一株苋菜红、胭脂红单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用的制作方法

1.本发明涉及一株苋菜红、胭脂红单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫检测领域。


背景技术：

2.苋菜红、胭脂红是目前我国批准使用的偶氮类人工合成色素。苋菜红、胭脂红作为食品色素可少量用于果汁饮料、蜜饯、碳酸饮料、糖果、蜜饯等食品的着色，而不能用于肉类及其加工品、水产品及其加工品调味品婴儿食品中。苋菜红、胭脂红在体内的代谢产物为芳香胺类化合物，芳香胺类化合物在体内经过代谢活动后与靶细胞作用可能引起肿瘤。长期食用含苋菜红、胭脂红这两个合成的偶氮染料超标的食品可能危害人体健康，引起部分人群过敏和哮喘，诱发癌症和其他疾病。因此，有必要建立快速、高效的食品中苋菜红、胭脂红的检测方法。
3.苋菜红、胭脂红含量分析方法有近红外广谱法、高效液相色谱法(hplc)、液质联用 (lc
‑
ms)等仪器方法，这些检测方法具有耗时、步骤繁琐、无法进行现场快速检测、成本高等缺点，因此建立快速简便的苋菜红、胭脂红检测方法具有重要意义。酶联免疫法（elisa）是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，适用于大量样本的现场快速检测，为苋菜红、胭脂红检测提供了一种新的检测途径。
4.cn 102313804 a公开了一种用于检测苋菜红的方法及酶联免疫试剂盒，其所提供的检测苋菜红的酶联免疫试剂盒，包括苋菜红半抗原和苋菜红的特异性抗体；所述特异性抗体为所述苋菜红的多克隆抗体或单克隆抗体。
5.cn 102313807 a公开了一种用于检测胭脂红的方法及酶联免疫试剂盒，其所提供的检测胭脂红的酶联免疫试剂盒，包括胭脂红半抗原和胭脂红的特异性抗体；所述特异性抗体为所述胭脂红的多克隆抗体或单克隆抗体。
6.上述现有技术均采用酶联免疫法（elisa），但均未公开采用的半抗原具体结构，且其灵敏度相对于本发明较低，并且不能够同时检测苋菜红和胭脂红。
7.日落黄和胭脂红酶联免疫吸附测定法的建立（南开大学，邢玥）涉及了一种日落黄及胭脂红结构类似物作为半抗原，其中胭脂红检测方法的灵敏度为36.82ng/ml，建立方法的标准曲线方程为y=0.981550.15373x，工作范围是1
‑
1000ng/l；其灵敏度远低于本发明。


技术实现要素：

8.本发明的目的是克服上述不足之处，提供一株苋菜红、胭脂红单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，苋菜红、胭脂红单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体可制成用于检测苋菜红、胭脂红的试剂盒，具有实际应用价值。
9.本发明的技术方案，一株苋菜红、胭脂红单克隆抗体杂交瘤细胞株das 3h10，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心cgmcc，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2020年9月27日，保
藏编号cgmcc no.20789。
10.苋菜红、胭脂红单克隆抗体，它由所述保藏编号为cgmcc no.20789的杂交瘤细胞株das 3h10分泌产生。
11.苋菜红、胭脂红半抗原，具体为ama
‑
cooh，合成路线如下所示：。
12.所述苋菜红、胭脂红半抗原的制备方法，步骤如下：称取化合物14
‑
氨基
‑1‑
萘甲酸，加入盐酸，滴加nano2至淀粉碘化钾试纸变蓝后继续反应，得到a液；向化合物2 3
‑
羟基
‑
2,7
‑
萘二磺酸二钠中滴加无水乙醇至3
‑
羟基
‑
2,7
‑
萘二磺酸二钠全部溶解，得到b液；向b液体中缓慢滴加a液，用naoh调ph呈碱性，立即产生大量絮状沉淀，继续反应一段时间后离心沉淀，干燥后得到化合物3，即为半抗原ama
‑
cooh。
13.进一步地，所述苋菜红、胭脂红半抗原的制备方法，步骤为：称取1870
‑
200 mg化合物1 4
‑
氨基
‑1‑
萘甲酸，加入4
‑
5 ml 1 m的盐酸，滴加nano2至淀粉碘化钾试纸变蓝后4℃继续反应20
‑
30 min，得到a液；向340
‑
350 mg化合物2 3
‑
羟基
‑
2,7
‑
萘二磺酸二钠滴加无水乙醇至3
‑
羟基
‑
2,7
‑
萘二磺酸二钠全部溶解，得到b液；向b液体中缓慢滴加a液，用naoh调ph 8
‑
9，立即产生大量絮状沉淀，继续反应1
‑
2 h后离心沉淀，干燥后得到红色粉末化合物3，即为半抗原ama
‑
cooh。
14.苋菜红、胭脂红完全抗原的制备方法，具体包括免疫原和包被原；进一步地，所述免疫原制备过程为：称取苋菜红、胭脂红半抗原ama
‑
cooh，1
‑
乙基碳二亚胺盐酸盐和n
‑
羟基琥珀酰亚胺，用无水n,n
‑
二甲基甲酰胺溶解，得到a1液，室温搅拌反应；取牛血清蛋白bsa，用硼酸盐缓冲溶液溶解，得到b1液，在室温条件，将a1液加入到b1液中，室温反应，即得偶联物ama
‑
cooh
‑
bsa混合液，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原，得到偶联物ama
‑
cooh
‑
bsa；进一步地，所述包被原制备过程为：称取苋菜红、胭脂红半抗原ama
‑
cooh，1
‑
乙基碳二亚胺盐酸盐和n
‑
羟基琥珀酰亚胺，用无水n,n
‑
二甲基甲酰胺溶解，得到a2液，室温搅拌反应；称取鸡卵清白蛋白ova，溶解于硼酸盐缓冲溶液中，得到b2溶液，在室温条件下，将a2液加入到b2液中，室温反应12h，即得偶联物ama
‑
cooh
‑
ova混合液，通过透析分离包被原和未偶联的小分子半抗原。
15.所述苋菜红、胭脂红完全抗原的制备方法，所述免疫原的制备过程为：称取9
‑
10 mg苋菜红、胭脂红半抗原ama
‑
cooh，1
‑
乙基碳二亚胺盐酸盐10
‑
15 mg和n
‑
羟基琥珀酰亚胺6
‑
7 mg，用500
‑
600 μl无水n,n
‑
二甲基甲酰胺溶解，得到a1液，室温搅拌反应6
‑
8 h；称取10
‑
15 mg牛血清蛋白bsa，用2 ml 0.1m硼酸盐缓冲溶液溶解，得到b1液；在室温条件，将a1
液加入到b1液中，室温反应10
‑
12 h，即得偶联物ama
‑
cooh
‑
bsa混合液，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原，得到偶联物免疫原ama
‑
cooh
‑
bsa。
16.进一步地，苋菜红、胭脂红完全抗原的制备方法，所述包被原的制备过程为：称取3
‑
4 mg ama
‑
cooh半抗原，1
‑
乙基碳二亚胺盐酸盐3
‑
4 mg，n
‑
羟基琥珀酰亚胺2
‑
3 mg，用500
‑
600 μl无水n,n
‑
二甲基甲酰胺溶解，得到a2液，室温搅拌反应6
‑
8 h；称取10
‑
15 mg鸡卵清白蛋白ova，溶解于2 ml 0.1m硼酸盐缓冲溶液中，得到b2溶液；在室温条件下，将a2液加入到b2液中，室温反应10
‑
12 h，即得偶联物ama
‑
cooh
‑
ova混合液，通过透析分离包被原和未偶联的小分子半抗原。
17.所述苋菜红、胭脂红单克隆抗体的应用，建立苋菜红、胭脂红含量的免疫检测方法，应用于食品中苋菜红、胭脂红的检测。
18.进一步地，所述检测领域为果蔬、冷饮、肉制品和其他含有苋菜红、胭脂红的食品中。
19.本发明的苋菜红、胭脂红单克隆抗体杂交瘤细胞株的筛选方法，主要包括以下步骤：（1）小鼠的免疫：将免疫原ama
‑
cooh
‑
bsa与等量弗氏佐剂混合乳化后，通过背部皮下注射免疫balb/c小鼠；首次免疫用完全弗氏佐剂，多次加强免疫用不完全弗氏佐剂，首次免疫与第二次加强免疫之间间隔28天，多次加强免疫之间间隔21天，最后一次用ama
‑
cooh
‑
bsa完全抗原（不含佐剂）冲刺免疫；通过间接竞争酶联免疫法（ic
‑
elisa）检测血清效价和抑制；（2）细胞融合与细胞株建立：通过聚乙二醇（peg 4000）法将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合，通过hat培养基培养，利用间接竞争酶联免疫法（ic
‑
elisa）检测阳性细胞孔，并进一步利用ic
‑
elisa测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对最好抑制效果的阳性细胞孔进行三次亚克隆，最终筛选获得苋菜红、胭脂红单克隆抗体杂交瘤细胞株；（3）杂交瘤细胞株性质的鉴定：通过ic
‑
elisa测定灵敏度和特异性。
20.本发明的有益效果：本发明提供的苋菜红、胭脂红单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体对苋菜红、胭脂红具有较好的特异性和检测灵敏度（ic
50
值分别为0.14 ng/ml、0.18 ng/ml），为检测果蔬、冷饮、肉制品和其他含有苋菜红、胭脂红的食品中苋菜红、胭脂红含量提供了免疫学方法。本发明提供的苋菜红、胭脂红单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体可制成用于检测苋菜红、胭脂红的试剂盒，具有实际应用价值。
21.生物材料样品保藏：一株苋菜红、胭脂红单克隆抗体杂交瘤细胞株das 3h10，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心cgmcc，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2020年9月27日，保藏编号cgmcc no.20789。
附图说明
22.图1 das 3h10单克隆抗体对苋菜红的抑制标准曲线。
23.图2 das 3h10单克隆抗体对胭脂红的抑制标准曲线。
具体实施方式
24.本发明下面的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。
25.本发明通过将苋菜红、胭脂红完全抗原ama
‑
cooh
‑
bsa免疫小鼠，通过细胞融合，hat选择性培养基培养，通过ic
‑
elisa筛选细胞上清，最终得到了对苋菜红、胭脂红有较好特异性和灵敏度的单克隆抗体杂交瘤细胞株。
26.实施例1杂交瘤细胞株das3h10的制备（1）完全抗原的制备：a、半抗原合成路线如下：a、称取187.19mg4
‑
氨基
‑1‑
萘甲酸（化合物1），加入4ml1m的盐酸，滴加nano2至淀粉碘化钾试纸变蓝后4℃继续反应30min，得到a液。向348.25mg3
‑
羟基
‑
2,7
‑
萘二磺酸二钠（化合物2）滴加无水乙醇至3
‑
羟基
‑
2,7
‑
萘二磺酸二钠全部溶解，得到b液。向b液体中缓慢滴加a液，用naoh调ph8
‑
9左右立即产生大量絮状沉淀，继续反应1h后离心沉淀，干燥后得到红色粉末（化合物3）即为半抗原ama
‑
cooh。
27.b、称取9.65mg苋菜红、胭脂红半抗原ama
‑
cooh，1
‑
乙基碳二亚胺盐酸盐10.11mg，n
‑
羟基琥珀酰亚胺6.09mg，用600μl无水n,n
‑
二甲基甲酰胺溶解，得到a1液，室温搅拌反应6h。取牛血清蛋白bsa10mg（苋菜红、胭脂红半抗原ama
‑
cooh与bsa摩尔比为120:1），用2ml0.1m硼酸盐缓冲溶液溶解，得到b1液，在室温条件，将a1液加入到b1液中，室温反应12h，即得偶联物ama
‑
cooh
‑
bsa混合液，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原，得到偶联物ama
‑
cooh
‑
bsa。
28.（2）包被原ama
‑
cooh
‑
ova的制备：称取3.65mgama
‑
cooh半抗原，1
‑
乙基碳二亚胺盐酸盐3.82mg，n
‑
羟基琥珀酰亚胺2.30mg，用600μl无水n,n
‑
二甲基甲酰胺溶解，得到a2液，室温搅拌反应6h。称取10mg鸡卵清白蛋白ova（苋菜红、胭脂红半抗原ama
‑
cooh与ova摩尔比为30:1），溶解于2ml0.1m硼酸盐缓冲溶液中，得到b2溶液，在室温条件下，将a2液加入到b2液中，室温反应12h，即得偶联物ama
‑
cooh
‑
ova混合液，通过透析分离包被原和未偶联的小分子半抗原。包被原用于单抗制备过程中小鼠血清效价和抑制的检测，并不直接用于小鼠，是制备单抗必需的。
29.（3）动物免疫：选择健康的6～8周龄的balb/c小鼠进行免疫。取苋菜红、胭脂红完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，通过背部皮下注射分别免疫balb/c小鼠。第一次免疫
用完全弗氏佐剂，之后都用不完全弗氏佐剂。首次免疫与第二次加强免疫之间间隔28天，多次加强免疫之间间隔21天。第三次免疫后7天采血（小鼠断尾采血5μl 995μl抗体稀释液=抗血清），使用ic
‑
elisa测定小鼠血清效价和抑制，选择效价高抑制好的小鼠，在第五次免疫后21天冲刺免疫，腹腔注射，冲免剂量减半且不含任何佐剂。
30.（4）细胞融合：在冲刺免疫三天后，按照常规peg（聚乙二醇，分子量为4000）方法进行细胞融合，具体步骤如下：a、摘眼球取血，颈椎脱臼法处死小鼠后，立即放入75%酒精中消毒，浸泡5 min左右，无菌操作取出小鼠的脾脏，用注射器的胶头适度研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，收集，并离心（1200 rpm，8 min），用rpmi
‑
1640培养基洗涤脾细胞三次，最后一次离心后，将脾细胞稀释到一定体积，计数，备用；b、收集sp2/0细胞：融合前7
‑
10天，将sp2/0瘤细胞用含10% fbs（胎牛血清）rpmi
‑
1640培养基在5% co2培养箱中。融合前要求sp2/0瘤细胞数量达到1~ 4
×
107，保证融合前sp2/0瘤细胞处于对数生长期。融合时，收集瘤细胞，悬浮于rpmi
‑
1640基础培养液中，进行细胞计数；c、融合过程7 min：第1 min，将1 ml的peg 1500由慢到快滴加到细胞中；第2 min，静置。第3 min和第4 min，在1 min内滴加1 ml rpmi
‑
1640培养基；第5 min和第6 min，在1 min内滴加2 ml rpmi
‑
1640培养基；第7 min，每10 s滴加1 ml的rpmi
‑
1640培养基。然后37℃温浴5 min。 离心（800 rpm，8 min），弃上清，重悬入含20%胎牛血清，2%的50
×
hat的rpmi
‑
1640筛选培养液中，按照200μl/孔加到96孔细胞板，置于37℃，5% co2培养箱中培养。
31.（5）细胞筛选与细胞株建立：在细胞融合的第3天对融合细胞进行rpmi
‑
1640筛选培养液半换液，第5天进行用含20%胎牛血清，1%的100
×
ht的rpmi
‑
1640过渡培养液进行全换液，在第7天取细胞上清进行筛选。筛选分两步：第一步先用ic
‑
elisa筛选出阳性细胞孔，第二步选用苋菜红、胭脂红为标准品，用ic
‑
elisa对阳性细胞进行抑制效果测定。选择对苋菜红、胭脂红标准品均有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，用同样的方法进行检测。重复三次，获得细胞株das 3h10。
32.（6）单克隆抗体的制备与鉴定：取8
‑
10周龄balb/c小鼠，每只小鼠腹腔注射无菌石蜡油1 ml；7天后每只小鼠腹腔注射1
×
106杂交瘤细胞，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸
‑
硫酸铵法纯化。在偏酸条件下，正辛酸可以沉淀腹水中除igg免疫球蛋白外的其他杂蛋白，然后离心，弃沉淀；再用等量饱和度的硫酸铵溶液沉淀igg型的单克隆抗体，离心，弃上清，用0.01m pbs溶液（ph 7.4）溶解后，透析脱盐，最终得到纯化后的单克隆抗体置于
‑
20℃保存。
33.实施例2 苋菜红、胭脂红单克隆抗体的ic
50
的测定碳酸盐缓冲液（cbs）：称取na2co
3 1.59 g，nahco
3 2.93 g，分别溶于少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800 ml混匀，调ph值至9.6，加双蒸水定容至1000 ml，4℃贮存备用。
34.磷酸盐缓冲液（pbs）：8.0 g nacl，0. 2g kcl，0.2g kh2po4，2.9 g na2hpo4•
12 h2o，溶于800 ml纯水中，用naoh或hcl调ph到7.2～7.4，定容至1000 ml；洗涤液（pbst）： 1000 ml的0.01 mol/lph7.4的pbs溶液中加入0.5 ml的tween 20；pbst：含0.05 % tween
–
20的pbs；
抗体稀释液：含有0.1%明胶的洗涤缓冲液；tmb显色液：a液：na2hpo4.12h2o 18.43 g，柠檬酸9.33 g，纯水定容至1000 ml；b液：60 mg tmb溶于100 ml乙二醇中。a、b液按体积比1:5混合即为tmb显色液，现用现混。
35.（1）包被：将包被原ama
‑
cooh
‑
ova用0.05 m ph9.6 碳酸盐缓冲液从1
ꢀµ
g/ml开始倍比稀释，100μl/孔，37℃反应2 h。
36.（2）洗涤：将板内溶液倾去，并用洗涤液洗涤3次，每次3 min.（3）封闭：拍干后，加入200 μl/孔封闭液，37℃反应2 h。洗涤后烘干备用。
37.（4）加样：将抗血清（小鼠断尾采血后，以抗体稀释液稀释相应倍数后即抗血清）从1:1000开始倍比稀释，并加入到各稀释度的包被孔中，100 μl/孔，37℃反应30 min；充分洗涤后，加入1:3000稀释的hrp
‑
羊抗鼠igg，100 μl/孔，37℃反应30 min。
38.（5）显色：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100 μl的tmb显色液，37 ℃避光反应15 min.（6）终止和测定：每孔加入50 μl终止液以终止反应，然后用酶标仪测定各孔的od450值。
39.用ic
‑
elisa测定单克隆抗体苋菜红、胭脂红的ic
50
分别为0.14 ng/ml、0.18 ng/ml，说明对苋菜红、胭脂红有很好的灵敏度，可用于苋菜红、胭脂红免疫分析检测。das 3h10单克隆抗体对苋菜红的抑制标准曲线如图1所示；das 3h10单克隆抗体对胭脂红的抑制标准曲线如图2所示。
40.虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。