针对新冠病毒SARS-CoV-2棘突蛋白的靶向识别肽和应用的制作方法

针对新冠病毒sars
‑
cov
‑
2棘突蛋白的靶向识别肽和应用
技术领域
1.本发明涉及生物工程技术领域，具体说是针对新冠病毒sars
‑
cov
‑
2棘突蛋白的靶向识别肽和应用。


背景技术：

2.新冠病毒sars
‑
cov
‑
2属于套式病毒目冠状病毒科冠状病毒属，是目前人类已知的rna病毒中基因组最长的病毒，长度为27～32kb，其含有至少4个主要结构蛋白：棘突蛋白(s蛋白)、膜蛋白(m蛋白)、包膜蛋白(e蛋白)和核衣壳蛋白(n蛋白)。s蛋白是一种i型融合蛋白，在病毒颗粒表面形成三聚体，由s1和s2两个亚基组成，其中s1负责受体结合，s2负责膜融合。受体结合区(rbd)位于s1亚基上，结合人类sars
‑
cov受体血管紧张素转化酶ii(ace2)分子，而s2则含有膜融合过程所需要的基本元件，实现病毒与细胞的融合，即sars
‑
cov
‑
2利用血管紧张素转换酶2(ace2)作为受体进入靶细胞，因此，s蛋白决定了这种病毒的感染性及其在宿主中的传播性，研究与s蛋白结合的靶向识别肽对降低新冠病毒的感染性和传播性具有重要意义。
3.目前治疗新冠肺炎并没有有效的药物，采用常规抗生素药物治疗时效果并不明显，有些还存在严重的毒副作用。另一方面，抗体药物与新型阻断剂在传染病、自身免疫疾病及肿瘤等的治疗上发挥了重要作用，针对性更强，因此开发针对新冠病毒sars
‑
cov
‑
2的新型阻断剂具有非常重要的意义。


技术实现要素：

4.为解决上述问题，本发明的目的是提供针对新冠病毒sars
‑
cov
‑
2棘突蛋白的靶向识别肽和应用。
5.本发明为实现上述目的，通过以下技术方案实现：
6.针对新冠病毒sars
‑
cov
‑
2棘突蛋白的靶向识别肽，与新冠病毒sars
‑
cov
‑
2棘突糖蛋白特异性结合，阻断sars
‑
cov
‑
2棘突糖蛋白与血管紧张素转化酶2受体的结合，达到阻断病毒感染与传播的作用。
7.优选的，所述靶向识别肽为y3的突变体n122q，以下统一简写为y3(n122q)，其氨基酸序列为seq id no：3。
8.优选的，所述靶向识别肽为y3的突变体d26e，以下统一简写为y3(d26e)，其氨基酸序列为seq id no：2。
9.优选的，所述靶向识别肽为野生型y3，以下统一简写为y3(wt)，其氨基酸序列为seq id no：1。
10.本发明还包括靶向识别肽为y3的突变体n122q、y3的突变体d26e和野生型y3wt在制备新冠病毒sars
‑
cov
‑
2检测产品中的应用。
11.本发明还包括靶向识别肽为y3的突变体n122q、y3的突变体d26e和野生型y3wt在制备抑制新冠病毒sars
‑
cov
‑
2药物中的应用。
12.本发明还包括靶向识别肽为y3的突变体n122q、y3的突变体d26e和野生型y3wt在制备预防或治疗新冠病毒sars
‑
cov
‑
2引起的肺炎的抗体药物中的应用。
13.本发明相比现有技术具有以下优点：
14.本发明的靶向识别肽及其突变型结构，能与新冠病毒sars
‑
cov
‑
2的棘突糖蛋白(s蛋白)特异性结合，阻断新冠病毒的感染与传播；效价高、特异性强，能够高效表达，用于新冠病毒的定性或定量检测，并且能够中和并减弱一定的新冠病毒毒性，起到预防或/和治疗新冠病毒肺炎的目的。
附图说明
15.图1为靶向识别肽y3(n122q)、y3(d26e)、y3(wt)和新冠病毒s蛋白的input数据示意图；
16.图2为靶向识别肽y3(wt)，y3(d26e)，y3(n122q)与新冠病毒sars
‑
cov
‑
2棘突蛋白的特异性结合的western blot结果图；
17.图3为y3(wt)，y3(d26e)，y3(n122q)靶向识别肽与表达新冠病毒sars
‑
cov
‑
2棘突蛋白的293ft细胞特异性结合的流式结果图；
18.图4为sars
‑
cov
‑
2假病毒滴度曲线图；
19.图5为靶向识别肽y3(wt)，y3(d26e)，y3(n122q)与假病毒中和曲线图。
具体实施方式
20.本发明的目的是提供针对新冠病毒sars
‑
cov
‑
2棘突蛋白的靶向识别肽及其制备方法和应用，通过以下技术方案实现：
21.针对新冠病毒sars
‑
cov
‑
2棘突蛋白的靶向识别肽，与新冠病毒sars
‑
cov
‑
2棘突糖蛋白特异性结合，阻断sars
‑
cov
‑
2棘突糖蛋白与血管紧张素转化酶2受体的结合，达到阻断病毒感染与传播的作用。
22.优选的，所述靶向识别肽为y3的突变体n122q，以下统一简写为y3(n122q)，其氨基酸序列为seq id no：3。
23.优选的，所述靶向识别肽为y3的突变体d26e，以下统一简写为y3(d26e)，其氨基酸序列为seq id no：2。
24.优选的，所述靶向识别肽为野生型y3，以下统一简写为y3(wt)，其氨基酸序列为seq id no：1。
25.本发明的靶向识别肽与新冠病毒s蛋白结合后可以阻断病毒感染与转播的机理在于：
26.人体免疫系统包含多种聚糖结合蛋白，能够特异性地检测并结合各种聚糖表位，从而以依赖于聚糖的方式触发先天反应；ldnf是位于s蛋白上的聚糖基序，同时是y3靶点识别肽的特异性结合配体，ldnf/y3的相互作用可导致y3靶点识别肽可s蛋白特异性结合，从而阻断sars
‑
cov
‑
2棘突糖蛋白与血管紧张素转换酶2(ace2)受体的结合，达到阻断阻断病毒感染与传播的作用。
27.本发明还包括靶向识别肽为y3的突变体n122q、y3的突变体d26e和野生型y3wt在制备新冠病毒sars
‑
cov
‑
2检测产品中的应用。
28.本发明还包括靶向识别肽为y3的突变体n122q、y3的突变体d26e和野生型y3wt在制备抑制新冠病毒sars
‑
cov
‑
2药物中的应用。
29.本发明还包括靶向识别肽为y3的突变体n122q、y3的突变体d26e和野生型y3wt在制备预防或治疗新冠病毒sars
‑
cov
‑
2引起的肺炎的抗体药物中的应用。
30.以下结合具体实施例来对本发明作进一步的描述。
31.实施例1
32.针对新冠病毒sars
‑
cov
‑
2棘突蛋白的靶向识别肽，该靶向识别肽与新冠病毒sars
‑
cov
‑
2棘突糖蛋白特异性结合，从而阻断sars
‑
cov
‑
2棘突糖蛋白与血管紧张素转换酶2(ace2)受体的结合，达到阻断病毒感染与传播的作用，其中靶向识别肽的氨基酸序列为seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3；
33.氨基酸序列为seq id no：1的靶向识别肽命名为y3(wt)，氨基酸序列为seq id no：2的靶向识别肽命名为y3(d26e)，氨基酸序列为seq id no：3的靶向识别肽命名为y3(n122q)。
34.实施例2
35.线性ppic
‑
y3(wt)重组质粒按照文献peilan zhanga，，et al，cytotoxic protein from the mushroom coprinus comatus possesses a unique mode for glycan binding and specificity，pnas early edition，得到；
36.ppic
‑
y3(d26e)重组质粒和ppic
‑
y3(n122q)重组质粒参照上述文献制备，只要将d26e和n122q的基因替换wt的即可。
37.pcdna3.4
‑
s
‑
gcn4质粒、pcdna3.1.vsvg质粒和pcdna3.1.s2质粒为上海高等研究院惠赠，也可根据文章“jianhui nie et al，quantification of sars
‑
cov
‑
2 neutralizing antibody by a pseudotyped virus
‑
based assay，nature protocols，vol 15，november 2020，3699
‑
3715，www.nature.com/nprot”自制；
38.一、实施例1的三种针对新冠病毒sars
‑
cov
‑
2棘突蛋白的靶向识别肽的制备
39.合成编码全长y3的野生型和突变型密码子优化基因(eurofins genomics，美国)，并将其基因克隆到ppic
‑
zaa质粒(美国，invitrogen公司)上，将质粒转化到巴斯德毕赤酵母x
‑
33中；ypd培养基用来扩大培养，用含0.5％甲醇的bmmh溶液蛋白表达，最后将蛋白表达上清进行纯化，得到野生型和突变型y3蛋白。
40.1.y3蛋白的制备：
41.1.1将包含基因的质粒转入感受态x
‑
33细胞
42.1.1.1感受态x
‑
33的制备
43.(1)在50ml离心管中加入10mlypd培养基，接种x
‑
33酵母菌种，30℃，300rpm振荡过夜；
44.(2)室温离心500g，5min，弃上清，用10ml新鲜ypd培养基重悬x
‑
33酵母，30℃，300rpm振荡4
‑
6h，使od值达到0.6
‑
1.0；
45.(3)室温离心500g，5min，弃上清；
46.(4)用10ml easycomp transformation kit中试剂1重悬细胞；
47.(5)室温离心500g，5min，弃上清；
48.(6)用1ml试剂1重悬细胞，得到感受态x
‑
33细胞；
49.1.1.2将ppic
‑
y3(wt)，ppic
‑
y3(d26e)ppic
‑
y3(n122q)质粒转入感受态x
‑
33细胞
50.(1)各取50ul感受态x
‑
33细胞置于冰上融化；
51.(2)向感受态细胞中各加入3ug线性ppic
‑
y3(wt)，ppic
‑
y3(d26e)，ppic
‑
y3(n122q)重组质粒；
52.(3)再加入1ml easycomp transformation kit中试剂2，震荡混匀；
53.(4)将混合物置于37度水浴1小时，每15min震荡混匀一次；
54.(5)42度水浴10min；
55.(6)将细胞平均分至两个离心管中，并将1ml ypd培养基加入其中；
56.(7)30度孵育1h以恢复zeocin活性；
57.(8)3000g室温离心5min，弃上清；
58.(9)每管用500ul easycomp transformation kit中试剂1重悬细胞，并将两管细胞合至一管中；
59.(10)3000g室温离心5min，弃上清；
60.(11)用100～150ul easycomp transformation kit中试剂1重悬细胞；
61.(12)将细胞抹匀在含100mg/ml zeocin的ypd板上，倒置，30度培养3～5天；
62.1.1.3菌落pcr验证ppic
‑
y3(wt)，ppic
‑
y3(d26e)ppic
‑
y3(n122q)质粒转入
63.(1)10％sds配置：称取1gsds(十二烷基硫酸钠)加入10ml ddh2o中，混匀，使其完全溶解；
64.(2)0.2％sds：取20ul 10％sds溶液加980ul水，配成1ml0.2％的sds液；
65.每种质粒各挑取几个菌落，分别至装有100ul 0.2％sds的ep管中，混匀，100℃煮沸5min，然后置于冰上，涡旋震匀；
66.(3)pcr反应体系50ul
[0067][0068]
反应条件：94℃4分钟，94℃30秒，54℃30秒，72℃1分钟，72℃5分钟，30循环。
[0069]
其中引物为：
[0070]
上游引物y3(wt)
‑
f：atgcccccagggccgtgcgcctg；
[0071]
下游引物y3(wt)
‑
r：tcaggccttggcagagccctctgc；
[0072]
上游引物y3(d26e)
‑
f：tgctatgccaactttgggaatcgtgatgttgcagca；
[0073]
下游引物y3(d26e)
‑
r：tgctgcaacatcacgattcccaaagttggcatagca；
[0074]
上游引物y3(n122q)
‑
f：gatccggctgatggagactgttccactgatttttaa；
[0075]
下游引物y3(n122q)
‑
r：taaaaatcagtggaacagtctccatcagccggatc；
[0076]
1.2重组y3(wt)，y3(d26e)，y3(n122q)的表达与确认
[0077]
1.2.1挑取单克隆，在10mlypd培养基中摇18h，然后换至500mlypd培养基中摇48h扩大培养；
[0078]
1.2.2 3000g室温离心15min，用200ml含0.5％甲醇的bmmh培养基(有组氨酸的缓冲性基础甲醇培养基)重悬细胞，促进蛋白的表达；
[0079]
1.2.3每24h加入0.5％甲醇，每24h取样，摇菌6d结束。
[0080]
1.3 y3(wt)，y3(d26e)，y3(n122q)蛋白纯化
[0081]
(1)重组y3(wt)，y3(d26e)，y3(n122q)用60％饱和硫酸铵沉淀；
[0082]
(2)沉淀的蛋白用溶液a(25mmol/l hepes，ph 7.9，10％甘油，0.1mol/l kcl，0.2mmol/l edta，and 0.5mmol/l dtt)复溶；
[0083]
(3)在溶液a中透析48h；
[0084]
(4)透析后的蛋白液上至伴刀豆球蛋白a琼脂糖凝胶(con a berpharose)(亲和层析柱介质bersee博尔西)；
[0085]
(5)洗脱：凝胶柱用含1.5mol/l kcl的溶液a洗脱；
[0086]
(6)洗脱得到的蛋白低温冻干后，放于
‑
80℃，备用。
[0087]
(7)使用bca蛋白定量法进行重组y3(wt)，y3(d26e)，y3(n122q)蛋白的定量。
[0088]
二、s蛋白和y3蛋白的结合试验
[0089]
2.1 sars
‑
cov
‑
2 s蛋白的合成
[0090]
①
将20ug pcdna3.4
‑
s
‑
gcn4质粒(上海高等研究院惠赠)使用lipo3000试剂盒转染293ft。
[0091]
10cm细胞培养皿293ft细胞使用以下试剂剂量进行转染：
[0092]
a液：optimem 1.5ml lipo3000 30ul
[0093]
b液：optimem 1.5ml p3000 30ul 20ug pcdna3.4
‑
s
‑
gcn4
[0094]
a液和b液混合，室温静置10min，将混合液均匀滴入293ft细胞中。
[0095]
②
转染后第二天的10cm细胞培养皿293ft细胞，去除上清，加入1ml ripa裂解液，将细胞和裂解液充分混合，加入9ml buffer 1充分混匀，即后续镍柱纯化的蛋白原液。
[0096]
溶液配制：
[0097]
buffer 1(washing buffer)配方
[0098]
20mm磷酸三钠
[0099]
500mm nacl
[0100]
20mm咪唑
[0101]
buffer 2(elution buffer)配方
[0102]
20mm磷酸三钠
[0103]
500mm nacl
[0104]
300mm咪唑
[0105]
③
镍柱纯化s蛋白
[0106]
结合：先用预冷的buffer 1以1ml/min的速度过镍柱(金斯瑞，high affinity ni
‑
nta resin)30min，再使用预冷的蛋白原液以1ml/min的速度过镍柱，后续继续用预冷的buffer 1以1ml/min的速度过镍柱30min起到冲洗非特异性蛋白结合的作用。
[0107]
洗脱：先用10％buffer(10％buffer 2和90％buffer 1)以1ml/min洗脱非特异性
结合蛋白15min，再使用预冷的buffer 2以1ml/min的速度过镍柱，其中丢弃前3ml流出液，保留后8ml流出液。
[0108]
④
s蛋白透析
[0109]
将纯化好的8ml s蛋白液装入透析袋，放在蛋白缓冲溶液中放于4度冰箱透析过夜；
[0110]
其中蛋白缓冲溶液(ph 7.4)的配制如下：
[0111]2×
100mm(50mm)pbs
[0112]2×
100mm(50mm)tris hcl
[0113]2×
100mm(50mm)hepes形成2
×
蛋白缓冲液，
[0114]
50％甘油，至1
×
蛋白缓冲液；
[0115]
⑤
使用bca蛋白定量法进行s蛋白的定量。
[0116]
sars
‑
cov
‑
2 s蛋白也可外购。
[0117]
2.2 s蛋白和y3蛋白的免疫共沉淀
[0118]
(1)将s蛋白和y3蛋白(y3(wt)，y3(d26e)，y3(n122q)各设一组)各100ug/ml的终浓度1∶1混合孵育4℃过夜；
[0119]
(2)将蛋白混合液中以1∶1000的比例加入anti
‑
flag antibody(dykddddk tag monoclonal antibody，invitrogen，ma1
‑
91878)；
[0120]
(3)使用pierce classic magnetic ip/co
‑
ip kit(赛默飞公司)试剂盒，取25ul protein a磁珠(invitrogen)至1.5mlep管中，加入175ul washing buffer涡旋，放到磁力架上，去除液体；
[0121]
(4)将已加入抗体的蛋白混合液加入到(3)中的1.5ml ep管中，使预处理好的磁珠和已加入抗体的蛋白混合液充分混合，室温孵育1h；
[0122]
(5)1.5mlep管放到磁力架上，吸出上清；
[0123]
(6)加入500ul washing buffer混匀，放至磁力架上，去掉上清；此步进行两次；
[0124]
(7)加入500ul双蒸水混匀，放至磁力架上，去掉上清，此步骤进行两次；
[0125]
(8)加入100ul sds
‑
page reducing buffer，和磁珠充分混合，在金属浴上加热样本96℃10min，把1.5ml ep管放至磁力架上，去除磁珠，留取上清；
[0126]
(9)western blot：
[0127]
使用sds
‑
page试剂盒(康为品牌)配置10％sds
‑
page胶，将从磁珠上洗脱下的蛋白依次上样，以100v的电压跑1.2h，然后将pvdf膜和胶放入转膜槽，4℃，恒流200ma，转膜时间为120分钟，5％脱脂牛奶封闭1h，再用sars
‑
cov
‑
2spike protein(rbd)monoclonal antibody(invitrogen)以1∶5000的浓度孵育一抗(4℃，过夜)；第二天，取出孵育完一抗的pvdf膜，用tbst溶液清洗三遍，加入相应种属的二抗hrp，室温震荡孵育1h，用tbst溶液清洗三遍pvdf膜；用ecl发光液在pvdf膜上，进行显影。
[0128]
如图1所示，y3蛋白((y3(wt)，y3(d26e)，y3(n122q))是以flag为标签，其分子量为12kd左右，sars
‑
cov
‑2‑
s蛋白分子量是180kd左右，input数据说明y3(wt)、y3(d26e)、y3(n122q)和sars
‑
cov
‑2‑
s蛋白已经被成功纯化出来。
[0129]
如图2所示，我们将y
‑
3和sars
‑
cov
‑2‑
s共孵育后，加入y
‑
3的抗体anti
‑
flag，利用免疫沉淀的方法将y
‑
3沉淀下来，但在我们后续的western blot中发现，也将沉淀下的蛋白
中包含sars
‑
cov
‑2‑
s(使用anti
‑
sasr
‑
cov2
‑
s做western blot有在180kd有条带)，说明y
‑
3和sars
‑
cov
‑2‑
s蛋白有结合；而将ig g作为sars
‑
cov
‑2‑
s蛋白的阴性对照，ig g和y
‑
3没有结合，也证明了y
‑
3和sars
‑
cov
‑2‑
s蛋白的结合是特异的。
[0130]
三、biotin标记的y3(wt)，y3(d26e)，y3(n122q)与表达sars
‑
cov
‑
2 s蛋白的293ft细胞结合
[0131]
3.1 biotin标记y3
[0132]
3.1.1将biotin溶于dmso中，终浓度为20mg/ml，避光；
[0133]
3.1.2将得到的y3(wt)，y3(d26e)，y3(n122q)溶解，加入10％体积的biotin，避光室温搅拌4h；
[0134]
3.1.3将y3(wt)
‑
biotin与y3(d26e)
‑
biotin，y3(n122q)
‑
biotin置于pbs中透析，8小时后换液，透析过夜；
[0135]
3.1.4 biotin标记的y3(wt)，y3(d26e)，y3(n122q)超滤至1.5ml(浓度：5.8ug/ul)；
[0136]
3.2表达sars
‑
cov
‑
2 s蛋白的293ft细胞的合成
[0137]
3.2.1将20ug pcdna3.1.s2质粒(上海高等研究院惠赠)使用lipo3000试剂盒转染293ft。
[0138]
10cm皿293ft使用以下试剂剂量进行转染：
[0139]
a液：optimem 1.5ml lipo3000 30ul；
[0140]
b液：optimem 1.5ml p3000 30ul 20ug pcdna3.4
‑
s
‑
gcn4；
[0141]
a液和b液混合，室温静置10min，将混合液均匀滴入293ft细胞中；
[0142]
3.3 biotin标记的y3(wt)，y3(d26e)，y3(n122q)同表达s蛋白的293ft细胞共培养
[0143]
3.3.1将1.0
×
106表达s蛋白的293ft细胞加入24孔板，分别不加或加入20ul浓度0.06ug/ml biotin标记的y3(wt)，y3(d26e)，y3(n122q)，培养基为含10％fbs的dmem培养基；
[0144]
3.3.2 37摄氏度孵育过夜；
[0145]
3.3.3流式细胞术鉴定biotin标记的y3(wt)，y3(d26e)，y3(n122q)与表达s蛋白的293ft细胞结合；
[0146]
以未加蛋白的表达s蛋白的293ft细胞为对照组，对分别加入鉴定biotin标记的y3(wt)，y3(d26e)，y3(n122q)的表达s蛋白的293ft细胞进行流式细胞术测定结合情况；
[0147]
(1)收集细胞，调整细胞浓度为5
×
10
s
/ml；
[0148]
(2)取1ml细胞悬液，2000rpm，离心5min；
[0149]
(3)弃上清，用100μlpbs重悬细胞沉淀；
[0150]
(4)加入streptavidin
‑
apc(biolegend)抗体，轻柔混匀，室温下避光放置30min；
[0151]
(5)1000rpm，离心5min，弃上清；加入500μlpbs洗涤细胞两次；
[0152]
(6)弃上清，加入500μlpbs重悬细胞沉淀，流式细胞仪检测；
[0153]
如图3所示三种y3蛋白与表达s蛋白的293ft细胞的结合情况，用streptavidin
‑
apc和biotin结合的原理，y3与s蛋白结合即可在细胞上检测到streptavidin
‑
apc荧光，根据流式结果可知两种突变型y3蛋白(d26e、n122q)与细胞结合能力更强。
[0154]
四、y3(wt)，y3(d26e)，y3(n122q)阻止新冠假病毒感染细胞
[0155]
4.1 pcdna3.1.vsvg及pcdna3.1.s2质粒准备：
[0156]
获得pcdna3.1.vsvg、pcdna3.1.s2质粒转化至stbl3感受态细胞中，37℃800rpm摇菌1小时。配制固体lb培养基(酵母粉提取物5g、胰蛋白胨10g、氯化钠10g、琼脂粉15g，加入1l水)，按照1∶1000比例加入氨苄青霉素(100mg/ml)至终浓度100μg/ml，混匀后铺板，待固体lb培养基凝固后，取transtbl3菌50μl滴在早已准备好的氨苄青霉素抗性平板上，用细菌涂布器快速将细菌涂布均匀，盖上培养皿盖，将培养皿倒扣在37℃孵育箱中，过夜培养；
[0157]
次日晨挑取单克隆，接种至5ml新鲜lb培养基中，按照1∶1000比例加入氨苄青霉素(100mg/ml)溶液5μl，将其置于37℃孵育箱中，800rpm震荡过夜培养；次日取过夜培养菌液1ml加入100ml新鲜lb培养基中，按照1∶1000比例加入氨苄青霉素(100mg/ml)溶液100μl，将其置于37℃孵育箱中，800rpm震荡10
‑
14小时至菌液浑浊，用质粒大提试剂盒(天根生化科技有限公司)按照说明书的提取步骤提取质粒，将质粒溶于ddh2o(无dna酶)中，检测dna浓度并记录，分装后
‑
20℃保存。
[0158]
4.2g*δg
‑
vsv和sars
‑
cov
‑
2假病毒准备
[0159]
生产sars
‑
cov
‑
2假病毒需要g*δg
‑
vsv假病毒。g*δg
‑
vsv按照文章(jianhui nie.，nature protocol，2020 nov；15(11)：3699
‑
3715.)获得。并通过转化质粒大提，分装后
‑
20℃保存。
[0160]
4.3新冠假病毒的制备
[0161]
4.3.1：293t细胞在t75瓶中传代过夜培养，待细胞密度达到70
‑
90％融合准备转染。
[0162]
4.3.2：将0.75ml的opti
‑
mem添加到新的2ml微量管中(标记为“tube a”)，然后，将30μg质粒pcdna3.1.vsvg(或质粒pcdna3.1.s2)添加到试管a中，接下来，将30μl p3000(lipofectamine 3000试剂盒中的一种成分)添加到试管a中，轻轻混匀，室温静置5分钟；
[0163]
4.3.3：将0.75ml的opti
‑
mem转移到另一个2ml的微管中(标记为“b管”)，然后向其中加入30μl lipofectamine 3000，轻轻混合溶液并将其在室温下放置5分钟；
[0164]
4.3.4：孵育5分钟后，将b管的溶液逐滴加入a管，将试管a轻轻上下颠倒四到六次以完全混合，然后将其在室温下静置15
‑
20分钟；
[0165]
4.3.5：在室温孵育期间，将g*δg
‑
vsv(vsv g假型病毒)稀释至7.0
×
104tcid50/ml，弃去293t细胞培养基，然后将15ml稀释的g*δg
‑
vsv溶液添加到t75瓶中；
[0166]
4.3.6：孵育结束后，将a管中的所有溶液加到293t细胞瓶的上清液中，缓慢混合。将其置于37℃5％co2培养箱中放置6
‑
8小时或过夜；
[0167]
4.3.7：孵育后，吸出培养基并用10
‑
15ml细胞洗涤液(含1％fbs的pbs)洗涤细胞，以温和彻底地冲洗细胞。重复此步骤三遍；
[0168]
4.3.8：将15ml新鲜的完全dmem加入培养瓶中，并将其放入5％co2培养箱中，在37℃下放置24h；
[0169]
4.3.9：将细胞上清(上清液a)收集到50ml离心管中，并将其置于4℃的冰箱中。然后，将15ml新鲜的完全dmem加入293t细胞中，再孵育24小时；
[0170]
4.3.10：第二次孵育后，收获上清液(上清液b)，然后将其与上清液a混合，在室温下将混合物以1000g离心10分钟，使用0.45μm过滤器过滤，分装并将其储存在
‑
80℃下。
[0171]
4.4确定sars
‑
cov
‑
2假病毒滴度
[0172]
4.4.1：从
‑
80℃冰箱中取出假病毒，并在室温中解冻；
[0173]
4.4.2：使用96孔板滴定假病毒，每孔用250μl无菌水密封最外面的孔，以避免边缘孔蒸发引起的影响；
[0174]
4.4.3：将135μl完整dmem置于b2
‑
g2孔中，将100μl完整的dmem加入剩余的孔(b3
‑
g11)中，向b2
‑
g2孔中每孔添加15μl假病毒，使其初始稀释度为1∶10，
[0175]
4.4.4：用多通道移液器将50μl溶液从b2
‑
g2孔转移到b3
‑
g3孔，开始混合稀释，混合六至八次，然后从b3
‑
g3孔转移到b4
‑
g4孔，重复上述操作将样品转移和稀释到b10
‑
g10孔中，最终混合后，从第10列的每个孔中吸取50μl溶液并丢弃，第11列(b11
‑
g11)不加入稀释液，仅用作细胞对照孔cc；
[0176]
4.4.5：用dmem完全培养基将huh
‑
7细胞浓度调节至2
×
105cells/ml，并将100μl细胞悬浮液添加到所有内部孔(b2
‑
g11)中；
[0177]
4.4.6：将滴定板置于5％co2、37℃恒温箱中培养20
‑
28h；
[0178]
4.4.7：孵育后，解冻所需体积的britelite plus试剂，然后在室温水浴中使用；
[0179]
4.4.8：从每个孔中丢弃100μl上清液，留下约100μl液体；
[0180]
4.4.9：将100μlbritelite plus试剂分散到每个孔中；
[0181]
4.4.10：在室温下于黑暗中孵育2分钟，使细胞完全裂解，混匀(六至八次)，并取150μl至相应的96孔化学发光检测板；
[0182]
4.4.11：在发光仪中孵育2分钟后，读取板的rlu；
[0183]
4.4.12：将细胞培养孔的平均rlu(b11
‑
g11)的10倍作为截止值(rlu等于或高于临界值的被视为正)，根据每种稀释液的阳性率和阴性率，使用“tcid50_sars
‑
cov
‑
2”宏并根据reed
‑
muench方法计算tcid50；
[0184]
所测滴定曲线如图4所示，x轴表示构建假病毒的稀释倍数，y轴表示荧光酶标仪所测rlu值；reed
‑
muench方法计算出tcid50为3154000/ml，以此计算不同条件下的病毒使用量。
[0185]
4.5 y3(wt)，y3(d26e)，y3(n122q)蛋白中和假病毒试验
[0186]
4.5.1：准备合适浓度的y3(wt)，y3(d26e)，y3(n122q)蛋白；
[0187]
4.5.2：如病毒滴度实验所示，准备培养板并密封最外面的孔；
[0188]
4.5.3：在每个孔的第2列(b2
‑
g2)中放置150μl dmem培养基，用作细胞对照孔(cc)。将100μl dmem加入第3列(b3
‑
g3)的每个孔中，作为病毒对照孔(vc)；
[0189]
4.5.4：在第b行(b4
‑
b11)的剩余孔中分配142.5μl dmem，这是最初的稀释行，向其余的孔(c4
‑
g11)中加入100μl dmem；
[0190]
4.5.5：按以下顺序将7.5μl的y3样品双重复添加到b行(b4
‑
b11)∶y3(wt)，孔b4
‑
b5；y3(n122g)，b6
‑
b7孔；y3(n122g)，b8
‑
b9孔，7.5μl样品 142.5μl培养基产生1∶20的样品稀释度；
[0191]
4.5.6：用多通道移液器将b行中的样品混合，然后将50μl从b行转到对应的c行，重复混匀直到g行，混匀后，从第4
‑
9列最后一行的孔(g4至g9孔)中丢弃50μl液体；
[0192]
4.5.7：在室温浴中解冻所需量的假病毒。在dmem中将sars
‑
cov
‑
2假病毒稀释至1.3
×
104tcid50/ml，在第3
‑
9列的每个孔中分配50μl稀释的假病毒，然后，盖好板并在5％co2、37℃恒温箱中孵育约60分钟(45
‑
90分钟)，添加假病毒后，将样品再稀释1.5倍，使初始
稀释度为1∶30，然后进行五次系列三倍稀释。样品的最终稀释度为1∶7290；
[0193]
4.5.8：孵育30分钟后，用dmem培养基将huh
‑
7细胞浓度调节至2
×
105cells/ml，并将100μl细胞悬浮液添加到孔中将滴定板置于5％co2、37℃的恒温箱中放置20
‑
28小时；
[0194]
4.5.9：孵育后，重复步骤4.4.8
‑
4.4.11(在步骤4.4.8中从每个孔中除去150μl上清液)；
[0195]
4.5.10：将原始数据导出为excel文件，并将原始数据粘贴到excel的“neutralization_sars
‑
cov
‑
2”宏中，以获取每个样品的ec50；
[0196]
如图5所示绘制出三种y3蛋白的中和曲线，在抑制率和对数转化的稀释倍数之间得到四参数曲线(s形曲线)，证明三种y3蛋白均可以抑制新冠假病毒对靶细胞的感染；
[0197]
根据中和曲线与50％感染抑制率的交点(ec50)，可知交点越靠右说明稀释的倍数越大，其蛋白与s蛋白的合力越高，因此三种蛋白的合力由大到小依次为y3(n122q)、y3(d26e)、y3(wt)。