3μl 6
×
dna loading buffer，于80v电压条件下在1％琼脂糖凝胶电泳45min，在凝胶成像仪中观察电泳结果。评估合格后进行下一步操作。
[0062]
4、纯化pcr扩增产物
[0063]
将pcr文库扩增产物用无核酶水补足至50μl，加入40μl(0.9
×
)磁珠纯化，80％乙醇溶液漂洗磁珠两次，最后用21μl无核酶水洗脱，小心吸取20μl上清液至新的1.5ml离心管中。
[0064]
5、文库浓度检测
[0065]
使用qubit 3.0精准定量文库浓度，大于3ng/μl即符合测序要求。文库使用全自动核酸分析系统qsep100分别进行片段分布测定。
[0066]
6、将质量和浓度合格的文库样本使用illumina，miseq平台进行测序。
[0067]
结果分析：
[0068]
电泳检测pcr文库富集产物，结果显示采用本发明提供的引物组合获得的扩增产物条带清晰，长度区别明显，无弥散现象(图1)。表明本技术的引物序列比现有的通用引物有更高特异性，pcr扩增产物弥散小，无论样品复杂程度高低都能有较高的特异性。
[0069]
结果表明样品基本测序量平均3万条reads以上，长度大部分都在250bp，碱基的质量在35以上，样品测序质量合格。马瑟兰样品(图2)和黑虎香样品(图3)的测序数据中碱基
质量都很高，从而使保障样品测序数据的准确性。
[0070]
对比例
[0071]
参照实施例1的方法设置对比例，对比例中步骤2中的上下游引物为通用引物：f1为seq id no.11；r1为seq id no.12。
[0072]
对比例检测出的gc含量异常，如图4所示。
[0073]
实施例1检测gc含量如图5所示。
[0074]
对比例检测出的atcg杂乱，如图6所示。
[0075]
实施例1检测出的atcg明显有所改善，如图7所示。