模板
‑
引物核酸分子、聚合酶活性测定方法及试剂盒
技术领域
1.本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种聚合酶活性测定方法及试剂盒。
背景技术：
2.聚合酶又称多聚酶，是专门生物催化合成脱氧核糖核酸和核糖核酸的一类酶的统称。目前，市场上常见的聚合酶活性测定方法主要是放射性同位素标记结合凝胶电泳，但是同位素存在辐射，对人体有害，实验过程中所有的试剂、耗材等均需专门处理，否则会污染环境。
3.因此，如何建立一种不依赖同位素标记的聚合酶活性测定方法具有重要的意义。
技术实现要素：
4.基于此，本发明的目的之一在于提供一种模板
‑
引物核酸分子，所述模板
‑
引物核酸分子包括模板链和引物链；所述模板链包括与引物链配对的模板配对区和单链区，所述单链区为多个重复单元组成的单链核苷酸序列，所述重复单元是长度为1～10bp的单链核苷酸序列，所述引物链的碱基序列为gcagagag，具体如seq id no:1所示。
5.作为本发明的一种优选地实施方式，所述单链区的长度为30～70bp。
6.作为本发明的一种优选地实施方式，所述重复单元为ac或cgt或gag或aagc或ccat或aagga或cgaac或tctcgc或cctctt或ctacgcaa或tagaaaaa或gccactgtat或atccttatct。
7.本发明的目的之二在于提供一种聚合酶活性测定方法，包括以下步骤：
8.(1)制备反应体系进行聚合酶的延伸反应，所述反应体系包括模板
‑
引物核酸分子、待测聚合酶、底物和缓冲液；
9.(2)终止反应并加入双链dna染料；
10.(3)检测反应体系中反应产物结合双链dna染料产生的第一荧光强度；
11.(4)根据第二荧光强度与参照品的量的标准曲线，将第一荧光强度换算呈对应的参照品的量，以所述参照品的量表征所述待测聚合酶活性；
12.其中，所述参照品为由两条单链核苷酸序列完全互补配对形成的双链核酸分子，第二荧光强度为所述参照品结合双链dna染料产生的荧光强度。
13.作为本发明的一种优选地实施方式，所述聚合酶延伸反应开始前还包括热启动步骤。
14.作为本发明的一种优选地实施方式，所述双链dna染料为sybr green i或picogreen。
15.本发明的目的之三在于提供一种检测聚合酶活性的试剂盒，所述试剂盒包括上述的模板
‑
引物核酸分子。
16.本发明所提供的模板
‑
引物核酸分子，能够用于聚合酶活性的测定，且其能够避免单链区形成二级结构从而导致活性测定不准确的问题，本发明所提供的聚合酶活性检测方法，无需涉及到同位素标记等，安全无毒，成本低。
具体实施方式
17.下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。
18.以下各实施例，仅用于说明本发明，但不止用来限制本发明的范围。基于本发明中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。
19.在本发明实施例中，若无特殊说明，所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品；在本发明实施例中，若未具体指明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
20.实施例1
21.本实施例提供一种模板
‑
引物核酸分子，模板
‑
引物核酸分子包括模板链和引物链；模板链包括与引物链配对的模板配对区和单链区，单链区为多个重复单元组成的单链核苷酸序列，重复单元的长度为1～10bp的单链核苷酸序列，引物链条的碱基序列为gcagagag，具体如seq id no:1所示。
22.其中重复单元可以为ac或cgt或gag或aagc或ccat或aagga或cgaac或tctcgc或cctctt或ctacgcaa或tagaaaaa或gccactgtat或atccttatct。
23.更具体地为：
24.2bp重复序列为：
25.acacacacacacacacacacacacacacctctctgc，如seq id no:2所示；
26.3bp重复序列为：
27.cgtcgtcgtcgtcgtcgtcgtcgtcgtcgtcgtcgtctctctgc，如seq id no:3所示；或gaggaggaggaggaggaggaggaggaggaggagctctctgc，如seq id no:4所示。
28.4bp重复序列为：
29.aagcaagcaagcaagcaagcaagcaagcaagcaagcaagcaagcctctctgc,如seq id no:5所示；或ccatccatccatccatccatccatccatccatccatccatccatccatctctctgc，如seq id no:6所示。
30.5bp重复序列为：
31.aaggaaaggaaaggaaaggaaaggaaaggaaaggaaaggactctctgc，如seq id no:7所示；或cgaaccgaaccgaaccgaaccgaaccgaaccgaaccgaacctctctgc，如seq id no:8所示。
32.6bp重复序列为：
33.tctcgctctcgctctcgctctcgctctcgctctcgcctctctgc，如seq id no:9所示；或cctcttcctcttcctcttcctcttcctcttcctcttctctctgc，如seq id no:10所示。
34.8bp重复序列为：
35.ctacgcaactacgcaactacgcaactacgcaactacgcaactacgcaactctctgc，如seq id no:11所示；或tagaaaaatagaaaaatagaaaaatagaaaaatagaaaaatagaaaaactctctgc，如seq id no:12所示。
36.10bp重复序列为
37.gccactgtatgccactgtatgccactgtatgccactgtatgccactgtatgccactgtatctctctgc，如seq id no:13所示；或atccttatctatccttatctatccttatctatccttatctatccttatctatcct
tatctctctctgc，如seq id no:14所示。
38.上述模板
‑
引物核酸分子由武汉金开瑞引物生物工程有限公司合成。
39.实施例2
40.本实施例提供一种聚合酶活性测定方法，包括以下步骤：
41.(1)制备反应体系进行聚合酶的延伸反应，所述反应体系包括模板
‑
引物核酸分子、待测聚合酶、底物和缓冲液；反应体系见下表1所示：
42.表1聚合酶延伸反应体系
43.试剂用量双链核酸分子(10μm)3μltaq dna聚合酶5μltaq缓冲液10μl底物(2mm)10μl水22μl
44.其中，所述双链核酸分子是由模板
‑
引物核酸分子中引物链条的碱基序列为gcagagag，如seq id no:1所示，模板链的碱基序列为acacacacacacacacacacacacacacctctctgc，如seq id no:2所示的模板
‑
引物核酸分子得到的。
45.其中taq dna聚合酶浓度为0.06mg/ml，用1％bsa缓冲液稀释100倍后再按梯度稀释为系列浓度。
46.将上述个反应体系混合均匀后，55℃保温10min，加入50μlsybr green i染料并震荡均匀，分别检测上述各反应体系的荧光强度(即第二荧光强度)，并得到r2≥0.99的拟合曲线。
47.重新按照表1的成分配置待测聚合酶的延伸反应体系，将反应体系混合均匀后，55℃保温10min，加入50μlsybr green i染料并震荡均匀，分别检测反应体系的荧光强度(即第一荧光强度)，带入拟合曲线即得。
48.在此有必要指出的是，以上实施例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和说明，并不是对本发明的技术方案的进一步的限制，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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引物核酸分子、聚合酶活性测定方法及试剂盒
技术领域
1.本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种聚合酶活性测定方法及试剂盒。
背景技术：
2.聚合酶又称多聚酶，是专门生物催化合成脱氧核糖核酸和核糖核酸的一类酶的统称。目前，市场上常见的聚合酶活性测定方法主要是放射性同位素标记结合凝胶电泳，但是同位素存在辐射，对人体有害，实验过程中所有的试剂、耗材等均需专门处理，否则会污染环境。
3.因此，如何建立一种不依赖同位素标记的聚合酶活性测定方法具有重要的意义。
技术实现要素：
4.基于此，本发明的目的之一在于提供一种模板
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引物核酸分子，所述模板
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引物核酸分子包括模板链和引物链；所述模板链包括与引物链配对的模板配对区和单链区，所述单链区为多个重复单元组成的单链核苷酸序列，所述重复单元是长度为1～10bp的单链核苷酸序列，所述引物链的碱基序列为gcagagag，具体如seq id no:1所示。
5.作为本发明的一种优选地实施方式，所述单链区的长度为30～70bp。
6.作为本发明的一种优选地实施方式，所述重复单元为ac或cgt或gag或aagc或ccat或aagga或cgaac或tctcgc或cctctt或ctacgcaa或tagaaaaa或gccactgtat或atccttatct。
7.本发明的目的之二在于提供一种聚合酶活性测定方法，包括以下步骤：
8.(1)制备反应体系进行聚合酶的延伸反应，所述反应体系包括模板
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引物核酸分子、待测聚合酶、底物和缓冲液；
9.(2)终止反应并加入双链dna染料；
10.(3)检测反应体系中反应产物结合双链dna染料产生的第一荧光强度；
11.(4)根据第二荧光强度与参照品的量的标准曲线，将第一荧光强度换算呈对应的参照品的量，以所述参照品的量表征所述待测聚合酶活性；
12.其中，所述参照品为由两条单链核苷酸序列完全互补配对形成的双链核酸分子，第二荧光强度为所述参照品结合双链dna染料产生的荧光强度。
13.作为本发明的一种优选地实施方式，所述聚合酶延伸反应开始前还包括热启动步骤。
14.作为本发明的一种优选地实施方式，所述双链dna染料为sybr green i或picogreen。
15.本发明的目的之三在于提供一种检测聚合酶活性的试剂盒，所述试剂盒包括上述的模板
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引物核酸分子。
16.本发明所提供的模板
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引物核酸分子，能够用于聚合酶活性的测定，且其能够避免单链区形成二级结构从而导致活性测定不准确的问题，本发明所提供的聚合酶活性检测方法，无需涉及到同位素标记等，安全无毒，成本低。
具体实施方式
17.下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。
18.以下各实施例，仅用于说明本发明，但不止用来限制本发明的范围。基于本发明中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。
19.在本发明实施例中，若无特殊说明，所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品；在本发明实施例中，若未具体指明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
20.实施例1
21.本实施例提供一种模板
‑
引物核酸分子，模板
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引物核酸分子包括模板链和引物链；模板链包括与引物链配对的模板配对区和单链区，单链区为多个重复单元组成的单链核苷酸序列，重复单元的长度为1～10bp的单链核苷酸序列，引物链条的碱基序列为gcagagag，具体如seq id no:1所示。
22.其中重复单元可以为ac或cgt或gag或aagc或ccat或aagga或cgaac或tctcgc或cctctt或ctacgcaa或tagaaaaa或gccactgtat或atccttatct。
23.更具体地为：
24.2bp重复序列为：
25.acacacacacacacacacacacacacacctctctgc，如seq id no:2所示；
26.3bp重复序列为：
27.cgtcgtcgtcgtcgtcgtcgtcgtcgtcgtcgtcgtctctctgc，如seq id no:3所示；或gaggaggaggaggaggaggaggaggaggaggagctctctgc，如seq id no:4所示。
28.4bp重复序列为：
29.aagcaagcaagcaagcaagcaagcaagcaagcaagcaagcaagcctctctgc,如seq id no:5所示；或ccatccatccatccatccatccatccatccatccatccatccatccatctctctgc，如seq id no:6所示。
30.5bp重复序列为：
31.aaggaaaggaaaggaaaggaaaggaaaggaaaggaaaggactctctgc，如seq id no:7所示；或cgaaccgaaccgaaccgaaccgaaccgaaccgaaccgaacctctctgc，如seq id no:8所示。
32.6bp重复序列为：
33.tctcgctctcgctctcgctctcgctctcgctctcgcctctctgc，如seq id no:9所示；或cctcttcctcttcctcttcctcttcctcttcctcttctctctgc，如seq id no:10所示。
34.8bp重复序列为：
35.ctacgcaactacgcaactacgcaactacgcaactacgcaactacgcaactctctgc，如seq id no:11所示；或tagaaaaatagaaaaatagaaaaatagaaaaatagaaaaatagaaaaactctctgc，如seq id no:12所示。
36.10bp重复序列为
37.gccactgtatgccactgtatgccactgtatgccactgtatgccactgtatgccactgtatctctctgc，如seq id no:13所示；或atccttatctatccttatctatccttatctatccttatctatccttatctatcct
tatctctctctgc，如seq id no:14所示。
38.上述模板
‑
引物核酸分子由武汉金开瑞引物生物工程有限公司合成。
39.实施例2
40.本实施例提供一种聚合酶活性测定方法，包括以下步骤：
41.(1)制备反应体系进行聚合酶的延伸反应，所述反应体系包括模板
‑
引物核酸分子、待测聚合酶、底物和缓冲液；反应体系见下表1所示：
42.表1聚合酶延伸反应体系
43.试剂用量双链核酸分子(10μm)3μltaq dna聚合酶5μltaq缓冲液10μl底物(2mm)10μl水22μl
44.其中，所述双链核酸分子是由模板
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引物核酸分子中引物链条的碱基序列为gcagagag，如seq id no:1所示，模板链的碱基序列为acacacacacacacacacacacacacacctctctgc，如seq id no:2所示的模板
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引物核酸分子得到的。
45.其中taq dna聚合酶浓度为0.06mg/ml，用1％bsa缓冲液稀释100倍后再按梯度稀释为系列浓度。
46.将上述个反应体系混合均匀后，55℃保温10min，加入50μlsybr green i染料并震荡均匀，分别检测上述各反应体系的荧光强度(即第二荧光强度)，并得到r2≥0.99的拟合曲线。
47.重新按照表1的成分配置待测聚合酶的延伸反应体系，将反应体系混合均匀后，55℃保温10min，加入50μlsybr green i染料并震荡均匀，分别检测反应体系的荧光强度(即第一荧光强度)，带入拟合曲线即得。
48.在此有必要指出的是，以上实施例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和说明，并不是对本发明的技术方案的进一步的限制，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
再多了解一些
本文用于企业家、创业者技术爱好者查询，结果仅供参考。
