基于表面活化受体和抑制受体表达的NK细胞数量扩增方法与流程

基于表面活化受体和抑制受体表达的nk细胞数量扩增方法
技术领域
1.本发明涉及到nk细胞数量扩增技术领域，特别涉及基于表面活化受体和抑制受体表达的nk细胞数量扩增方法。


背景技术：

2.自然杀伤细胞(natural killer cell，nk细胞)在人体的先天免疫系统中起着重要的作用，早在70年代，科研人员就对它们进行了描述，但直到最近的15年，人们才逐渐了解nk细胞在帮助抗击癌症和其它疾病方面的复杂性和治疗潜力。
3.1、在现有的nk细胞数量扩增研究中，大多研究实验中，其使用器皿多为固定式，更换数量少，无法根据其变化进行转换，不方便对细胞进行观测；
4.2、在研究后，无法根据多种诱导因子的加入进行研究，不能确定不同因子导致的nk细胞具体作用。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供基于表面活化受体和抑制受体表达的nk细胞数量扩增方法，为细胞提供更充分的氧气交换，能够为细胞提供更大来源的养分，为细胞提供良好的对流环境，培养基中的溶质通过自然对流可自由移动到细胞，不需要复杂的混合或灌注仪器，提高培养的便捷性，也增加细胞培养质量，为nk细胞体外扩增方案的选择提供了可靠的基础研究，在此基础之上，可以进一步地探讨和优化扩增方案，从而获得高效高纯度的nk细胞，便于后期进行翻阅以及在实验的数据上进行研究，对下次研究进行铺垫，提高后期研究质量，以解决上述背景技术中提出的问题。
6.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
7.基于表面活化受体和抑制受体表达的nk细胞数量扩增方法，包括如下步骤：
8.s1：原料准备：自体或异体nk细胞用于移植，可从不同来源获得细胞，包括外周血单个核细胞、脐带血、骨髓、诱导多能干细胞和细胞系，取多组用于进行实验的培养器具；
9.s2：实验进行：体外扩增nk细胞，使用细胞因子进行扩增nk细胞并提高其活性，细胞因子介导nk细胞的增殖和活化，其细胞因子包括il
‑
2、il
‑
15、il
‑
12、il
‑
18、il
‑
21和i型干扰素；
10.s3：扩增观察：将取出的原料放置在培养器具内加入诱导扩增因子进行混合后，并对培养器内的细胞进行持续性的观察的添加性实验；
11.s4：细胞检测：在扩增培育尾期，取培养器具内细胞到细胞皿内进行检测，将检测结果实时记录；
12.s5：结论对比：将多组实验记录信息进行整合，并对多组结果以及过程进行比较，将对比结果进行记录并存档。
13.进一步地，针对s1中，培养器具包括培养瓶、培养袋以及生物反应器，且培养瓶分为开放型培养瓶和封闭式培养瓶。
14.进一步地，针对s2中的实验进行包括如下步骤：
15.s201：取外周血单个核细胞、脐带血、骨髓、诱导多能干细胞和细胞系中的一种经病毒检测合格后，送入实验室中，取70ml血细胞，按常规的血浆及pbmc分离方法分离获得血浆和白细胞层；
16.s202：白细胞层经洗涤，计数为7.4*107，以1.5*106个/ml密度接种在培养器皿中，取多组检测用于检测的细胞体，分别放置在不同的培养器皿中进行扩增实验；
17.s203：加入诱导培养基、因子及灭活血浆，放置在37℃，5％co2的二氧化碳培养箱中培养，其中的诱导培养基内也包括有辅助细胞和生长失活的滋养细胞。
18.进一步地，针对s201中，血细胞为新鲜血液进行采集，脐血尽可能采集新鲜血液，分离人外周血单个核细胞(pbmc)的分层液比重是1.077
±
0.001的聚蔗糖
‑
泛影葡胺分层液，离心后沉于管底，淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中，吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。
19.进一步地，针对s201中，在分离过程中，要实时掌控离心器械的温度，并对离心的升降速进行设置。
20.进一步地，针对s3中的扩增观察包括如下步骤：
21.s301：将刚进行实验的细胞加入诱导因子后进行观察，显微镜下观察细胞生长状况，细胞经诱导刺激，有明显的半贴壁聚团生长，部分细胞聚团悬浮生长，细胞略有增殖，增殖不明显；
22.s302：在初步观察后，补充诱导培养基，并持续性进行细胞观察，细胞经过培养，半悬浮贴壁较d2增多，细胞聚团更为明显，在此期间减少对细胞的晃动，避免干扰细胞成团；
23.s303：细胞尺寸观察中，并尺寸补充增殖培养基液体，在观察过程中，经过两天的培养，半悬浮贴壁的细胞已开始悬浮于培养基中，培养基颜色变黄，其中细胞计数为1.1*106/ml，补充增殖培养基，刺激nk细胞增殖；
24.s304：在多次补充增殖培养基后，培养基颜色变黄，显微镜下可明显看到细胞聚团增大，细胞计数为2.0*106/ml，补充增殖培养基，调整细胞密度，刺激nk细胞增殖，细胞转移至培养袋中培养，略微吹打细胞，使细胞团略微分散，轻晃培养袋，使细胞分散培养；
25.s305：持续在培养袋中培养，并观测到培养基变黄，取细胞计数并将细胞放置在细菌皿中观察形态，发现细胞已基本分散生长，细胞计数为1.5*106/ml，持续型补充培养基；
26.s306：培养袋中培养基持续变黄，取细胞计数并将细胞放置在细菌皿中观察形态，发现细胞已呈不规则形态，部分细胞有触角伸出，细胞计数为1.7*106/ml，持续补充培养基。
27.进一步地，针对s4中，当培养袋中培养基持续变黄后，取细胞进行流式细胞检测，细胞计数为1.5*106/ml，补充培养基，流式细胞检测：cd3
‑
/cd16 cd56 为82.74％，在进行过一次流式细胞检测后，第二天，进行二次流式细胞检测，检测的细胞计数为2.0*106/ml，流式细胞检测：cd3
‑
/cd16 cd56 为90.98％。
28.进一步地，针对s4中，流式细胞术检测扩增后细胞的表型进行检测，分别收集多天培育的细胞，调整细胞密度至1x105/ml,以percp
‑
cd3、pe
‑
cd4、fitc
‑
cd8、fitc
‑
cd45ro、fitc
‑
cd45ra、percp
‑
cd45、pe
‑
ccr7标记t细胞亚群，以percp
‑
cd4、pe
‑
cd25、apc
‑
cd127标记
treg细胞，fitc
‑
cd3、pe
‑
cd16、pecd 56标记nk、nkt细肥，同时标记fitc
‑
1gg2o、pe
‑
1gg2α作为对照进行免疫表型检测。
29.进一步地，针对s4中，在流式细胞术检测扩增后，对ldh释放法检测扩增后nk细胞的杀伤活性进行检测，采用ldh释放法检测各培养万来的打增产物中nk细胞的杀伤活性，调整效应细胞密度至4x10
°
/ml、靶细胞密度至1
×
103/ml，取96孔圆底培养板，每个样本做3个复孔，按效靶比40：1、20：1、10：1加入效应细胞与靶细胞，并设效应细胞自然释放对照孔每孔100ul效应细胞 100jul培养液，以及最大和最小靶细胞对照孔每孔10oul靶细胞 100ul培养液，再设本底和体积纠正孔每孔200ul培养液，将培养板放于37℃.5％co，细胞培养箱中4h，在最大孔和体积纠正孔内加入20ul的裂解缓冲液，放置30min，以800
×
g的转速离心10min后，特扎吸取5ojul上清到相应平底培养板，再在避光的条件下加50ul反应底物，室温避光20～30min，待各孔液体颜色转深时加终止液50ul/孔，将96孔板置于酶标仪中，检测492nm波长处的光密度d值。
30.进一步地，针对s5中，持续型记录多组实验数据，并将数据进行整合后，储存到数据库内，并根据需要对多组数据进行分析和比对，将数据比对结果进行储存，便于多组实验的结果进行直观了解。
31.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
32.1、本发明提出的基于表面活化受体和抑制受体表达的nk细胞数量扩增方法，培养器具包括培养瓶、培养袋以及生物反应器，且培养瓶分为开放型培养瓶和封闭式培养瓶，培养瓶式培养器具为细胞提供更充分的氧气交换，独特的气体交换膜为细胞提供均匀的透气膜平面，独特的膜支撑结构使膜保持在水平位置，能够为细胞提供更大来源的养分，培养基的液面很高，远超过培养瓶0.3mm或培养袋1cm的限度，为细胞提供良好的对流环境，细胞与o2直接交换，co2直接排出不会影响细胞培养环境，同时，培养基中的溶质通过自然对流可自由移动到细胞，不需要复杂的混合或灌注仪器，提高培养的便捷性，也增加细胞培养质量。
33.2、本发明提出的基于表面活化受体和抑制受体表达的nk细胞数量扩增方法，通过进行细胞检测，针对不同的检测数据，以最少的细胞因子组合作为nk细胞体外扩增的经典方案展现出了一定的优势，为nk细胞体外扩增方案的选择提供了可靠的基础研究，在此基础之上，可以进一步地探讨和优化扩增方案，从而获得高效高纯度的nk细胞。
34.3、本发明提出的基于表面活化受体和抑制受体表达的nk细胞数量扩增方法，持续型记录多组实验数据，并将数据进行整合后，储存到数据库内，并根据需要对多组数据进行分析和比对，将数据比对结果进行储存，便于多组实验的结果进行直观了解，将数据进行储存，便于后期进行翻阅以及在实验的数据上进行研究，对下次研究进行铺垫，提高后期研究质量。
附图说明
35.图1为本发明的整体结构流程图；
36.图2为本发明的方法流程图；
37.图3为本发明的步骤二的流程图；
38.图4为本发明的步骤三的流程图。
具体实施方式
39.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
40.实施例一：
41.请参阅图1
‑
图2，基于表面活化受体和抑制受体表达的nk细胞数量扩增方法，包括如下步骤：
42.s1：原料准备：自体或异体nk细胞用于移植，可从不同来源获得细胞，包括外周血单个核细胞、脐带血、骨髓、诱导多能干细胞和细胞系，取多组用于进行实验的培养器具；
43.s2：实验进行：体外扩增nk细胞，使用细胞因子进行扩增nk细胞并提高其活性，细胞因子介导nk细胞的增殖和活化，其细胞因子包括il
‑
2、il
‑
15、il
‑
12、il
‑
18、il
‑
21和i型干扰素；
44.s3：扩增观察：将取出的原料放置在培养器具内加入诱导扩增因子进行混合后，并对培养器内的细胞进行持续性的观察的添加性实验；
45.s4：细胞检测：在扩增培育尾期，取培养器具内细胞到细胞皿内进行检测，将检测结果实时记录；
46.s5：结论对比：将多组实验记录信息进行整合，并对多组结果以及过程进行比较，将对比结果进行记录并存档。
47.培养器具包括培养瓶、培养袋以及生物反应器，且培养瓶分为开放型培养瓶和封闭式培养瓶，培养瓶式培养器具为细胞提供更充分的氧气交换，独特的气体交换膜为细胞提供均匀的透气膜平面，独特的膜支撑结构使膜保持在水平位置，能够为细胞提供更大来源的养分，培养基的液面很高，远超过培养瓶0.3mm或培养袋1cm的限度，为细胞提供良好的对流环境，细胞与o2直接交换，co2直接排出不会影响细胞培养环境，同时，培养基中的溶质通过自然对流可自由移动到细胞，不需要复杂的混合或灌注仪器，提高培养的便捷性，也增加细胞培养质量。
48.请参阅图3，针对s2中的实验进行包括如下步骤：
49.s201：取外周血单个核细胞、脐带血、骨髓、诱导多能干细胞和细胞系中的一种经病毒检测合格后，送入实验室中，取70ml血细胞，按常规的血浆及pbmc分离方法分离获得血浆和白细胞层；
50.s202：白细胞层经洗涤，计数为7.4*107，以1.5*106个/ml密度接种在培养器皿中，取多组检测用于检测的细胞体，分别放置在不同的培养器皿中进行扩增实验；
51.s203：加入诱导培养基、il
‑
2因子及灭活血浆，放置在37℃，5％co2的二氧化碳培养箱中培养。
52.血细胞为新鲜血液进行采集，脐血尽可能采集新鲜血液，分离人外周血单个核细胞(pbmc)的分层液比重是1.077
±
0.001的聚蔗糖
‑
泛影葡胺分层液，离心后沉于管底，淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中，吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞，在分离过程中，要实时掌控离心器械的温度，并对离心的升降速进行设置，通过加入il
‑
2因
子，il
‑
2可在短时间内促进nk细胞的存活、激活和提高细胞毒性，il
‑
2刺激pbmcs可导致淋巴因子激活的杀伤细胞数量的增加，lak由nk细胞和t细胞组成，对自体肿瘤细胞具有较高的杀伤能力，同时，il
‑
12也用于体外nk细胞培养，刺激nk细胞产生ifn
‑
y，能够针对性进行细胞扩增。
53.请参阅图4，针对s3中的扩增观察包括如下步骤：
54.s301：将刚进行实验的细胞加入诱导因子后进行观察，显微镜下观察细胞生长状况，细胞经诱导刺激，有明显的半贴壁聚团生长，部分细胞聚团悬浮生长，细胞略有增殖，增殖不明显；
55.s302：在初步观察后，补充诱导培养基，并持续性进行细胞观察，细胞经过培养，半悬浮贴壁较d2增多，细胞聚团更为明显，在此期间减少对细胞的晃动，避免干扰细胞成团；
56.s303：细胞尺寸观察中，并尺寸补充增殖培养基液体，在观察过程中，经过两天的培养，半悬浮贴壁的细胞已开始悬浮于培养基中，培养基颜色变黄，其中细胞计数为1.1*106/ml，补充增殖培养基，刺激nk细胞增殖；
57.s304：在多次补充增殖培养基后，培养基颜色变黄，显微镜下可明显看到细胞聚团增大，细胞计数为2.0*106/ml，补充增殖培养基，调整细胞密度，刺激nk细胞增殖，细胞转移至培养袋中培养，略微吹打细胞，使细胞团略微分散，轻晃培养袋，使细胞分散培养；
58.s305：持续在培养袋中培养，并观测到培养基变黄，取细胞计数并将细胞放置在细菌皿中观察形态，发现细胞已基本分散生长，细胞计数为1.5*106/ml，持续型补充培养基；
59.s306：培养袋中培养基持续变黄，取细胞计数并将细胞放置在细菌皿中观察形态，发现细胞已呈不规则形态，部分细胞有触角伸出，细胞计数为1.7*106/ml，持续补充培养基。
60.当培养袋中培养基持续变黄后，取细胞进行流式细胞检测，细胞计数为1.5*106/ml，补充培养基，流式细胞检测：cd3
‑
/cd16 cd56 为82.74％，在进行过一次流式细胞检测后，第二天，进行二次流式细胞检测，检测的细胞计数为2.0*106/ml，流式细胞检测：cd3
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/cd16 cd56 为90.98％，流式细胞术检测扩增后细胞的表型进行检测，分别收集多天培育的细胞，调整细胞密度至1x105/ml,以percp
‑
cd3、pe
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cd4、fitc
‑
cd8、fitc
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cd45ro、fitc
‑
cd45ra、percp
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cd45、pe
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ccr7标记t细胞亚群，以percp
‑
cd4、pe
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cd25、apc
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cd127标记treg细胞，fitc
‑
cd3、pe
‑
cd16、pecd 56标记nk、nkt细肥，同时标记fitc
‑
1gg2o、pe
‑
1gg2α作为对照进行免疫表型检测，在流式细胞术检测扩增后，对ldh释放法检测扩增后nk细胞的杀伤活性进行检测，采用ldh释放法检测各培养万来的打增产物中nk细胞的杀伤活性，调整效应细胞密度至4x10
°
/ml、靶细胞密度至1
×
103/ml，取96孔圆底培养板，每个样本做3个复孔，按效靶比40：1、20：1、10：1加入效应细胞与靶细胞，并设效应细胞自然释放对照孔每孔100ul效应细胞 100jul培养液，以及最大和最小靶细胞对照孔每孔10oul靶细胞 100ul培养液，再设本底和体积纠正孔每孔200ul培养液，将培养板放于37℃.5％co，细胞培养箱中4h，在最大孔和体积纠正孔内加入20ul的裂解缓冲液，放置30min，以800
×
g的转速离心10min后，特扎吸取5ojul上清到相应平底培养板，再在避光的条件下加50ul反应底物，室温避光20～30min，待各孔液体颜色转深时加终止液50ul/孔，将96孔板置于酶标仪中，检测492nm波长处的光密度d值，通过进行细胞检测，针对不同的检测数据，以最少的细胞因子组合作为nk细胞体外扩增的经典方案展现出了一定的优势，为nk细胞体外扩增方案的选择提供了可靠
的基础研究，在此基础之上，可以进一步地探讨和优化扩增方案，从而获得高效高纯度的nk细胞。
61.持续型记录多组实验数据，并将数据进行整合后，储存到数据库内，并根据需要对多组数据进行分析和比对，将数据比对结果进行储存，便于多组实验的结果进行直观了解，将数据进行储存便于，后期进行翻阅以及在实验的数据上进行研究，对下次研究进行铺垫，提高后期研究质量。
62.实施例二：
63.针对s2中的实验进行包括如下步骤：
64.s201：取外周血单个核细胞、脐带血、骨髓、诱导多能干细胞和细胞系中的一种经病毒检测合格后，送入实验室中，取70ml血细胞，按常规的血浆及pbmc分离方法分离获得血浆和白细胞层；
65.s202：白细胞层经洗涤，计数为7.4*107，以1.5*106个/ml密度接种在培养器皿中，取多组检测用于检测的细胞体，分别放置在不同的培养器皿中进行扩增实验；
66.s203：加入诱导培养基、il
‑
2和il
‑
15联合因子及灭活血浆，放置在37℃，5％co2的二氧化碳培养箱中培养。
67.血细胞为新鲜血液进行采集，脐血尽可能采集新鲜血液，分离人外周血单个核细胞(pbmc)的分层液比重是1.077
±
0.001的聚蔗糖
‑
泛影葡胺分层液，离心后沉于管底，淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中，吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞，在分离过程中，要实时掌控离心器械的温度，并对离心的升降速进行设置，通过加入il
‑
2和il
‑
15联合因子，l
‑
2和il
‑
15联合应用可促进nk细胞的增殖和活性，有利于nk细胞的激活，且只有il
‑
15可以维持nk细胞在输注患者后的细胞溶解功能，il
‑
2和il
‑
15诱导nk细胞活化受体nkg2d、nkp44、nkp30和nkp46的表达，提高其对肿瘤细胞株的细胞毒性。
68.实施例三：
69.针对s2中的实验进行包括如下步骤：
70.s201：取外周血单个核细胞、脐带血、骨髓、诱导多能干细胞和细胞系中的一种经病毒检测合格后，送入实验室中，取70ml血细胞，按常规的血浆及pbmc分离方法分离获得血浆和白细胞层；
71.s202：白细胞层经洗涤，计数为7.4*107，以1.5*106个/ml密度接种在培养器皿中，取多组检测用于检测的细胞体，分别放置在不同的培养器皿中进行扩增实验；
72.s203：加入诱导培养基、ill
‑
12、il
‑
15和il
‑
18联合因子及灭活血浆，放置在37℃，5％co2的二氧化碳培养箱中培养。
73.血细胞为新鲜血液进行采集，脐血尽可能采集新鲜血液，分离人外周血单个核细胞(pbmc)的分层液比重是1.077
±
0.001的聚蔗糖
‑
泛影葡胺分层液，离心后沉于管底，淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中，吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞，在分离过程中，要实时掌控离心器械的温度，并对离心的升降速进行设置，通过加入ill
‑
12、il
‑
15和il
‑
18联合因子，ill
‑
12、il
‑
15和il
‑
18联合作用可诱导细胞因子诱导的记忆样nk细胞，是一种寿命长、细胞毒性高、分泌ifn
‑
y的细胞，ciml
‑
nk细胞已在小鼠肿瘤模型中进
行过继免疫治疗，并显示出抗黑色素瘤和淋巴瘤的良好效果。
74.综上所述，本发明提出的基于表面活化受体和抑制受体表达的nk细胞数量扩增方法，培养器具包括培养瓶、培养袋以及生物反应器，且培养瓶分为开放型培养瓶和封闭式培养瓶，培养瓶式培养器具为细胞提供更充分的氧气交换，独特的气体交换膜为细胞提供均匀的透气膜平面，独特的膜支撑结构使膜保持在水平位置，能够为细胞提供更大来源的养分，培养基的液面很高，远超过培养瓶0.3mm或培养袋1cm的限度，为细胞提供良好的对流环境，细胞与o2直接交换，co2直接排出不会影响细胞培养环境，同时，培养基中的溶质通过自然对流可自由移动到细胞，不需要复杂的混合或灌注仪器，提高培养的便捷性，也增加细胞培养质量，通过进行细胞检测，针对不同的检测数据，以最少的细胞因子组合作为nk细胞体外扩增的经典方案展现出了一定的优势，为nk细胞体外扩增方案的选择提供了可靠的基础研究，在此基础之上，可以进一步地探讨和优化扩增方案，从而获得高效高纯度的nk细胞，持续型记录多组实验数据，并将数据进行整合后，储存到数据库内，并根据需要对多组数据进行分析和比对，将数据比对结果进行储存，便于多组实验的结果进行直观了解，将数据进行储存便于，后期进行翻阅以及在实验的数据上进行研究，对下次研究进行铺垫，提高后期研究质量。
75.以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。