一种与胰胆管合流异常发生相关的标志物及其应用的制作方法

1.本发明属于基因工程技术领域，涉及一种与胰胆管合流异常发生相关的标志物及其应用，尤其涉及lncrna(xr_946886)作为胰胆管合流异常标记物。


背景技术：

2.胆总管、主胰管与十二指肠乳头部的结合处是人体内精微的结构，胰胆管的连接方式在不同的个体中也存在较大的差异，约85％的人胆总管与主胰管在十二指肠壁内段以锐角汇合形成“共同通道”，维持正常的胆道与胰液的分泌压力，防止胰液和十二指肠内容物反流入胆管，如果胆管和胰管在十二指肠壁外汇合、成直角汇合，使“共同通道”过长，可导致胰液和胆汁过早混合，这种情况造成的先天性发育畸形，现已被认为是一组独立的外科疾病，并能导致多种相关外科疾病的发生，这组独立的外科疾病被称为胰胆管合流异常(pan―creaticobiliarymaljunction，pbm)。
3.pbm在临床上与多种外科疾病关系密切，包括：(1)畸形：如先天性狭窄、闭锁、憩室等；(2)炎症：由于pbm的存在，导致胰管内压力高于胆管内压，胰液逆流入胆管，形成胆道的炎症，或由于胆管内压增高，大于胰管内压时，胆汁逆流入胰管，形成胰腺炎等；(3)肿瘤：包括恶性肿瘤与十分罕见的良性肿瘤，其中以胆系肿瘤的发病率最高；(4)其他：已证明pbm与胆管结石、非结石性胆囊炎及胆源性胰腺炎等胆胰疾病关系密切。
4.目前，pbm的主要诊断方法包括x线诊断、b超诊断、ct诊断、mrcp诊断、ercp诊断、超声胃镜诊断等影像学诊断方法，但由于胆总管、主胰管与十二指肠乳头部的结合处的结构复杂性，单纯影像学诊断存在着局限性，诊断难度高、成本高，且准确度有限。
5.分子诊断技术是指以dna或rna为诊断材料，用分子生物学技术通过检测基因的存在、缺陷或表达异常，从而对人体状态和疾病作出诊断的技术，具有特异性高、检测周期短、成本低、准确度高等特点，对疾病的预防、预测、诊断、治疗和预后具有重要意义。
6.长链非编码rna(long noncoding rnas，lncrna)是一组长度超过200nt的非编码rna，可参与调节细胞增殖、运动、免疫和炎症反应等生物学过程，在许多疾病的发生和进展中发挥重要作用，如感染性肿瘤和恶性肿瘤等，此外，一些lncrnas已经被鉴定为疾病诊断和预后的生物标志物.
7.然而，现有技术中尚未有记载lncrna与pbm的发生相关。


技术实现要素：

8.针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种与胰胆管合流异常发生相关的标志物及其应用，本发明首次发现长链非编码rnaxr_946886与胰胆管合流异常的发生相关，其在胰胆管合流异常中表达上调，因此，可通过分析xr_946886的表达辅助诊断或监测胰胆管合流异常症。
9.为达上述目的，本发明采用以下技术方案：
10.第一方面，本发明提供一种与胰胆管合流异常发生相关的标志物，所述与胰胆管
合流异常发生相关的标志物包括长链非编码rnaxr_946886。
11.本发明使用的术语“标志物”指用作分析样本的靶标分子。
12.根据本发明，本发明首次发现xr_946886与胰胆管合流异常的发生相关，其在胰胆管合流异常组织中表达上调，因此，分析xr_946886的表达水平，可辅助诊断和/或监测胰胆管合流异常症。
13.根据本发明，xr_946886包括seq id no:1所示的核酸序列。
14.seq id no:1：
15.ggcagggtggcagtgggctgggccatgccctaccttggcaagtctcgccatcaccctgcagctggtggctgggggggggccagcggcagtagaagccccccacggtgtcccggcaccgacccgcacagcccccgttggcgttggcacactcacccacatctgcgaggggagaagcaggtgaggtgccagccacgcggccacctcctccctccagcctcggcccacccgaggcctcagagggatgaggctcagggctccccacagcacaggggacattgtccaccagaacaggccccgcaggagggaggctgggtgtggaaacccagcagcaggggagccgcactgcagaacgggtccctccctcgctcccagggaaggtggcctctccccgggccttcagtgtggtgtggctctcaggagcaacatttgggtatagcttggcagaggaggtggccctgctcccgtaaagcagccacaccctttttgtgagtccccagagatcggctgccgtgtgtgttccggtcaagcggtctgccacagctgtgggttttcaggaaaaacccggcttcccttggctctgaggccaggaggagtttcactgtcacctgcacagccactccccctcccgccttcggacagccccaggccccatcctcccttcctggcgcgtctctggggatcacgtggcatctgagttgggcctggagagcaggttaggagccctgaacaccacatcaagttgctgagcccagcctgccaggacccagagcccatgccctagcccgccctccgtctttgcgggtgcgggaatgtggcagttctcccggggtgcgcctctgcctggttcaggcagcaggacttcccccgggacttggtcctgggcagaggcagcgtcactgcctccccacacaagtgactgggctggtaggagcatcgagggaagaagggaatcaagtgacctgccttgagaaggtgtgggacccaacttgaggtgacgcagggaccaggcgcctctgcccacccacccctgctgaactgcaccatccaaacttccaggaatgttcagccccctgtgcccccgcctctagaggccaaagaccaggccctccccagctgcatggggatcggaacctggaggcaggctcagagccagtggagcccccagcatgctgaggacgcagatggccagacgccagcccagcccacagggtgctgttcccagaagatgaggccgacctttcccaccagcaccccagacagacggaacacagcgcgggcctttccggacctgagctggcccaaagctccccagtgccgggggcatttctctctgcacctcctcaggacgggccctggaagagccccgggcggggccaaaggcctcggggcggccacagtcccatgagaacgggccaagcggaatgcaggccagccgtctccggactgttggaatgcagctgtcagcacagccctgcggaggtccatggtgggaattttttgggaattcctagagagttacacagggcgagacggaggctggccaaggccaggggtcagagccaaggtgcccagggtcccctgtctgcctggccccgacagactgccctggcaggcaagcagcagcccctcctctggtgtggggcaggcacccaagctctgggacctgtcctgacactggggccttgaggccaggtggctgggagggcggtgtccaggcaggtggggctggacgccagatgagcttccacacagctgctggcacagctgggtccccagcttcccaggcctggaacacagctggccatgtgagcacaggtccccagcaccggggcagcctcacagccacccaccccgaccctgctaggctccacggggaaaggagcccactgcagctgggggccttcagggacccccccacacccacaggaaaagccccttagcctggcctggcacaggggctgcagggtctggcactcaggacagccaccgctgcctggtcaccctcactgaggctgcaatcgccccttgttcccccaaagcccccaaccccagcatctccatgctggctgggaccccgccttgggtacctgcgggcgccgcctccaccccaggccgggctgagctctaacatccccgtggctccgcgctgggtgatctgtccccagccagaccatgcaagctctggtggggactggcccccctagtctcggggcccccgtgctcagcccagaacaagcccacaagggccgcaggagacccttggtgaatgctcaagaagctgcaggtggaccggccaccaggagaaaagccagagcccgacaaggcagctggggctcccccaacccctcaggcttgggctggaactctgggcaccacgcagactgatgccccatggccacaggcagaccagggcccaggacggag
aagttcagctccagaagcaggcaacactgcagcccagggaaccacccggaggctgaccagccttcccgtacaagccatcagaaaggggaggccacccgggtgcccaccagcgggtgatgaagacagacatggaggacgacagcgaggaggaacctcaaacctcgtgctgtgtgaaaggagcccatctcgagaggtcacacagtgtaggatagggcgtaccagctggcgggtctggggtctcctgggagggtgaggaaaatgtctcggaatgagataaaggtgatggctgcatagcacgatgaatgcacaaagggtcgctatgtttcaaaggggttattttatgcaatgtgaatttcaccttcatttaagaaaaaagagaaaaacgtcatcccaagactggattctgcacctcacttctccagcagttttgatacagaaagaagcggtcgtgcccaggcctccggggtgctccgtgccggatctggccccatgccaggggcctaactcagcagcagtgactgcaatgtcacaagtgcccagcagccacccaaccggggcagggctccgaagacccagcccttgcagccgatccagcaag。
16.第二方面，本发明提供如第一方面所述的与胰胆管合流异常发生相关的标志物的引物，所述引物包括seq id no.2和seq id no.3所示的核酸序列。
17.seq id no.2：5
’‑
ctgaccagccttcccgtaca
‑3’
。
18.seq id no.3：5
’‑
agcacgaggtttgaggttcct
‑3’
。
19.第三方面，本发明提供如第一方面所述的与胰胆管合流异常发生相关的标志物或第二方面所述的与胰胆管合流异常发生相关的标志物的引物在制备胰胆管合流异常诊断和/或监测产品中的应用。
20.第四方面，本发明提供一种胰胆管合流异常的诊断和/或监测试剂盒，所述试剂盒包括第二方面所述与胰胆管合流异常发生相关的标志物的引物。
21.优选地，所述试剂盒还包括管家基因的引物。
22.优选地，所述管家基因包括β
‑
actin。
23.优选地，所述β
‑
actin的引物包括seq id no:4和seq id no:5所示的核酸序列。
24.seq id no.4：5
’‑
gtggccgaggactttgattg
‑3’
。
25.seq id no.5：5
’‑
cctgtaacaacgcatctcatatt
‑3’
。
26.优选地，所述试剂盒还包括rna提取试剂、逆转录试剂或pcr mix中的任意一种或至少两种的组合。
27.根据本发明，市售常规rna提取试剂、逆转录试剂和pcr mix均能应用于本发明。
28.优选地，所述rna提取试剂包括trizol、氯仿、异丙醇和乙醇。
29.优选地，所述逆转录试剂包括逆转录反应液、逆转录酶、rna酶抑制剂和dntps。
30.优选地，所述pcr mix包括2
×
pcr mastermix。
31.第五方面，本发明提供一种如第四方面所述的胰胆管合流异常的诊断和/或监测试剂盒以非疾病诊断和/或治疗为目的的使用方法，所述使用方法包括：
32.以样本中rna为模板进行逆转录反应，以所述逆转录反应的产物为模板，利用第二方面所述胰胆管合流异常的标志物的引物进行实时荧光定量pcr，判读结果。
33.本发明中，仅仅检测xr_946886的表达水平并不能直接诊断是否具有胰胆管合流异常症，还需要和其他手段辅助诊断，才能最终确定是否带具有胰胆管合流异常症。
34.优选地，所述使用方法还包括制备梯度稀释dna模板的步骤。
35.优选地，所述梯度稀释dna模板的制备方法包括：
36.以所述逆转录反应的产物为模板，利用第二方面所述与胰胆管合流异常发生相关的标志物的引物进行pcr反应，将所述pcr反应产物进行梯度稀释，得到所述梯度稀释dna模板。
37.优选地，所述梯度稀释分别稀释1
×
10
‑1倍、1
×
10
‑2倍、1
×
10
‑3倍、1
×
10
‑4倍、1
×
10
‑5倍、1
×
10
‑6倍、1
×
10
‑7倍、1
×
10
‑8倍和1
×
10
‑9倍。
38.优选地，实时荧光定量pcr的反应程序包括：
39.预变性：94～96℃，8～11min；
40.循环延伸：94～96℃变性9～11秒、58～62℃延伸55～65秒并收集荧光，35～45个循环。
41.优选为，预变性：95℃，10min；循环延伸：95℃变性10秒、60℃延伸60秒并收集荧光，40个循环。
42.本发明中，建立pcr产物的熔解曲线以检测扩增的特异性，扩增反应结束后，按程序(95℃，10秒；60℃，60秒；95℃，15秒)进行，并从60℃缓慢加热到95℃(仪器自动进行
‑
ramp rate为0.075℃/秒)。
43.本发明中，控制实时荧光定量pcr的反应程序可高特异性扩增目的基因。
44.作为优选的技术方案，所述胰胆管合流异常诊断和/或监测试剂盒以非疾病诊断和/或治疗为目的的使用方法包括以下步骤：
45.(1)提取样本中rna，并以所述rna为模板进行逆转录反应，得到cdna；
46.(2)以所述cdna为模板，制备梯度稀释dna模板；
47.(3)分别以所述cdna和梯度稀释dna模板为模板，利用第二方面所述与胰胆管合流异常发生相关的标志物的引物进行实时荧光定量pcr，所述实时荧光定量pcr反应程序包括：预变性：94～96℃，8～11min；循环延伸：94～96℃变性9～11秒、58～62℃延伸55～65秒并收集荧光，35～45个循环，判读结果。
48.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
49.本发明利用分子诊断技术、首次采用高特异性的xr_946886作为胰胆管合流异常的标志物，所采用的检测产品，不仅能够使得胰胆管合流异常的诊断符合特异性强、灵敏度高的要求，还具有操作简单快速、无介入、通量高、成本低等众多综合优势。
附图说明
50.图1为差异表达lncrna热图；
51.图2为xr_946886在胰胆管合流异常组织和正常组织中的表达水平图；
52.图3为roc曲线图。
具体实施方式
53.为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
54.实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
55.实施例1
56.本实施例筛选胰胆管合流异常症相关基因标志物，包括以下步骤：
57.(1)样本收集：遵循知情同意原则，并在伦理委员会同意的前提下，收集胰胆管合流异常患者的胆总管组织及正常胆总管组织，保存于
‑
80℃；
58.(2)rna样品制备：使用trizol试剂(invitrogen，carls
‑
bad，ca，usa)按说明书提取步骤(1)收集的组织中总rna，利用超微量分光光度计(nanodrop nd
‑
2000，thermo scientific)进行总rna定量；
59.(3)逆转录和标记：利用随机引物法(arraystar super rnalabeling kit；arraystar)对步骤(2)的rna进行反转录，得到cdna，再利用cdna合成crna，并在crna上添加cyanine
‑3‑
ctp标记；
60.(4)杂交：将标记的crna杂交到微列阵芯片(agilent human lncrna microarray，2018 version 4x180k，designid:085630)，所有操作按说明书进行，冲洗载玻片后，用agilent扫描仪g2505c扫描芯片；
61.(5)数据处理：用agilent特征提取软件(10.7.1.1版)分析获得的阵列图像，使用genspring(version 13.1，agilenttechnologies)对原始数据进行分析，样本间差异表达的lncrna通过差异倍数过滤，筛选的标准为上调或者下调倍数变化值>＝2.0且p值<＝0.05，结果如图1所示，在胰胆管合流异常组织中共发现173个lncrna表达上调，316个lncrna表达下调，上调或者下调倍数前20的lncrna如表1所示。
62.表1
63.technologies)；
70.2)取70mg组织样品，加入1ml的trizol试剂，用电动匀浆器进行匀浆；
71.3)将匀浆后样品于20℃孵育5min，每1ml的trizol试剂匀浆的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖，手动剧烈振荡管体15秒后，20℃孵育3min，4℃下12,000
×
g离心15min，rna全部被分配于水相中；
72.4)将水相转移到新离心管中，加入异丙醇混合，加入异丙醇的量为每个样品匀浆时加入1ml trizol试剂此时加0.5ml的异丙醇，混匀后20℃孵育10min，于4℃、12,000
×
g离心10min，移去上清液；
73.5)每1ml trizol试剂匀浆的样品中加入1ml的75％乙醇，清洗rna沉淀，振荡后，于4℃、7,500
×
g离心5min，得到rna；
74.(3)干燥所述rna 10min，加入无rna酶的水用枪反复吹打，然后55℃孵育10min，获得的rna溶液保存于
‑
70℃。
75.实施例3
76.本实施例利用实施例2制备的rna进行cdna合成。
77.试剂：rna酶抑制剂(epicentre)、superscript
tm iii reverse transcriptase(invitrogen)、5
×
rt缓冲液(invitrogen)、2.5mm dntp混合液(datp，dgtp，dctp和dttp各2.5mm)(hytest ltd)和primer(英骏生物技术有限公司)。
78.仪器：洁净工作台(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)、dk
‑
8d型电热恒温水槽(上海森信实验仪器有限公司)和geneamp pcr system 9700(applied biosystems)。
79.操作过程包括以下步骤：
80.(1)配制退火混合液：
[0081][0082]
(2)将混合液置于65℃水浴5min，冰上放置2min，离心后，在离心管中依次加入rt反应液：
[0083][0084]
(3)混合后37℃恒温1min，移液枪轻轻吸打混合均匀，50℃温育60min，70℃温育15min使酶失活，得到cdna，置于
‑
20℃保存。
[0085]
实施例4
[0086]
本实施例通过qpcr验证实施例1分析的6个上调表达lncrna(xr_946886、nr_110876、nr_132344、xr_002956345、nr_135295和xr_002957935)在胰胆管合流异常组织和正常组织的表达差异。
[0087]
试剂：2x pcrmastermix(superarray)。
[0088]
仪器：洁净工作台(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)和quantstudio5real
‑
time pcr system(appliedbiosystems)。
[0089]
引物设计软件：primer 5.0。
[0090]
操作过程包括以下步骤：
[0091]
(1)制备用于绘制标准曲线的梯度稀释dna模板
[0092]
1)利用lncrna的引物和β
‑
actin的引物(如表2所示)，分别以实施例3制备的cdna为模板进行pcr反应，反应体系为：
[0093][0094]
表2
[0095]
[0096][0097]
2)轻弹管底将溶液混合，5000rpm离心，pcr反应程序为：95℃预变性10min；95℃预变性10秒，60℃延伸60秒，进行40个循环；
[0098]
3)将pcr产物与100bp dnaladder在2％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测pcr产物为单一特异性扩增条带；
[0099]
4)将pcr产物进行10倍梯度稀释：设定pcr产物浓度为1，分别稀释为1
×
10
‑1、1
×
10
‑2、1
×
10
‑3、1
×
10
‑4、1
×
10
‑5、1
×
10
‑6、1
×
10
‑7、1
×
10
‑8和1
×
10
‑9梯度浓度的dna，得到梯度稀释dna；
[0100]
(2)利用lncrna的引物和β
‑
actin的引物(如表2所示)，分别以实施例3制备的cdna为模板和所述梯度稀释dna进行qpcr，体系配制如下：
[0101][0102]
轻弹管底将溶液混合，5000rpm离心，将8μl混合液加到384
‑
pcr板对应的每个孔中，再加入对应的2μl cdna，离心混合，将上述384
‑
pcr板置于realtime pcr仪上进行反应，反应程序为：95℃预变性10min；95℃预变性10秒，60℃延伸60秒(收集荧光)，进行40个循环；
[0103]
为了建立pcr产物的熔解曲线，扩增反应结束后，按(95℃，10秒；60℃，60秒；95℃，15秒)进行反应，并从60℃缓慢加热到95℃(仪器自动进行
‑
ramp rate为0.075℃/秒)；
[0104]
(3)结果与计算，分别对各胰胆管合流异常组织和正常组织样品的lncrna和β
‑
actin进行qpcr反应，并利用梯度稀释dna进行qpcr反应绘制标准曲线，各样品目的基因和管家基因的浓度结果直接由机器生成，每个样品的目的基因浓度除以其管家基因的浓度，即为此样品此基因的校正后的相对含量，基因表达水平以β
‑
actin进行标准化，使用2
‑
δδct
方法计算基因的相对表达量，使用student ttest对胰胆管合流异常组织与正常组织之间基因表达量进行比较，统计分析使用graphpad prism软件(graphpad software inc.)，双
侧p值小于0.05认为具有统计显著性。
[0105]
结果表明于与正常组织相比，胰胆管合流异常组织中nr_110876、nr_132344、xr_946886和xr_002956345表达上调，如图2所示的xr_946886的q
‑
pcr结果，且nr_110876、nr_132344和xr_002956345表达差异显著，与实施例1微阵列分析结果一致，而nr_135295andxr_002957935表达趋势与结果实施例1微阵列分析结果不一致。
[0106]
为了进一步确定胰胆管合流异常标志物，分析nr_110876、nr_132344、xr_946886和xr_002956345的roc曲线，分析auc结果，如图3所示，结果表明xr_946886具有显著差异(0.837，p<0.001)，表明xr_946886能够作为胰胆管合流异常症的标志物。
[0107]
综上所述，本发明利用分子诊断技术、首次采用高特异性的xr_946886作为胰胆管合流异常的标志物，所采用的检测产品，不仅能够使得胰胆管合流异常的诊断符合特异性强、灵敏度高的要求，还具有操作简单快速、无介入、通量高、成本低等众多综合优势。
[0108]
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。