CRISPR相关转座酶系统和其使用方法与流程

技术特征：
1.一种用于插入供体多核苷酸的工程化核酸靶向系统，所述系统包含：a.一种或多种crispr相关转座酶蛋白或其功能片段；b.cas蛋白；和c.能够与所述cas蛋白复合并引导指导物
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cas蛋白复合物与靶多核苷酸的靶序列的序列特异性结合的指导分子。2.如权利要求1所述的系统，其中所述一种或多种crispr相关转座酶蛋白包含i)tnsb和tnsc，或ii)tnia和tnib。3.如权利要求1所述的系统，其中所述一种或多种crispr相关转座酶蛋白包含：a.tnsa、tnsb、tnsc和tniq，b.tnsa、tnsb和tnsc，c.tnsb、tnsc和tniq，d.tnsa、tnsb和tniq，e.tnse，f.tnia、tnib和tniq，g.tnsb、tnsc和tnsd，或h.它们的任何组合。4.如权利要求1所述的系统，其中所述一种或多种crispr相关转座酶蛋白包含tnsb、tnsc和tniq。5.如权利要求4所述的系统，其中所述tnsb、tnsc和tniq由表26或表27中的多核苷酸编码，或者是表28或表29中的蛋白质。6.如权利要求3所述的系统，其中所述tnse不与dna结合。7.如权利要求1所述的系统，其中所述一种或多种crispr相关转座酶蛋白是一种或多种tn5转座酶。8.如权利要求1所述的系统，其中所述一种或多种crispr相关转座酶蛋白是一种或多种tn7转座酶或tn7样转座酶。9.如权利要求1所述的系统，其中所述一种或多种crispr相关转座酶蛋白包含tnpa。10.如权利要求1所述的系统，其中所述一种或多种crispr相关转座酶蛋白包含tnpai
s608
。11.如权利要求1所述的系统，所述系统还包含用于插入所述靶多核苷酸中的供体多核苷酸。12.如权利要求11所述的系统，其中所述供体多核苷酸将被插入在所述靶多核苷酸中pam序列下游40至100个碱基之间的位置。13.如权利要求11所述的系统，其中所述供体多核苷酸的侧翼是右端序列元件和左端序列元件。14.如权利要求11所述的系统，其中所述供体多核苷酸：a.向所述靶多核苷酸引入一个或多个突变，b.在所述靶多核苷酸中引入或校正提前终止密码子，c.破坏剪接位点，d.恢复或引入剪接位点，
e.在靶多核苷酸的一个或两个等位基因处插入基因或基因片段，或f.它们的组合。15.如权利要求14所述的系统，其中由所述供体多核苷酸引入的所述一个或多个突变包括取代、缺失、插入或它们的组合。16.如权利要求15所述的系统，其中所述一个或多个突变导致所述靶多核苷酸上的开放阅读框的移位。17.如权利要求15所述的系统，其中所述供体多核苷酸长度在100个碱基和30kb之间。18.如权利要求1所述的系统，其中所述系统还包含反式激活crispr(tracr)序列。19.如权利要求1所述的系统，其中所述cas蛋白是v型cas蛋白。20.如权利要求19所述的系统，其中所述v型cas蛋白是v
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k型cas蛋白。21.如权利要求1所述的系统，其中所述cas蛋白是cas12。22.如权利要求21所述的系统，其中所述cas12是cas12a或cas12b。23.如权利要求21所述的系统，其中所述cas 12是cas12k。24.如权利要求23所述的系统，其中所述cas12k由表26或表27中的多核苷酸编码，或者是表28或表29中的蛋白质。25.如权利要求23所述的系统，其中所述cas12k属于图2a和图2b或表26的生物体。26.如权利要求1所述的系统，其中所述cas蛋白包含激活突变。27.如权利要求1所述的系统，其中所述cas蛋白是i型cas蛋白。28.如权利要求27所述的系统，其中所述i型cas蛋白包括cas5f、cas6f、cas7f和cas8f。29.如权利要求27所述的系统，其中所述i型cas蛋白包括cas8f
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cas5f、cas6f和cas7f。30.如权利要求27所述的系统，其中所述i型cas蛋白是i
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f型cas蛋白。31.如权利要求1所述的系统，其中所述cas蛋白是ii型cas蛋白。32.如权利要求31所述的系统，其中与野生型对应物相比，所述ii型cas蛋白是突变的cas蛋白。33.如权利要求32所述的系统，其中所述突变的cas蛋白是突变的cas9。34.如权利要求33所述的系统，其中所述突变的cas9是cas9
d10a
。35.如权利要求1所述的系统，其中所述cas蛋白缺乏核酸酶活性。36.如权利要求1所述的系统，所述系统还包含供体多核苷酸。37.如权利要求1所述的系统，其中所述crispr
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cas系统包含dna结合结构域。38.如权利要求37所述的系统，其中所述dna结合结构域是死cas蛋白。39.如权利要求38所述的系统，其中所述死cas蛋白是dcas9、dcas12a或dcas12b。40.如权利要求1所述的系统，其中所述dna结合结构域是rna指导的dna结合结构域。41.如权利要求1所述的系统，其中所述靶核酸具有pam。42.如权利要求41所述的系统，其中所述pam在所述靶标的5'侧并且包含tttn或attn。43.如权利要求41所述的系统，其中所述pam包含ngtn、rgtr、vgtd或vgtr。44.如权利要求1所述的系统，其中所述指导分子是由表26中的多核苷酸编码的rna分子。45.一种工程化系统，所述工程化系统包含一种或多种编码权利要求1
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44中任一项所述的组分(a)、(b)和/或(c)的多核苷酸。
46.如权利要求45所述的系统，其中一种或多种多核苷酸可操作地连接到一种或多种调控序列。47.如权利要求45所述的系统，所述系统包含转座子的一种或多种组分。48.如权利要求45所述的系统，其中所述蛋白质和核酸组分中的一者或多者由载体包含。49.如权利要求45所述的系统，其中所述一种或多种转座酶包含tnsb、tnsc和tniq，并且所述cas蛋白是cas12k。50.如权利要求45所述的系统，其中所述一种或多种多核苷酸选自表26中的多核苷酸。51.一种载体，所述载体包含一种或多种编码权利要求1
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50中任一项所述的组分(a)、(b)和/或(c)的多核苷酸。52.一种细胞或其后代，所述细胞或其后代包含权利要求51所述的载体。53.一种细胞，所述细胞包含权利要求52所述的系统，或其后代，所述后代包含由所述系统进行的一个或多个插入。54.如权利要求52或53所述的细胞，其中所述细胞是原核细胞。55.如权利要求52或53所述的细胞，其中所述细胞是真核细胞。56.如权利要求52或53所述的细胞，其中所述细胞是哺乳动物细胞、非人灵长类动物细胞或人类细胞。57.如权利要求52或53所述的细胞，其中所述细胞是植物细胞。58.一种生物体或其群体，所述生物体或其群体包含权利要求52或53所述的细胞。59.一种将供体多核苷酸插入细胞中的靶多核苷酸中的方法，所述方法包括向所述细胞中引入：a.一种或多种crispr相关转座酶或其功能片段，b.cas蛋白，c.能够与靶多核苷酸上的靶序列结合并被设计成与所述cas蛋白形成crispr
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cas复合物的指导分子，和d.供体多核苷酸，其中所述crispr
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cas复合物将所述一种或多种crispr相关转座酶引导至所述靶序列，并且所述一种或多种crispr相关转座酶将所述供体多核苷酸插入所述靶序列处或附近的所述靶多核苷酸中。60.如权利要求59所述的方法，其中所述供体多核苷酸将被插入到所述靶多核苷酸中pam序列下游40至100个碱基之间的位置。61.如权利要求59所述的方法，其中所述供体多核苷酸：a.向所述靶多核苷酸引入一个或多个突变，b.在所述靶多核苷酸中校正或引入提前终止密码子，c.破坏剪接位点，d.恢复或引入剪接位点，e.在靶多核苷酸的一个或两个等位基因处插入基因或基因片段，或f.它们的组合。62.如权利要求61所述的方法，其中由所述供体多核苷酸引入的所述一个或多个突变
包括取代、缺失、插入或它们的组合。63.如权利要求61所述的方法，其中所述一个或多个突变导致所述靶多核苷酸上的开放阅读框的移位。64.如权利要求59所述的方法，其中所述供体多核苷酸长度在100个碱基和30kb之间。65.如权利要求59所述的方法，其中组分(a)、(b)和(c)中的一者或多者由与在所述细胞中表达的调控序列可操作地连接的核酸表达。66.如权利要求59所述的方法，其中将组分(a)、(b)和(c)中的一者或多者引入粒子中。67.如权利要求59所述的方法，其中所述粒子包含核糖核蛋白(rnp)。68.如权利要求59所述的方法，其中所述细胞是原核细胞。69.如权利要求59所述的方法，其中所述细胞是真核细胞。70.如权利要求59所述的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞、非人灵长类动物细胞或人类细胞。71.如权利要求59所述的方法，其中所述细胞是植物细胞。72.一种用于将多核苷酸插入靶核酸中的工程化核酸靶向系统，所述系统包含a)工程化的c2c5蛋白或其片段，其被设计成与tnsbc形成复合物并连接到可编程dna结合结构域，b)被设计成与所述可编程dna结合结构域形成复合物并将所述复合物靶向所述靶核酸的指导物，c)i)tnsa、tnsb和tniq，或ii)tnsb和tnsc，以及d)包含待插入的核酸的多核苷酸，其侧翼是右端序列元件和左端序列元件。73.一种用于将多核苷酸插入靶核酸中的工程化核酸靶向系统，所述系统包含a)cas5678f复合物的组分，其被设计成与tnsabc
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tniq结合或与连接到可编程dna结合结构域的tnsabc结合，b)被设计成与所述可编程dna结合结构域形成复合物并将所述复合物靶向所述靶核酸的指导物，c)i)tnsa、tnsb、tnsc和tniq，或ii)tnsa、tnsb和tnsc，以及d)包含待插入的核酸的多核苷酸，其侧翼是右端序列元件和左端序列元件。74.一种将多核苷酸插入细胞中的靶核酸中的方法，所述方法包括向所述细胞中引入a)工程化的tnse蛋白或其片段，其被设计成与tnsabc或tnsbc形成复合物并连接到可编程dna结合结构域，b)被设计成与所述可编程dna结合结构域形成复合物并将所述复合物靶向所述靶核酸的指导物，c)i)tnsa、tnsb和tnsc，或ii)tnsb和tnsc，以及d)包含待插入的核酸的多核苷酸，其侧翼是右端序列元件和左端序列元件，其中所述指导物引导所述靶核酸的切割，由此插入所述多核苷酸。75.一种将多核苷酸插入细胞中的靶核酸中的方法，所述方法包括向所述细胞中引入
a)工程化的c2c5蛋白或其片段，其被设计成与tnsbc形成复合物并连接到可编程dna结合结构域，b)被设计成与所述可编程dna结合结构域形成复合物并将所述复合物靶向所述靶核酸的指导物，c)i)tnsa、tnsb和tniq，或ii)tnsb和tnsc，以及d)包含待插入的核酸的多核苷酸，其侧翼是右端序列元件和左端序列元件，其中所述指导物引导所述靶核酸的切割，由此插入所述多核苷酸。76.一种将多核苷酸插入细胞中的靶核酸中的方法，所述方法包括向所述细胞中引入a)cas5678f复合物的组分，其被设计成与tnsabc
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tniq结合或与连接到可编程dna结合结构域的tnsabc结合，b)被设计成与所述可编程dna结合结构域形成复合物并将所述复合物靶向所述靶核酸的指导物，c)i)tnsa、tnsb、tnsc和tniq，或ii)tnsa、tnsb和tnsc，以及d)包含待插入的核酸的多核苷酸，其侧翼是右端序列元件和左端序列元件。77.一种用于将多核苷酸插入靶核酸中的工程化核酸靶向系统，所述系统包含a)工程化的c2c5蛋白或其片段，其被设计成与tnsbc形成复合物并连接到可编程dna结合结构域，b)被设计成与所述可编程dna结合结构域形成复合物并将所述复合物靶向所述靶核酸的指导物，c)i)tnia、tnib和tniq，或ii)tnsb和tnsc，和tnsd，以及d)包含待插入的核酸的多核苷酸，其侧翼是右端序列元件和左端序列元件。78.一种将多核苷酸插入细胞中的靶核酸中的方法，所述方法包括向所述细胞中引入a)cas5678f复合物的组分，其被设计成与tnsabc
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tniq结合或与连接到可编程dna结合结构域的tnsabc结合，b)被设计成与所述可编程dna结合结构域形成复合物并将所述复合物靶向所述靶核酸的指导物，c)i)tnia、tnib和tniq，或ii)tnsb和tnsc，和tnsd，以及d)包含待插入的核酸的多核苷酸，其侧翼是右端序列元件和左端序列元件。

技术总结
本申请提供用于靶向基因修饰、靶向插入、基因转录物的扰动、核酸编辑的系统、方法和组合物。新型核酸靶向系统包含成簇规则间隔短回文重复序列(CRISPR)系统和可转座元件的组分。文重复序列(CRISPR)系统和可转座元件的组分。文重复序列(CRISPR)系统和可转座元件的组分。


技术研发人员：F
受保护的技术使用者：麻省理工学院
技术研发日：2019.12.17
技术公布日：2021/10/22