一种基于肌抑制素基因MSTN鉴定鸭屠宰性状的分子标记及其鉴定方法和应用与流程

一种基于肌抑制素基因mstn鉴定鸭屠宰性状的分子标记及其鉴定方法和应用
技术领域
1.本发明涉及分子标记技术领域，具体涉及一种基于肌抑制素基因mstn鉴定鸭屠宰性状的分子标记及其鉴定方法和应用。


背景技术：

2.鸭肉是我国消费者重要的优质蛋白质来源，风味独特，富含有益于人体健康的不饱和脂肪酸，占家禽消费量约25％，深受消费者喜欢。肉鸭主要有白羽肉鸭、麻羽肉鸭、番鸭等，其中白羽肉鸭的出栏量占整个肉鸭出栏量的80％。当前，饲养的白羽肉鸭主要品种有樱桃谷肉鸭、z型北京鸭等。q品系白羽肉鸭是新选育的一个品系，连续开展了6个世代的选育，但对其生长发育规律等缺少研究。以mstn基因作为影响屠宰性状的候选基因，筛查肉鸭的snps位点，并分析其对屠宰性状的影响，为q系白羽肉鸭持续开展选育和分子标记辅助选择、饲养管理提供参考。
3.mstn基因是1997年美国mcphelton等研究人员在研究转化因子
‑
时在小鼠骨骼肌中发现，该基因对肌肉的增生、肥大都有显著抑制作用，因此得名肌肉抑制素(bogdanovich et al.,2010；mcpherron et al.,1997)。mstn基因主要在肌肉组织的分泌蛋白中表达，其主要功能是调节肌细胞的生长及分化，在哺乳动物及水生物的生长发育中起着关键作用。动物出生后，mstn基因主要通过抑制骨骼肌的生长从而抑制肌肉的生长，对骨骼肌的生长起负调控作用(mcpherron et al.,1997)。mstn基因的缺失或活性降低，对提高畜禽肉用性能，提高养殖经济效益带来福音。kambadur发现该基因在双肌牛中发生突变，相同饲养条件下，双肌牛提供的肉产品是普通牛的1.3倍(kambadur et al.,1997)。mstn基因突变同样在家禽中被发现，xu等(2013)对北京鸭研究发现，该基因存在3个单核苷酸突变snps，其中t129c与胸肌厚度显著相关，t952c与龙骨长度显著相关，揭示了mstn基因多态性与北京鸭胸肌性状的关系(xu et al.,2013)，揭示该基因多态性与家禽屠体性能相关。
4.基于上述内容，为了准确地挑选更适合生长发育的基因型，进而为早期选育提供数据，同时为了节省生产成本，加快遗传进展，我们提出一种基于肌抑制素基因mstn鉴定鸭屠宰性状的分子标记及其鉴定方法和应用。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种过表达后能基于肌抑制素基因mstn鉴定鸭屠宰性状的分子标记及其鉴定方法和应用，针对与鸭的屠宰性状相关的候选基因的snp(单核苷酸多态性)分子标记，以解决常规表型育种选育进展缓慢，实现早期鉴定屠宰性状这一难题。
6.本发明通过以下技术方案来实现上述目的：
7.本发明提供了一种基于肌抑制素基因mstn鉴定鸭屠宰性状的分子标记，所述分子标记为t或c，所述分子标记位于肌抑制素基因mstn的第458位。
8.进一步改进在于，所述mstn具有如seq id no.1所示的核苷酸序列。
9.本发明还提供了一种上述基于肌抑制素基因mstn鉴定鸭屠宰性状的分子标记在鉴定肉鸭屠宰性状中的应用。
10.本发明还提供了一种利用上述分子标记鉴定鸭屠宰性状的鉴定方法，包括以下步骤：
11.(1)提取肉鸭鸭翅静脉血液总dna；
12.(2)以所述分子标记所在位点及其上下游碱基组成的序列为目标序列设计特异性扩增引物，以所述总dna为模板，利用特异性扩增引物进行pcr扩增，获得扩增产物；
13.(3)对扩增产物进行基因分型检测和测序，获得待测肉鸭的分子标记类型；
14.(4)根据分子标记类型判断肉鸭屠宰性状。
15.进一步改进在于，所述目标序列如seq id no.2所示。
16.进一步改进在于，所述特异性扩增引物序列为：
17.seq id no.3：f1：taaggtccgccttgacctgt
18.seq id no.4：r1：cgggacattttcatccagtgc。
19.进一步改进在于，所述基因分型检测方法为将pcr扩增产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染获得图像，根据图像进行基因分型：
20.(1)仅含有1条带的，为cc型；
21.(2)含有2条细条带的，为tt型；
22.(3)含有1条粗带1条细带的，为tc型。
23.进一步改进在于，所述步骤(4)中根据分子标记类型判断肉鸭屠宰性状的具体步骤为：
24.(1)若待测肉鸭分子标记类型为tt型，该肉鸭的屠宰性状最好；
25.(2)若待测肉鸭分子标记类型为cc型，该肉鸭的屠宰性状最差；
26.(3)若待测肉鸭分子标记类型为tc型，该肉鸭的屠宰性状适中。
27.本发明的有益效果在于：本发明提供了一种过表达后能基于肌抑制素基因mstn鉴定鸭屠宰性状的分子标记及其鉴定方法和应用，利用mstn基因cds序列exon1上第458位碱基的多态性，根据基因型对鸭的屠宰性状进行选择。用本方法对鸭的屠宰性状进行选择，具有早期选择、节省时间、操作简单、节约成本、准确性高等优点。
附图说明
28.图1为本发明实施例中采用试剂盒法提取鸭基因组的dna电泳检测结果。
29.图2为本发明实施例中部分样品pcr特异性扩增产物的电泳图；其中，m为1kb dna marker，泳道1
‑
12为特异性扩增产物条带。
30.图3为本发明实施例中部分样品pcr特异性扩增产物的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
31.图4为mstn基因外显子中第458位点基因型验证测序结果。
具体实施方式
32.下面结合附图对本技术作进一步详细描述，有必要在此指出的是，以下具体实施
方式只用于对本技术进行进一步的说明，不能理解为对本技术保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述申请内容对本技术作出一些非本质的改进和调整。
33.1、材料
34.本实施例所用方法如无特别说明均为本领域的技术人员所知晓的常规方法，所用的试剂等材料，如无特别说明，均为市售购买产品。
35.2、方法
36.2.1获得鸭mstn基因多态位点
37.2.1.1基因组dna提取与检测
38.选取400只q系白羽肉鸭为试验材料，6周龄时进行鸭翅静脉采血，使用血液基因组dna提取试剂盒(tlanamp blood dna kit)提取血液dna，具体参照试剂盒使用说明书进行。
39.用nanodrop2000测量dna浓度及od值。用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测dna，结果如图1所示，提取的基因组dna质量较好，主带单一、清晰。
40.2.1.2引物设计
41.从鸭基因组数据库中找到seq id no.1所示的肌抑制素基因mstn对应的dna序列，以seq id no.1所示肌抑制素基因mstn的部分核苷酸序列为模板，采用primer premier 6.0和oligo7软件设计并检验特异性扩增引物，在引物设计的过程中注意尽量将snp位点设于中间位置，避免发夹结构、引物二聚体和错配等情况的发生，使引物序列最优化，引物序列如下所示：
42.f1：taaggtccgccttgacctgt(seq id no.3)
43.r1：cgggacattttcatccagtgc(seq id no.4)
44.该引物的可扩增区域的长度为339bp序列，其中包括第458位的分子标记。
45.2.1.3 pcr扩增
46.利用已合成的测序特异性引物对mstn基因的目的片段进行pcr扩增反应，pcr扩增体系为：
[0047][0048]
pcr反应条件为：95℃预变性5min；第一步95℃变性45s；第二步62℃退火45s(退火温度根据引物而定)；第三步72℃延伸30s，其中第二步到第三步循环31次，共有32个循环；72℃延伸10min。
[0049]
2.1.4 pcr扩增产物检测
[0050]
配置浓度为1.5％的琼脂糖凝胶，采用100v、40min的条件进行电泳检测，pcr扩增产物结果如图2所示，获得一条长度略大于300bp的条带，与预测的长度一致，说明获得了目标片段。利用大连宝生物有限公司的dna回收试剂盒，回收pcr扩增产物，将获得的pcr产物送至上海生工进行测序，序列如seq id no 2，与预测结果一致。
[0051]
2.1.5基因分型检测
[0052]
将pcr产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染拍照获得图像，结果如图3所示。根据拍照图像结果，筛选出不同基因：
[0053]
(1)仅含有1条带的，为cc型；
[0054]
(2)含有2条细条带的，为tt型；
[0055]
(3)含有1条粗带1条细带的，为tc型。
[0056]
2.1.6 dna验证测序
[0057]
根据分型结果，将不同个体跑胶图片的不同结果进行分型整理，选取不同形态的个体重复进行pcr扩增后，送至上海生工生物工程技术服务有限公司进行双向测序验证，采用chromaspro软件对测序结果进行分析，验证snp位点，结果如图4所示，为本发明所涉及的分子标记。
[0058]
2.2 mstn基因c458t突变位点与q系白羽肉鸭的屠宰性状的关联分析
[0059]
2.1.1基因分型
[0060]
为确定q系白羽肉鸭mstn基因外显子1第458碱基(c458t)的c/t多态性与肉鸭重要表型性状关联性，以2.1.1中的400只q系白羽肉鸭为试验材料，在6周龄进行肉鸭屠宰测定活重、屠体重、胸肌重、腿肌重、腹脂重、半净膛重、全净膛重、屠宰率计算半净膛率、全净膛率、胸肌率、腿肌率、瘦肉率及腹脂率重要经济性状。
[0061]
采用2.1.5的基因分型方法，对400只q系白羽肉鸭，进行基因分型，结果如表1。
[0062]
表1不同表型个体基因型检测结果
[0063][0064]
卡方检验结果表明，试验鸭群基因型分布处于hardy
‑
weinberg平衡。
[0065]
2.1.2统计分析
[0066]
用spss20.0中one
‑
way anova分析三种基因型与屠宰性能之间的关联性，不同基因型与各性状间的关联分析结果见如表2所示：
[0067]
表2白羽肉鸭mstn基因型与屠宰性能关联分析
[0068]
[0069][0070]
注：右上标有不同小写字母表示差异显著(p<0.05)。
[0071]
表2中可以看出，在cc、ct、tt三种基因型肉鸭中，tt型在活重、屠体重、半净膛重及全净膛重上显著高于cc型(p＜0.05)肉鸭，各基因型间在其他指标上差异不显著(p＞0.05)。综上可得出结论，tt型个体屠体性状较好。
[0072]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。