一种无菌菠萝外植体制备方法及其农杆菌转化方法与流程

1.本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种无菌菠萝外植体制备方法及其农杆菌转化方法。


背景技术：

2.菠萝(ananas comosus)，是热带和亚热带第三重要的水果作物，仅次于香蕉和柑橘。菠萝原产于南美洲巴西、巴拉圭的亚马逊河流域一带，16世纪从巴西传入中国。现在已经流传到整个热带地区。菠萝作为鲜食，甜酸适口，清脆多汁。菠萝除鲜食外，多用以制罐头，因其能保持原来风味而受到广泛喜爱。加工制品菠萝罐头被誉为“国际性果品罐头”，还可制成多种加工制品，广受大众欢迎。叶的纤维较为坚韧，可供用于织物、制绳、结网和造纸。
3.虽然通过自交不亲和单子叶植物物种杂交已经广泛的用于生产改良植物品种，但是高水平基因组杂合性与基因组不稳定性，导致用这种方法改良植物品种是很难的。通过转基因技术进行改良植物品种对解决各种农业、农艺问题有着巨大的潜力。转基因抗除草剂菠萝、解决早熟开花转基因菠萝等菠萝转化的成功，证明通过植物基因工程技术是可行而且高效的，因此找到一种稳定高效的用于菠萝转基因的方法，对菠萝新品种开发和基因功能的研究有非常重要的意义。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种实施可靠、制备便利的无菌菠萝外植体制备方法以及简便、高效的农杆菌转化方法，
5.为了实现上述的技术目的，本发明所采用的技术方案为：
6.一种无菌菠萝外植体的制备方法，包括：将菠萝植株消毒后切块，并放在菠萝不定芽诱导培养基上进行不定芽的诱导，得到的不定芽继续培养成无菌菠萝植株，从无菌菠萝植株基部切下茎圆片，作为无菌菠萝外植体。
7.进一步的，所述菠萝植株为幼嫩的菠萝植株；将其冲洗干净后在无菌环境中对其进行消毒处理。
8.进一步的，所述菠萝植株的消毒处理步骤包括：先用75％的酒精消毒30秒，无菌水清洗3～5次，再用0.1％的hgcl2消毒6
‑
8min，无菌水清洗5次以上，每次清洗时间大于1min。
9.进一步的，经消毒处理后的菠萝植株用无菌滤纸吸干水分，并将消毒好的菠萝植株切成0.4～0.8cm的块状，放置在菠萝不定芽诱导培养基3b0.2n上，26℃温度条件下，光照培养20～30天，获得菠萝不定芽。
10.进一步的，将得到的不定芽转移至ms液体培养基培养基上，26℃温度条件下，光照继续培养20～30天，获得无菌菠萝幼株；将菠萝幼株继续转移至液体pm培养基上，26℃温度条件下，光照继续培养14天，获得无菌菠萝植株。
11.进一步的，在超净台中从基部开始横切2
‑
4mm厚度的茎圆片2
‑
3片，作为无菌菠萝
外植体。
12.进一步的，所述菠萝不定芽诱导培养基3b0.2n包括如下质量浓度的组分：
13.ms 4.43g/l，蔗糖30g/l，植物凝胶3g/l，6
‑
ba 3mg/l，naa 0.2mg/l；其ph为5.6
‑
5.8。
14.其中，菠萝愈伤组织诱导培养基3b0.2n的成分混合方案之一如下：将含有ms 4.43g/l、蔗糖30g/l、植物凝胶3g/l，ph 5.6
‑
5.8之间的混合液经高压灭菌后加入6
‑
ba 3mg/l，naa 0.2mg/l。
15.进一步的，液体培养基ms包括如下质量浓度的组分：
16.ms 4.43g/l，蔗糖30g/l，植物凝胶3g/l；其ph为5.6
‑
5.8。
17.液体pm培养基包括如下质量浓度的组分：
18.ms 4.43g/l，蔗糖30g/l，6
‑
ba 2mg/l；其ph为5.6
‑
5.8。
19.其中，液体pm培养基的成分混合方案之一如下：将含有ms 4.43g/l，蔗糖30g/l，ph 5.6
‑
5.8之间的混合液经高压灭菌后加入6
‑
ba 2mg/l。
20.作为一种实施整合，本方案无菌菠萝外植体的制备方法通过以下步骤实现：
21.1)建立菠萝无菌体系
22.①
选择幼嫩的菠萝植株，清水洗净后进行消毒处理；
23.②
超净工作台将菠萝苗放进已灭菌的组培瓶内，用75％的酒精浸泡30秒后迅速取出，用无菌水清洗3至5次；
24.③
0.1％的hgcl2消毒6
‑
8分钟迅速取出，无菌水至少清洗1分钟，反复清洗5次；
25.④
无菌吸水纸吸除菠萝上残留水分，用无菌的镊子和无菌刀片将无菌菠萝植株的茎切成0.4
‑
0.8cm的大小，放置在分化诱导培养基3b0.2n上，透气封口膜封口，26℃温度条件下，光照培养20
‑
30天即可得到大量不定芽。
26.2)菠萝茎圆片获得：
27.①
超净工作台用无菌镊子和无菌刀片将步骤1)获得的大量不定芽接种于ms培养基上，用透气封口膜密封；
28.②
26℃温度条件下，光照继续培养20
‑
30天，得到约8cm的无菌菠萝植株；
29.③
超净工作台，用无菌镊子和无菌刀片将获得无菌菠萝植株转移至装有3厘米高的液体pm培养基的无菌培养瓶内，26℃温度条件下，光照培养14天得到粗壮的无菌菠萝植株；
30.④
超净工作台，用无菌镊子和无菌刀片将得到的粗壮无菌菠萝植株基部的根切除，再从基部开始横切约3mm厚度的茎圆片2到3片，获得用于转化的茎圆片。
31.本发明进一步提供了上述制得的无菌菠萝外植体的农杆菌介导的菠萝转化方法，包括如下步骤：
32.a)侵染液制备：
33.①
将携带有筛选基因、标记基因载体的gv3101农杆菌，在超净工作台中划线并涂布在利福平50mg/l与卡那霉素50mg/l的lb固体培养基上，28℃培养箱培养2
‑
3天；
34.②
在超净工作台中用接菌环收集单克隆，进行农杆菌集菌，接种在新的利福平50mg/l与卡那霉素50mg/l的lb液体培养基中，28℃过夜培养；
35.③
将培养好的菌收集后在超净工作台中接入到1/2ms液体培养液中，搅拌至菌彻
底均匀悬浮在液体中；
36.④
用分光光度剂测量农杆菌侵染液od值，在600nm波长下，用1/2ms液体调节使其od值为0.6，根据所需菌液量加入乙酰丁香酮，控制其浓度为200μm，制得侵染液；
37.b)侵染：将步骤a)制得的侵染液28℃，150r/min培养半小时后在超净工作台内倒入透气培养皿内，迅速加入现切好的菠萝茎圆片作为外植体，搅拌均匀，盖上培养皿的盖子，放入真空干燥箱中进行73kpa抽真空5min处理，取出后在超净工作台中倒掉菌液，将茎圆片放在无菌滤纸上，风干30min，得到侵染过的茎圆片；
38.c)共培养：将步骤b)侵染过的茎圆片在超净工作台中摆放于铺有无菌滤纸的cm培养基上培养3
‑
5天；
39.d)诱导筛选培养：将步骤c)共培养的茎圆片置于ym培养基上，在26℃温度条件下光照培养20
‑
30天；
40.e)伸长：在步骤d)培养的茎圆片上筛选诱导新芽，用无菌镊子和刀片把枯萎褐变的部分切除，转接新芽到sm培养基上，26℃温度条件下，光照培养，待新芽长至5cm以上小苗进行pcr验证；
41.f)通过pcr验证，从植株中筛选出阳性幼苗；
42.g)炼苗：将步骤f)得到的阳性幼苗放入培养土中，在人工气候室里光照培养，待植株生长至预设状态后，转移至大棚。
43.进一步的，步骤a)中预培养培养基1/2ms包括如下质量浓度的组分：
44.ms 2.215g/l，蔗糖15g/l，其ph为5.6
‑
5.8；
45.步骤c)中cm培养基包括如下质量浓度的组分：
46.ms 4.43g/l，蔗糖30g/l，植物凝胶3g/l，as 200μm，葡萄糖4g/l，其ph为5.6
‑
5.8；
47.cm培养基的成分混合方案之一如下：将含有ms 4.43g/l，蔗糖30g/l，植物凝胶3g/l，ph 5.6
‑
5.8之间的混合液经高压灭菌后加入as 200μm，葡萄糖4g/l。
48.步骤d)中ym培养基包括如下质量浓度的组分：
49.ms 4.43g/l，蔗糖30g/l，植物凝胶3g/l，6
‑
ba 1mg/l，naa 0.1mg/l，潮霉素10mg/l，其ph为5.6
‑
5.8；
50.cm培养基的成分混合方案之一如下：将含ms 4.43g/l，蔗糖30g/l，植物凝胶3g/l，ph 5.6
‑
5.8之间的混合液经高压灭菌后加入6
‑
ba 1mg/l，naa 0.1mg/l，潮霉素10mg/l。
51.步骤e)中sm培养基包括如下质量浓度的组分：
52.ms 4.43g/l，蔗糖30g/l，植物凝胶3g/l，潮霉素10mg/l，其ph为5.6
‑
5.8。
53.sm培养基的成分混合方案之一如下：将含ms 4.43g/l，蔗糖30g/l，植物凝胶3g/l，ph 5.6
‑
5.8之间的混合液经高压灭菌后加入潮霉素10mg/l。
54.有益效果：
55.本发明所提供的无菌菠萝外植体制备方法及其农杆菌转化方法操作方便易行，染菌率极低，茎圆片诱导所需培养基配方简单易配置，使用普及，仅需一次少量消毒除菌即可反复得到无菌菠萝苗，获得量大，可通过筛选基因充分筛查非转基因植株，获得较多目的基因阳性植株，所述方法中培养基经多次实验，形成了固定配方、浓度以及ph值等，可即插即用，无需改变调试，简化了转基因操作流程，大大缩短了转基因时间，该方法在菠萝生物技术相关领域包括菠萝基因工程、细胞工程、代谢工程以及菠萝的分子育种等方面具有广泛
的应用价值。
附图说明
56.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
57.图1是本发明实施例中pm培养基培养14天的菠萝苗的图。
58.图2是本发明实施例中大量获得的无菌菠萝植株的图。
59.图3是本发明实施例中农杆菌介导的菠萝茎圆片转化过程简图。
60.图4是本发明实施例中获得的转基因菠萝阳性植株的图。
61.图5是本发明实施例中构建好的过表达重组载体pcambia1305.2
‑
xy13(myb24)的图。
62.图6是本发明实施例中标记基因片段扩增与过表达重组载体构建过程的图。
63.图7是本发明实施例中转基因抗性植株pcr鉴定结果图，其中1
‑
23为菠萝植株样品，24号为阳性对照(引物hyg扩增)。
64.图8是本发明实施例中转基因抗性植株pcr鉴定结果图，其中1
‑
23为菠萝植株样品，第一排为xy13
‑
vf1 xy13
‑
vr1引物扩增，第二排为xy13
‑
vf2 xy13
‑
vr2引物扩增。
65.图9是本发明实施例中菠萝转基因阳性植株gus染色验证结果图。
具体实施方式
66.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
67.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
68.下面以菠萝md2品种为例，进一步说明本发明所提供的无菌菠萝外植体制备方法及其农杆菌转化方法。
69.一种无菌菠萝外植体的制备方法，包括以下步骤：
70.1)建立菠萝无菌体系：
71.①
选择幼嫩的菠萝植株，使用清水清洗干净之后进行消毒处理；
72.②
在超净工作台内把菠萝苗放进已经灭菌的组培瓶内，用75％的酒精浸泡30秒后迅速取出，用无菌水清洗3至5次；
73.③
用0.1％的hgcl2消毒6
‑
8分钟迅速取出，用无菌水至少清洗1分钟，反复清洗5次；
74.④
用无菌吸水纸吸除菠萝上的水分，用无菌的镊子和无菌刀片将菠萝苗的茎切成0.4
‑
0.8cm的大小，放置在菠萝不定芽诱导培养基3b0.2n上，用透气封口膜封上，放在26℃温度条件下，光照培养20
‑
30天得到大量不定芽。
75.2)菠萝茎圆片获得：
76.①
在超净工作台内，用无菌镊子和无菌刀片将步骤1)获得的大量不定芽接种于ms培养基上，用透气封口膜密封；
77.②
放在26℃温度条件下，光照培养20
‑
30天得到约8cm的无菌菠萝植株；
78.③
在超净工作台内，用无菌镊子和无菌刀片将获得无菌菠萝植株转移至装有3厘米高的液体pm培养基的培养瓶内，放在26℃温度条件下，光照培养14天得到粗壮的无菌菠萝植株；
79.④
在超净工作台内，用无菌镊子和无菌刀片把得到粗壮的无菌菠萝植株基部的根切除，再从基部开始横切约3mm厚度的茎圆片2到3片，获得用于转化的茎圆片。
80.在本发明中，菠萝的品种包括md2，xs。在本发明中，菠萝优选采用md2品种。
81.在步骤1)中诱导培养基3b0.2n的组分为：ms 4.43g/l，蔗糖30g/l，植物凝胶3g/l，ph 5.6
‑
5.8之间的混合液经高压灭菌后加入6
‑
ba 3mg/l，naa 0.2mg/l。
82.在步骤2)液体培养基ms的组分为：ms 4.43g/l，蔗糖30g/l，植物凝胶3g/l，ph 5.6
‑
5.8之间；
83.液体pm培养基的组分为：ms 4.43g/l，蔗糖30g/l，ph 5.6
‑
5.8之间的混合液经高压灭菌后加入6
‑
ba 2mg/l。
84.基于上述的无菌菠萝外植体的制备方法，本实施例在其基础上，还进一步提供了一种标记基因载体的构建方法。
85.将需要转化的标记基因xy13(myb24)进行扩增，并进行载体构建，标记基因与载体构建得到的重组载体图谱如图5。
86.使用的植物表达载体名称为载体pcambia1305.2，载体带有抗性基因hyg，载体上的报告基因为gus，载体pcambia1305.2中所用启动子为xy13(myb24)基因自身启动子，其大小为3416bp，该标记基因的全基因组大小为5254bp，该标记基因可以与gus基因进行融合表达，此启动子的功能是启动所转入的xy13(myb24)基因序列，进而启动gus基因的表达，便于观察该标记基因在菠萝转化植株的表达情况，进而确定菠萝中农杆菌介导的转化方法的可行性和有效性。
87.设计引物，pcr扩增包括xy13(myb24)启动子和全长基因的片段，大小为8.7kb，其引物名称和序列如下：
[0088][0089]
pcr扩增得到一条约8kb的目的条带，与myb24的基因组大小相符(如图6a)。将目的带回收纯化后，用用内切酶bamh i和sal i分别对表达载体pcambia1305.2和目的条带进行酶切(如图6b)。将线性化的载体和双酶切后的标记基因用t4连接酶连接。连接产物转化大肠杆菌，菌落pcr验证结果正确(如图6c)。同时将pcr阳性的菌落送到公司测序，比对测序结果显示重组载体pcambia1305.2
–
xy13(myb24)构建成功。
[0090]
将构建成功的重组载体转化到农杆菌中，筛选阳性克隆进行摇菌并保存菌液用于转化。转化的农杆菌使用lb液体培养基进行摇菌，其中卡那霉素的终浓度为50mg/l、利福平的终浓度为50mg/l。将菌液于50ml离心管中18℃，3500rpm条件下离心10min，加入1/2ms重
悬液(液体ms培养基，配方：1/2ms即2.215g/l，蔗糖30g/l，ph 5.8左右，高压灭菌后放至常温)重悬，使其最终od600值在0.5
‑
0.8左右即可进行侵染。本发明实施例中使用的农杆菌有gv3101、lba4404、eha105三种菌株。
[0091]
基于上述所述无菌菠萝外植体的制备方法，及农杆菌侵染方案，本实施例还提供基于上述方案的无菌菠萝外植体的农杆菌介导的菠萝转化方法，其包括如下步骤：
[0092]
a)侵染液制备：
[0093]
①
将保存与
‑
80℃的携带有筛选基因、标记基因载体的gv3101农杆菌在超净工作台中划线涂布在利福平50mg/l与卡那霉素50mg/l的lb固体培养基上，在28℃黑暗培养2
‑
3天；
[0094]
②
在在超净工作台中用接菌环收集单克隆农杆菌集合成菌球，新的利福平50mg/l与卡那霉素50mg/l的lb液体培养基中，在28℃过夜黑暗培养；
[0095]
③
将培养好的菌收集后在超净工作台中接入到1/2ms液体培养液中，用接菌环搅拌至菌彻底均匀悬浮在液体中；
[0096]
④
用分光光度剂测量农杆菌侵染液od值，并用1/2ms液体调节od值在600nm下为0.6，根据所需菌液量加入乙酰丁香酮，控制其浓度为200μm,将制备好的侵染液封口。
[0097]
b)侵染：将a)制备好的侵染液，在28℃摇床150r/min培养半小时后用于转化，在超净工作台内倒入透气培养皿内，迅速加入权利要求1～8所述制备方法当天新切的菠萝茎圆片，搅拌均匀，盖上培养皿的盖子，放入真空干燥箱中进行73kpa抽真空5min处理，取出后在超净工作台中倒掉菌液，将茎圆片放在无菌滤纸上，风干30min。
[0098]
c)共培养：将步骤b)侵染过的茎圆片在超净工作台中不堆叠的置于铺有无菌滤纸cm培养基上共3
‑
5天。
[0099]
d)诱导筛选培养：将步骤c)共培养的茎圆片置于ym培养基上，每个培养皿约15片，放在26℃温度条件下，光照培养20
‑
30天。
[0100]
e)伸长：挑选步骤d)培养的茎圆片上诱导筛选新的不定芽，用无菌镊子和无菌刀片把枯萎褐变的部分切除，转接新的不定芽到sm培养基上，26℃温度条件下，光照培养，待新芽长至5cm以上小苗可进行pcr验证。
[0101]
f)通过pcr验证，从植株中筛选出阳性幼苗；
[0102]
g)炼苗：将步骤f)得到的阳性植株放入培养土中，于人工气候室里光照培养。待植株生长的健壮，即可转移至大棚。
[0103]
7、转基因菠萝验证
[0104]
(1)引物设计
[0105]
设计的引物序列如下：
[0106]
[0107][0108]
(2)转基因菠萝阳性植株验证
[0109]
本发明实施例所获得的转基因菠萝阳性植株使用3对引物进行验证。首先使用潮霉素基因验证(验证结果如图7)，得到有潮霉素基因的植株；然后用两对目的基因引物扩增目的基因(验证结果如图8)。通过pcr验证，21,22号苗为转基因阳性苗。
[0110]
(3)转基因菠萝阳性苗gus染色验证
[0111]
通过载体上的报告基因进行gus染色，结果显示21,22号阳性苗的叶片均能染色(如图9)
[0112]
(4)转基因菠萝植株种植
[0113]
将得到的阳性幼苗从组培瓶中取出，用无菌水洗净，种植在营养土中，于气候室中26℃光照培养。待苗生长的健壮，即可转移至温室大棚。
[0114]
步骤a)中预培养培养基1/2ms的组分为：ms 2.215g/l，蔗糖15g/l，ph 5.6
‑
5.8之间。
[0115]
步骤c)中cm培养基的组分为：ms 4.43g/l，蔗糖30g/l，植物凝胶3g/l，ph 5.6
‑
5.8之间的混合液经高压灭菌后加入as 200μm，葡萄糖4g/l，
[0116]
步骤d)中ym培养基的组分为：ms 4.43g/l，蔗糖30g/l，植物凝胶3g/l，ph 5.6
‑
5.8之间的混合液经高压灭菌后加入6
‑
ba 1mg/l，naa 0.1mg/l，潮霉素10mg/l。
[0117]
步骤e)中sm培养基的组分为：ms 4.43g/l，蔗糖30g/l，植物凝胶3g/l，ph 5.6
‑
5.8之间的混合液经高压灭菌后加潮霉素10mg/l。
[0118]
以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。