包括细胞因子诱导的杀伤细胞的活化淋巴细胞及其制备方法与流程

1.本发明涉及包括细胞因子诱导的杀伤细胞的活化淋巴细胞及其制备方法。


背景技术：

2.癌症由各种遗传变异的积累和正常细胞调控过程的丧失引起。在调控癌症的发生的过程中，免疫系统应当经过数个连续过程从而有效地杀死癌细胞。这称为“癌症免疫循环”。在作为第一步骤的癌症免疫循环的第一过程中，释放由肿瘤发生而产生的新的肿瘤抗原(新生抗原)并且树突细胞(dc)起作用以处理所述抗原。在该过程中，例如促炎细胞因子等成分从濒死的肿瘤细胞中释放出来。在第二步骤中，由树突细胞捕获的抗原以mhc
‑
i和mhc
‑
ii分子的形式被标记，它们激活效应t细胞从而响应肿瘤特异性抗原。在最后一个步骤中，激活的效应t细胞移动并且浸润至肿瘤位置，由此特异性地识别肿瘤细胞并且引起其凋亡。然而，以上癌症免疫循环在患有癌症的患者中无法正常工作。
3.关于免疫系统在抑制和促进癌症发生中的作用，存在“癌症免疫编辑(cancer immunoediting)”并且其通常分为三个步骤。第一步骤为“清除”，是指检测肿瘤的发生和将它们杀死连同激活先天免疫和获得性(适应性)免疫的癌症免疫监视过程。该过程与上述癌症免疫循环(“cic”)的过程基本上相同。此外，第二步骤为“平衡”，即肿瘤在清除步骤中存活并且获得性免疫防止肿瘤增殖、同时在肿瘤中形成免疫原性的过程。在该过程中，免疫系统对于残留的肿瘤细胞保持所谓的“功能休眠状态(functional dormant state)”，这被认为是癌症免疫编辑过程中最长耗时步骤。最后，第三步骤为“逃逸”，其中肿瘤细胞避开免疫系统并且增殖。在该步骤，肿瘤细胞失去抗原但是具有增强的对细胞毒性免疫(cytotoxic immunity)的抗性。此外，肿瘤微环境处于免疫抑制状态，并且从肿瘤中分泌例如vegf、tgf
‑
β等免疫抑制细胞因子。此外，调节性t细胞分泌白介素
‑
10和tgf
‑
β以抑制肿瘤特异性t淋巴细胞的功能、表达负共刺激分子(例如pd
‑
1)并且消耗白介素
‑
2，从而诱导ctl的功能的劣化。
4.作为用于治疗癌症的方法，手术是从19世纪90年代之前至今使用时间最长的方法，从那时起，放射疗法、化学疗法和精准医疗得以发展。在通过手术方法治疗癌症的情况下，存在由于手术范围可能受限而可能无法彻底除去肿瘤的缺点。当使用放射疗法和化学疗法来治疗癌症时，不仅癌细胞受到毒性影响，正常细胞也受到毒性影响，因此经常伴有强烈的副作用。在精准医疗的情况下，通过对各患者综合分析不同的基因组信息、环境因素和生活方式来提供最佳治疗方法。然而，目前应用于本领域的标准治疗方法使用从特定群体的结果导出的方法，因此，存在该方法不能从基因方面和生物化学方面治疗不同个体的所有疾病的缺点。抗癌免疫疗法为在癌症患者中诱导、增强或抑制免疫系统以治疗癌症的方法，其分为主动免疫疗法和被动免疫疗法。主动免疫疗法具有虽然响应缓慢但是长时间维持治疗效果的优点。代表性主动免疫疗法包括疫苗和免疫检查点抑制剂。被动免疫疗法的特征在于快速响应但是持续时间短。代表性被动免疫治疗方法包括肿瘤浸润淋巴细胞(til)、单克隆抗体、嵌合抗原受体(car)t细胞和获得性免疫疗法。
5.获得性免疫疗法为通过培养过程来诱导分化和增殖的方法，其可以在从患者中采集血液并且仅分离免疫细胞之后在体外增强抗癌活性并且将激活的免疫细胞注射回患者体内，从而提高抗癌作用。通过在白介素
‑
2的存在下培养从癌症患者的外周血中分离的单核细胞来获得具有增强的细胞毒活性的淋巴因子激活的杀伤细胞(lak细胞)，然后，将其用于尝试治疗癌症患者。将存在于癌症患者的癌组织中的肿瘤浸润淋巴细胞(til)分离并且以相同的方式培养，并且用于治疗癌症患者。
6.然而，由于这些现有的免疫治疗方法使用高浓度的白介素
‑
2，因此发生副作用，并且难以确保足够数量的淋巴细胞以产生治疗效果。
7.因此，本发明人开发了抗癌免疫细胞治疗剂组合物，所述组合物由于相比于lak细胞具有优越的肿瘤细胞杀伤能力和高增殖率并且不需要白介素
‑
2的联合给药而不具有严重的副作用，因此，基于上述开发完成了本发明。


技术实现要素：

8.发明要解决的问题
9.本发明的目的在于提供具有高的肿瘤细胞杀伤能力和增殖率的包括细胞因子诱导的杀伤细胞的活化淋巴细胞。
10.此外，本发明的另一目的在于提供具有非常小的副作用的包括细胞因子诱导的杀伤细胞的活化淋巴细胞。
11.此外，本发明的另一目的在于提供包括上述活化淋巴细胞的活化淋巴细胞。
12.用于解决问题的方案
13.1.一种活化淋巴细胞，其包括cd8

cd56

nkg2d

细胞。
14.2.根据上述1所述的活化淋巴细胞，其中cd8

cd56

nkg2d

细胞的比例为20％以上。
15.3.根据上述1所述的活化淋巴细胞，其中cd8

cd56

nkg2d

细胞的比例为20％至30％。
16.4.一种抗癌免疫细胞治疗剂组合物，其包括根据上述1至3中任一项所述的活化淋巴细胞。
17.5.根据上述4所述的组合物，其中癌症为选自由以下组成的组中的至少一种：胰腺癌、胃癌、乳腺癌、恶性肺赘生物、卵巢癌、脑赘生物、胆道癌(bile duct cancer)、结直肠癌、胆囊癌、直肠癌、恶性黑色素瘤、宫颈癌、胆管癌(cholangiocarcinoma)、结肠癌、转移性胃癌、恶性胶质瘤、肾癌、十二指肠赘生物、唾液腺赘生物、食管癌、子宫内膜癌、窦道癌(sinus cancer)、小肠癌、尤文氏肉瘤、子宫肉瘤、乏特氏壶腹的恶性赘生物(malignant neoplasm of barter's bulge)、前列腺癌、前列腺赘生物、骨肉瘤、恶性胶质瘤多形体(glioblastoma polymorph)、星形细胞瘤、子宫癌、胸腺瘤、内分泌腺赘生物(endocrine neoplasm)、软组织癌、脑干胶质瘤、复发性卵巢癌、舌赘生物、脂肪肉瘤、神经纤维瘤、神经内分泌癌、膀胱癌、恶性赘生物、淋巴瘤、皮肤神经内分泌癌、肾上腺癌、横纹肌肉瘤、赘生物、子宫平滑肌瘤、转移性乳腺癌、肝癌、结直肠癌和印戒细胞癌。
18.6.根据上述4所述的组合物，其中癌症为选自由肝癌、肾癌、胰腺癌、恶性黑色素瘤、前列腺癌和结直肠癌组成的组中的至少一种。
19.7.一种用于制备包括cd8

cd56

nkg2d

细胞的活化淋巴细胞的方法，所述方法包
括：在包含抗cd3抗体、白介素
‑
2和胎牛血清(fbs)的培养基中培养从外周血分离的淋巴细胞。
20.8.根据上述7所述的方法，其中不包括细胞分选步骤。
21.9.根据上述7所述的方法，其中培养在两个以上的步骤中进行，其中第一步骤中的培养基包含抗cd3抗体、白介素
‑
2和fbs，并且第二步骤中的培养基包含白介素
‑
2和fbs。
22.10.根据上述7所述的方法，其中培养基不包含ifn
‑
γ(干扰素
‑
γ)、同时包含20％以上的cd8

cd56

nkg2d

细胞。
23.11.根据上述7所述的方法，其中抗cd3抗体的浓度为1至10μg/ml，第一步骤和第二步骤中的培养基的白介素
‑
2的浓度为100至800u/ml，并且fbs的浓度为0.1至15体积％。
24.12.根据上述7所述的方法，其中培养在三个步骤中进行，
25.其中第一步骤中的培养基包含抗cd3抗体、白介素
‑
2和fbs，而第二步骤和第三步骤中的培养基包含白介素
‑
2和fbs但是不包含抗cd3抗体，并且
26.其中抗cd3抗体的浓度为1至10μg/ml，第一步骤、第二步骤和第三步骤中的每一者中的培养基的白介素
‑
2的浓度为100至800u/ml，并且第一步骤中的培养基的fbs的浓度为5至15体积％，第二步骤中的培养基的fbs的浓度为0.1至1体积％，并且第三步骤中的培养基的fbs的浓度为0.1至2体积％。
27.13.一种用于癌症的预防或治疗的药物组合物，其包括根据上述1至3中任一项所述的活化淋巴细胞。
28.14.根据上述13所述的组合物，其中癌症为选自由以下组成的组中的至少一种：胰腺癌、胃癌、乳腺癌、恶性肺赘生物、卵巢癌、脑赘生物、胆道癌、结直肠癌、胆囊癌、直肠癌、恶性黑色素瘤、宫颈癌、胆管癌、结肠癌、转移性胃癌、恶性胶质瘤、肾癌、十二指肠赘生物、唾液腺赘生物、食管癌、子宫内膜癌、窦道癌、小肠癌、尤文氏肉瘤、子宫肉瘤、乏特氏壶腹的恶性赘生物、前列腺癌、前列腺赘生物、骨肉瘤、恶性胶质瘤多形体、星形细胞瘤、子宫癌、胸腺瘤、内分泌腺赘生物、软组织癌、脑干胶质瘤、复发性卵巢癌、舌赘生物、脂肪肉瘤、神经纤维瘤、神经内分泌癌、膀胱癌、恶性赘生物、淋巴瘤、皮肤神经内分泌癌、肾上腺癌、横纹肌肉瘤、赘生物、子宫平滑肌瘤、转移性乳腺癌、肝癌、结直肠癌和印戒细胞癌。
29.15.根据上述13所述的组合物，其中癌症为选自由肝癌、肾癌、胰腺癌、恶性黑色素瘤、前列腺癌和结直肠癌组成的组中的至少一种。
30.16.根据上述13所述的组合物，其中组合物包括活化淋巴细胞、盐水和人血清白蛋白。
31.发明的效果
32.本发明的活化淋巴细胞可以包括cd8

cd56

nkg2d

细胞以显示优异的抗癌活性。
33.本发明的活化淋巴细胞可以具有非常高比例的cd8

cd56

nkg2d

细胞以使抗癌活性最大化。
34.本发明的制备方法可以产生包括cd8

cd56

nkg2d

细胞的活化淋巴细胞。
附图说明
35.图1为示出使用facs分析确认到的活化淋巴细胞中的细胞表型的图像。
36.图2为示出活化淋巴细胞对人肾癌(achn)的抗癌作用的研究结果的图。
37.图3为示出活化淋巴细胞对人胰腺癌(aspc
‑
1)的抗癌作用的研究结果的图。
38.图4为示出活化淋巴细胞对人黑色素瘤癌(human melanoma cancer)(lox
‑
imv1)的抗癌作用的研究结果的图。
39.图5为示出活化淋巴细胞对人前列腺癌(pc
‑
3)的抗癌作用的研究结果的图。
40.图6为示出活化淋巴细胞对人前列腺癌(pc
‑
3)的抗癌作用的研究结果的图像。
41.图7为示出活化淋巴细胞对人结肠癌(sw620)的抗癌作用的研究结果的图。
42.图8为示出针对活化淋巴细胞对肝癌的临床试验的结果的图。
43.图9为示出针对活化淋巴细胞对肝癌的临床试验的长期随访结果的图。
44.图10为示出针对活化淋巴细胞对恶性胶质瘤的临床试验的结果的图。
45.图11为示出针对活化淋巴细胞对胰腺癌的临床试验的结果的图。
具体实施方式
46.下文中，将详细地描述本发明。
47.本发明涉及活化淋巴细胞。
48.如本文中所使用的活化淋巴细胞为免疫效应细胞群，特别地，为包括cd3

cd56

细胞、cd8

cd56

细胞和cd3

cd8

细胞等的异质细胞群。
49.本发明的活化淋巴细胞可以包括cd8

cd56

nkg2d

细胞。
50.当包括cd8

cd56

nkg2d

细胞时，可以显示优异的抗癌功效。
51.cd8

cd56

nkg2d

细胞的比例可以为例如20％以上，具体为20％至30％，并且更具体为25％至30％，但是不限于此。当大量包括cd8

cd56

nkg2d

细胞时，可以使抗癌功效最大化。
52.本发明的活化淋巴细胞可以包括具有数种表型的细胞，例如cd3

cd56

、cd8

cd56

和cd3

cd8

等。
53.特别地，在本发明的活化淋巴细胞中，cd3

cd56

细胞的比例可以为例如40％以上，具体为40％至60％，并且更具体为40％至50％，但是不限于此。
54.cd8

cd56

细胞的比例可以为例如30％以上，具体为30％至40％，并且更具体为30％至35％，但是不限于此。
55.cd3

cd8

细胞的比例可以为例如60％以上，具体为60％至90％，并且更具体为60％至70％，但是不限于此。
56.本发明的活化淋巴细胞可以通过激活、增殖和培养从外周血分离的淋巴细胞来获得，具体地，可以通过在包含抗cd3抗体、白介素
‑
2和fbs的培养基中培养从外周血分离的淋巴细胞来获得活化淋巴细胞，但是不限于此。
57.此外，本发明涉及包括上述活化淋巴细胞的抗癌免疫细胞治疗剂组合物。
58.在本发明中，免疫细胞治疗剂为通过在体外使存在于人体血液中的免疫细胞大量增殖和激活、然后将激活的免疫细胞给予回人体来治疗癌症的抗癌免疫细胞治疗剂中的一种，其为激活患者自身的免疫细胞以诱导体内免疫的个性化抗癌治疗剂，如利用树突细胞的抗癌免疫细胞治疗剂。
59.本发明的组合物可以包括上述活化淋巴细胞，从而显示优异的抗癌效果。
60.要借助本发明的组合物来预防或治疗的癌症可以包括例如，胰腺癌、胃癌、乳腺
癌、恶性肺赘生物、卵巢癌、脑赘生物、胆道癌、结直肠癌、胆囊癌、直肠癌、恶性黑色素瘤、宫颈癌、胆管癌、结肠癌、转移性胃癌、恶性胶质瘤、肾癌、十二指肠赘生物、唾液腺赘生物、食管癌、子宫内膜癌、窦道癌、小肠癌、尤文氏肉瘤、子宫肉瘤、乏特氏壶腹的恶性赘生物、前列腺癌、前列腺赘生物、骨肉瘤、恶性胶质瘤多形体、星形细胞瘤、子宫癌、胸腺瘤、内分泌腺赘生物、软组织癌、脑干胶质瘤、复发性卵巢癌、舌赘生物、脂肪肉瘤、神经纤维瘤、神经内分泌癌、膀胱癌、恶性赘生物、淋巴瘤、皮肤神经内分泌癌、肾上腺癌、横纹肌肉瘤、赘生物、子宫平滑肌瘤、转移性乳腺癌、肝癌、结直肠癌、和印戒细胞癌等，但是不限于此。
61.可以根据常规方法将本发明的组合物以如下剂型配制和使用：口服剂型例如散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂和气雾剂；外用制剂；栓剂；和无菌注射用溶液剂。
62.本发明的组合物中可能包含的载体、赋形剂和稀释剂可以包括例如，乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯树胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油。当配制组合物时，可以使用本领域通常使用的稀释剂或赋形剂例如填料、增量剂(extender)、粘合剂、润湿剂、崩解剂和表面活性剂来制备制剂。用于口服给药的固体制剂可以包括片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂等，并且可以通过将上述化合物与至少一种赋形剂例如淀粉、碳酸钙、蔗糖或乳糖、明胶等混合来生产此类固体制剂。此外，除了简单赋形剂以外，还可以使用润滑剂例如硬脂酸镁和滑石。用于口服给药的液体制剂可以包括混悬剂、液体溶液剂、乳剂、糖浆剂等。除了通常用作简单稀释剂的水和液体石蜡以外，还可以包括各种各样的赋形剂例如润湿剂、甜味剂、香精和防腐剂。同时，用于肠胃外给药的制剂可以包括无菌水溶液剂、非水溶剂、混悬剂、乳剂、冻干制剂和栓剂。作为非水溶剂和混悬剂，可以使用丙二醇、聚乙二醇、例如橄榄油等植物油、和例如油酸乙酯等可注射的酯。作为用于栓剂的基质，可以使用witepsol、聚乙二醇、吐温61、可可脂、月桂精和甘油明胶等。
63.本发明的组合物的量可以取决于患者的年龄、性别和体重而变化。然而，例如，可以给予包含1
×
109至2
×
10
10
个细胞的组合物，并且其剂量可以为例如100至1,000ml，并且具体为100至300ml。此外，剂量可以取决于患者的给药途径、疾病的程度、性别、体重、年龄等增加或减少。因此，剂量不以任何方式限制本发明的范围。
64.此外，本发明涉及用于制备包括cd8

cd56

nkg2d

细胞的活化淋巴细胞的方法。
65.本发明的方法可以包括在包含抗cd3抗体、白介素
‑
2和fbs的培养基中培养从外周血分离的淋巴细胞。
66.外周血可以为自体外周血。
67.如有必要，将外周血离心以除去上层血浆层并且可以从分离的单核细胞层获得淋巴细胞。
68.可以在包含抗cd3抗体、白介素
‑
2和fbs的培养基中培养淋巴细胞，由此激活和增殖淋巴细胞。
69.抗cd3抗体的浓度没有特别限制，并且可以为例如0.1至100μg/ml，并且具体为1至10μg/ml。
70.可以将抗cd3抗体施用至培养瓶来提供，但是不限于此。
71.白介素
‑
2的浓度没有特别限制，并且可以为例如50至1000u/ml，并且具体为100至800u/ml。在以上范围内，可以不同地包括100至800u/ml、400至800u/ml、100至500u/ml、100至300u/ml等。
72.fbs的浓度没有特别限制，并且可以为例如0.1至15体积％(“体积％”)。
73.本发明的培养基可以不包含干扰素γ(ifn
‑
γ)。
74.根据本发明的培养基可以进一步包括通常用于淋巴细胞培养、t细胞激活、集落增殖和长期培养的组分。例如，培养基可以包含甘氨酸、l
‑
精氨酸、l
‑
天冬酰胺、l
‑
天冬氨酸、l
‑
胱氨酸2hcl、l
‑
谷氨酸、l
‑
谷氨酰胺、l
‑
组氨酸、l
‑
羟基脯氨酸、l
‑
异亮氨酸、l
‑
亮氨酸、l
‑
赖氨酸盐酸盐、l
‑
甲硫氨酸、l
‑
苯丙氨酸、l
‑
脯氨酸、l
‑
丝氨酸、l
‑
苏氨酸、l
‑
色氨酸、l
‑
酪氨酸二钠盐二水合物、l
‑
缬氨酸、生物素、氯化胆碱、d
‑
泛酸钙、叶酸、烟酰胺、对氨基苯甲酸、盐酸吡哆醇、核黄素、盐酸硫胺素、维生素b12、i
‑
肌醇(i
‑
inositol)、硝酸钙、硫酸镁、氯化钾、碳酸氢钠、氯化钠、无水磷酸氢二钠、d
‑
葡萄糖、谷胱甘肽、hepes、和酚红等，但是不限于此。
75.商购可得的产品的实例可以为gibco的rpmi 1640培养基，但是不限于此。
76.如有必要，培养可以在数个步骤中进行。例如，培养可以在一个步骤或两个以上的步骤中进行。
77.当在两个以上的步骤中进行培养时，例如，可以将在步骤1中培养的淋巴细胞分离并且通过将它们转移至新的培养基来在步骤2中培养。
78.当在两个以上的步骤中进行培养时，第一步骤培养基可以包含抗cd3抗体、白介素
‑
2和fbs，而第二步骤培养基可以包含白介素
‑
2和fbs。更具体地，第一步骤培养基可以包含抗cd3抗体和白介素
‑
2，而第二步骤培养基可以包含白介素
‑
2和fbs，但是可以不包含抗cd3抗体。
79.可以以在上述范围内的浓度分别包含抗cd3抗体和白介素
‑
2，并且可以使用以上示例的培养基。
80.当在两个以上的步骤中进行培养时，第一步骤培养基可以包含5至15体积％的fbs，并且具体为8至12体积％的fbs，而第二步骤培养基可以包含0.1至2体积％的fbs，并且具体为0.3至1.5体积％的fbs，但是不限于此。
81.当在三个步骤中进行培养时，步骤1中的培养基可以包含5至15体积％的fbs，并且具体为8至12体积％的fbs，步骤2中的培养基可以包含0.1至1体积％的fbs，并且具体为0.3至0.8体积％的fbs，并且步骤3中的培养基可以包含0.1至2体积％的fbs，并且具体为0.5至1.5体积％的fbs，但是不限于此。
82.可以以通常的细胞培养方法，例如，在co2培养箱中进行培养。co2浓度可以为例如1％至10％，并且具体为3％至7％，并且温度可以为30℃至40℃，并且具体为35℃至38℃，但是不限于此。
83.可以进行培养直至使淋巴细胞充分地激活和增殖，并且可以进行例如10至30天，并且具体为12至21天，但是不限于此。
84.为了提高培养效率，优选根据培养期间细胞数量的增加来添加培养基。可以例如以每1至10天、并且具体为1至7天一次的循环添加培养基，从而防止培养基的劣化，但是不限于此。
85.然后，如有必要，可以将培养基离心以除去上清液，从而分离活化淋巴细胞。
86.以上示例的培养期和培养基的量可以根据细胞的增长速度和增长程度来适当地调整。具体地，由于细胞生长的速率取决于细胞的供体，因此可以在以上范围内适当地确定培养期。此外，可以进一步添加培养基或者可以将细胞转移至大量的培养基中。
87.在本发明的方法中，可以将淋巴细胞从外周血中分离并且冷冻。
88.具体地，可以将淋巴细胞从外周血中分离并且在培养后冷冻。培养可以在上述培养基中进行。
89.可以将冷冻的淋巴细胞解冻，然后再次培养以获得活化淋巴细胞。
90.可以通过将淋巴细胞在30℃至40℃下加热1分钟至20分钟来进行解冻，但是不限于此.
91.可以在包含抗cd3抗体、白介素
‑
2和fbs的培养基中培养解冻的淋巴细胞。
92.抗cd3抗体、白介素
‑
2和fbs的浓度可以在上述范围内，并且可以使用上述组分作为培养基组分，但是不限于此。
93.具体地，解冻的淋巴细胞的培养可以在单一步骤中进行或者分为两个以上的步骤，并且更具体地，培养可以在三个以上的步骤中进行。
94.当在两个步骤中进行培养时，例如，在不包含抗cd3抗体的培养基中的第一培养之后，可以进行在包含抗cd3抗体的培养基中的第二培养。
95.第一培养可以进行例如1至3天，并且第二培养可以进行例如2至5天，但是不限于此。
96.抗cd3抗体的浓度可以在上述范围内。
97.第三培养的培养基可以不包含抗cd3抗体。
98.在第三培养培养基中，可以以例如0.1至2体积％并且具体为0.5至1.5体积％的量包含fbs，但是不限于此。
99.本发明的方法可以包括以上示例的步骤，从而即使没有单独的细胞分选过程(例如，荧光激活细胞分选(fluorescence activated cell sorting，facs)、磁激活细胞分选(magnetic activated cell sorting，macs)等)来分选cd3

、cd8

、cd56

或nkg2d

细胞，仅收集这些细胞，或者选择性地分离和培养这些细胞，也可以获得具有高的cd8

cd56

nkg2d

细胞比率的活化淋巴细胞。
100.此外，本发明涉及用于预防或治疗癌症的药物组合物，其包括活化淋巴细胞。
101.癌症的类型没有特别限制并且可以为选自由以下组成的组中的至少一种：例如，胰腺癌、胃癌、乳腺癌、恶性肺赘生物、卵巢癌、脑赘生物、胆道癌、结直肠癌、胆囊癌、直肠癌、恶性黑色素瘤、宫颈癌、胆管癌、结肠癌、转移性胃癌、恶性胶质瘤、肾癌、十二指肠赘生物、唾液腺赘生物、食管癌、子宫内膜癌、窦道癌、小肠癌、尤文氏肉瘤、子宫肉瘤、乏特氏壶腹的恶性赘生物、前列腺癌、前列腺赘生物、骨肉瘤、恶性胶质瘤多形体、星形细胞瘤、子宫癌、胸腺瘤、内分泌腺赘生物、软组织癌、脑干胶质瘤、复发性卵巢癌、舌赘生物、脂肪肉瘤、神经纤维瘤、神经内分泌癌、膀胱癌、恶性赘生物、淋巴瘤、皮肤神经内分泌癌、肾上腺癌、横纹肌肉瘤、赘生物、子宫平滑肌瘤、转移性乳腺癌、肝癌、结肠癌和印戒细胞癌。具体地，本文中所述的癌症可以为选自由肝癌、肾癌、胰腺癌、恶性黑色素瘤、前列腺癌和结直肠癌组成的组中的至少一种，但是不限于此。
102.组合物可以包含如以上示例的各种载体、赋形剂和稀释剂等。根据一个实施方案，可以包括盐水，具体地，可以包括活化淋巴细胞、盐水和人血清白蛋白，并且更具体地，组合物可以仅由以上组分构成。
103.人血清白蛋白可以以包含在盐水中的状态来提供，可以使用具体为0.5％至3％并且更具体为1％的人血清白蛋白，但是不限于此。
104.下文中，将借助以下实施例详细地描述和说明本发明。
105.实施例
106.活化淋巴细胞的制备
107.1.制备方法1
108.(1)采血和淋巴细胞的分离
109.可以通过从患者中采集20
‑
70ml的自体外周血来开始生产用于本发明的活化淋巴细胞。将采集的血液转移至250ml试管中并且用rpmi1640以1:2的比例稀释3倍，然后将30
‑
40ml稀释的血液分装至其中分装有ficoll
‑
paque的50ml试管中而不将各层混合在一起，并且将试管以2,000rpm的旋转速度在室温下离心20分钟。
110.在将上层血浆层缓慢地除去以防止淋巴细胞层的细胞被吸入之后，将分离的单核细胞层转移至50ml试管中。将分离的单核细胞层用rpmi1640以1:2的比例稀释3倍，在室温下以2,000rpm的旋转速度离心5分钟，然后在释放收集的细胞的同时除去上清液。
111.(2)淋巴细胞培养1
112.将在上述(1)中分离的淋巴细胞释放在50ml淋巴细胞培养基(lymphomedium)中，并且将1μg/ml至10μg/ml的抗cd3抗体分装至包被底面积为225cm2的培养瓶中，然后在细胞培养箱中在37℃和5％co2下开始培养。此时，在淋巴细胞培养基中，包含500至800u/ml的白介素
‑
2和10％的fbs。淋巴细胞培养基进一步包含通常用于使细胞培养物例如包括人白血病细胞的各种哺乳动物细胞悬浮的组分，即，淋巴细胞培养基可以为包含例如如下组分的培养基：硝酸钙(ca(no3)
2 4h2o，90至100mg/l)、氯化钾(kcl，380至400mg/l)、硫酸镁(mgso4，40至50mg/l)、氯化钠(nacl，5500至6000mg/l)、磷酸氢二钠(na2hpo4，750至800mg/l)、d
‑
葡萄糖(1900至2000mg/l)、谷胱甘肽(0.8至1.5mg/l)、酚红(4至6mg/l)、l
‑
精氨酸(190至200mg/l)、l
‑
天冬酰胺(40至50mg/l)、l
‑
天冬氨酸(15至25mg/l)、l
‑
胱氨酸二盐酸盐(l
‑
胱氨酸2hcl、50至70mg/l)、l
‑
谷氨酸(15至25mg/l)、l
‑
谷氨酰胺(450至460mg/l)、甘氨酸(8至15mg/l)、l
‑
组氨酸(10至20mg/l)、l
‑
羟基脯氨酸(15至25mg/l)、l
‑
异亮氨酸(45至55mg/l)、l
‑
亮氨酸(45至55mg/l)、l
‑
赖氨酸盐酸盐(l
‑
赖氨酸hcl、30至50mg/l)、l
‑
甲硫氨酸(10至20mg/l)、l
‑
苯丙氨酸(10至20mg/l)、l
‑
脯氨酸(10至25mg/l)、l
‑
丝氨酸(25至35mg/l)、l
‑
苏氨酸(15至25mg/l)、l
‑
色氨酸(1至10mg/l)、l
‑
酪氨酸2na2h2o(25至35mg/l)、l
‑
缬氨酸(15至25mg/l)、生物素(0.1至1mg/l)、d
‑
泛酸钙(d
‑
泛酸ca、0.1至1mg/l)、氯化胆碱(1至5mg/l)、叶酸(0.5至1.5mg/l)、i
‑
肌醇(30至40mg/l)、烟酰胺(0.5至1.5mg/l)、对氨基苯甲酸(0.5至1.5mg/l)、盐酸吡哆醇(吡哆醇hcl，0.5至1.5mg/l)、核黄素(0.1至1mg/l)、盐酸硫胺素(硫胺素hcl，0.1至1.5mg/l)、维生素b12(0.001至0.01mg/l)、草酰乙酸(0.1至1g/l)、胰岛素(0.001至0.01g/l)、卡那霉素(0.01至0.1g/l)、链霉素(0.01至0.1g/l)、hepes(1至5g/l)、碳酸氢钠(nahco3，1至5g/l)和丙酮酸钠(100至150mg/l)。
113.在培养的第3天至第4天，将培养中的培养瓶取出以在显微镜下目视检查细胞，然
后根据细胞浓度的增加添加总计200ml淋巴细胞培养基，并且将其在细胞培养箱中在37℃和5％co2下进行培养。
114.(3)淋巴细胞培养2
115.在培养的第5天至第8天，将培养中的培养瓶取出并且通过用手轻拍培养瓶的侧边来除去附着至底部的细胞。制备包含750ml包袋培养基(bagpack medium)的包袋(bagpack)并且将3.75ml fbs添加至其中直至fbs的最终浓度达到0.5体积％。将包袋的注射器口打开并且用70％乙醇消毒，然后将注射器口连接至60ml锁式注射器(lock type syringe)。在使用注射器将培养瓶中培养的细胞与培养基一起转移之后，将袋子和注射器分开。然后，在用于袋的细胞培养箱中在37℃、5％co2下进行封闭培养。包袋培养基包含100至300u/ml的白介素
‑
2。
116.包袋培养基进一步包含通常用于集落增殖和t细胞增殖的一些组分，具体地，为包含以下的培养基：氯化钙(cacl2，50至60mg/l)、硫酸铜
‑
5h2o(cuso4‑
h2o，0.0001至0.001mg/l)、硝酸铁9h2o(fe(no3)3·
9h2o，0.1至1mg/l)、硫酸亚铁
‑
7h2o(feso4‑
7h2o，0.1至0.5mg/l)、氯化钾(kcl，140至160mg/l)、氯化镁(mgcl2，10至20mg/l)、硫酸镁(mgso4，20至30mg/l)、氯化钠(nacl，3000至4000mg/l)、磷酸氢钠(nah3po4，20至40mg/l)、磷酸氢二钠(na2hpo4，20至40mg/l)、硫酸锌
‑
7h2o(znso4‑
7h2o，0.1至1mg/l)、d
‑
葡萄糖(1500至1600mg/l)、次黄嘌呤na(1至5mg/l)、亚油酸(0.01至0.1mg/l)、硫辛酸(0.01至0.1mg/l)、酚红(1至10mg/l)、腐胺二盐酸盐(腐胺2hcl，0.01至0.1mg/l)、丙酮酸钠(50至60mg/l)、胸苷(0.1至0.5mg/l)、l
‑
丙氨酸(1至5mg/l)、l
‑
精氨酸盐酸盐(l
‑
精氨酸
‑
hcl，70至80mg/l)、l
‑
天冬酰胺
‑
h2o(1至5mg/l)、l
‑
天冬氨酸(1至5mg/l)、l
‑
半胱氨酸
‑
h2o(5至10mg/l)、l
‑
半胱氨酸二盐酸盐(l
‑
胱氨酸2hcl，10至20mg/l)、l
‑
谷氨酸(1至5mg/l)、l
‑
谷氨酰胺(280至290mg/l)、甘氨酸(5至15mg/l)、l
‑
组氨酸盐酸盐
‑
h2o(l
‑
组氨酸hcl
‑
h2o，10至20mg/l)、l
‑
异亮氨酸(20至30mg/l)、l
‑
亮氨酸(25至35mg/l)、l
‑
赖氨酸盐酸盐(l
‑
赖氨酸hcl、40至50mg/l)、l
‑
甲硫氨酸(5至10mg/l)、l
‑
苯丙氨酸(15至20mg/l)、l
‑
脯氨酸(5至10mg/l)、l
‑
丝氨酸(10至15mg/l)、l
‑
苏氨酸(20至30mg/l)、l
‑
色氨酸(1至10mg/l)、l
‑
酪氨酸2na2h2o(25至30mg/l)、l
‑
缬氨酸(20至30mg/l)、生物素(0.001至0.01mg/l)、d
‑
泛酸钙(d
‑
泛酸ca，1至5mg/l)、氯化胆碱(1至10mg/l)、叶酸(1至5mg/l)、i
‑
肌醇(1至10mg/l)、烟酰胺(1至5mg/l)、盐酸吡哆醇(吡哆醇hcl，1至5mg/l)、核黄素(0.1至0.5mg/l)、盐酸硫胺素(硫胺素hcl，1至5mg/l)、维生素b12(0.1至0.5mg/l)、草酰乙酸(0.1至0.5g/l)、胰岛素(0.001至0.01g/l)、卡那霉素(0.01至0.1g/l)、链霉素(0.01至0.1g/l)、hepes(1至5g/l)、碳酸氢钠(nahco3，0.1至1g/l)、白蛋白(0.1至1g/l)、硒(0.001至0.01g/l)、和aim
‑
v(400至600ml)。
117.(4)淋巴细胞培养3
118.在袋中培养3至8天之后，制备包含1,000ml分离培养基(split medium)的分离袋(split bag)并且将10ml fbs通过注射器口添加至其中直至fbs的浓度达到1体积％。分离袋和包含培养中的细胞的包袋的两条线(lines)使用无菌连接装置(sterile connection device)来接合。在将分离袋的全量分离培养基放入包含细胞的包袋中之后，将包袋等分以使相同量的袋中的内容物进入各培养容器，然后使用无菌粘合剂将两个分开的袋分开接合。此后，在细胞培养箱中在37℃、5％co2下进行封闭培养3天以上。分离培养基包含100至300u/ml的白介素
‑
2。
119.分离培养基进一步包含通常用于集落增殖和长期培养的一些组分，具体地，为包含以下的培养基：氯化钙(cacl2，100至120mg/l)、硫酸铜
‑
5h2o(cuso4‑
5h2o，0.001至0.01mg/l)、硝酸铁9h2o(fe(no3)3·
9h2o，0.01至0.1mg/l)、硫酸亚铁
‑
7h2o(feso4‑
7h2o，0.1至1mg/l)、氯化钾(kcl，300至320mg/l)、氯化镁(mgcl2，25至30mg/l)、硫酸镁(mgso4，45至50mg/l)、氯化钠(nacl，6500至7500mg/l)、磷酸氢钠(nah3po4，60至70mg/l)、磷酸氢二钠(na2hpo4，70至80mg/l)、硫酸锌
‑
7h2o(znso4‑
7h2o，0.1至1mg/l)、d
‑
葡萄糖(3100至3200mg/l)、次黄嘌呤na(1至5mg/l)、亚油酸(0.01至0.1mg/l)、硫辛酸(0.1至0.5mg/l)、酚红(5至10mg/l)、腐胺二盐酸盐(腐胺2hcl，0.01至1mg/l)、丙酮酸钠(100至120mg/l)、胸苷(0.1至1mg/l)、l
‑
丙氨酸(1至10mg/l)、l
‑
精氨酸盐酸盐(l
‑
精氨酸
‑
hcl、140至160mg/l)、l
‑
天冬酰胺
‑
h2o(5至10mg/l)、l
‑
天冬氨酸(5至10mg/l)、l
‑
半胱氨酸
‑
h2o(15至20mg/l)、l
‑
胱氨酸二盐酸盐(l
‑
胱氨酸2hcl，30至35mg/l)、l
‑
谷氨酸(5至10mg/l)、l
‑
谷氨酰胺(560至570mg/l)、甘氨酸(15至20mg/l)、l
‑
组氨酸盐酸盐
‑
h2o(l
‑
组氨酸hcl
‑
h2o、30至35mg/l)、l
‑
异亮氨酸(50至60mg/l)、l
‑
亮氨酸(55至65mg/l)、l
‑
赖氨酸盐酸盐(l
‑
赖氨酸hcl，85至95mg/l)、l
‑
甲硫氨酸(15至20mg/l)、l
‑
苯丙氨酸(30至40mg/l)、l
‑
脯氨酸(15至20mg/l)、l
‑
丝氨酸(20至30mg/l)、l
‑
苏氨酸(50至55mg/l)、l
‑
色氨酸(5至10mg/l)、l
‑
酪氨酸2na2h2o(50至60mg/l)、l
‑
缬氨酸(50至55mg/l)、生物素(0.001至0.01mg/l)、d
‑
泛酸钙(d
‑
泛酸ca，1至5mg/l)、氯化胆碱(5至15mg/l)、叶酸(1至5mg/l)、i
‑
肌醇(10至15mg/l)、烟酰胺(1至5mg/l)、盐酸吡哆醇(吡哆醇hcl，1至5mg/l)、核黄素(0.1至1mg/l)、盐酸硫胺素(硫胺素hcl，1至5mg/l)、维生素b12(0.1至1mg/l)、草酰乙酸(0.1至1g/l)、胰岛素(0.001至0.01g/l)、卡那霉素(0.01至0.1g/l)、链霉素(0.01至0.1g/l)、hepes(1至5g/l)、碳酸氢钠(nahco3、1至5g/l)、白蛋白(0.5至1.5g/l)和硒(0.001至0.01g/l)。
120.(5)污染和性能的确认
121.在收集细胞之前，取培养中的产品的试样以确认产品的污染和性能。
122.(5)
‑
1：细胞收集前3天，在进行细胞目视检验之后，振摇培养溶液以使细胞均匀地混合。首先，在对正在进行细胞培养的袋的注射器口进行消毒之后，用注射器取32至55ml细胞培养溶液并且提供用于请求进行各试验(a至c)。
123.(5)
‑
2：细胞收集前一天或当天，在进行细胞目视检验之后，振摇培养溶液以使细胞均匀地混合。首先，在对正在进行细胞培养的袋的注射器口进行消毒之后，用注射器取24至30ml细胞培养溶液并且提供用于请求进行各试验(d和e)。
124.a：无菌试验
125.b：支原体阴性试验
126.c：外源病毒阴性试验
127.d：确认试验和纯度试验
128.e：效力试验
129.(6)细胞收集
130.在培养的第12天至第21天终止培养，并且将一个袋中的1,000ml细胞培养溶液转移至四个250ml试管中。此时，将培养袋的集线(collection line)用70％乙醇灭菌然后用剪刀剪断。
131.在通过以2,000rpm的旋转速度在室温下离心5分钟来收集细胞之后，将上清液除
去并且使用涡旋机使细胞良好地分散。对于剩下的培养袋，将细胞培养溶液收集至4个相同的试管中，然后在相同的条件下离心。将上清液除去并且使细胞良好地分散。
132.在将人血清白蛋白和生理盐水混合以制备0.1％人血清白蛋白溶液之后，首次洗涤试管中的细胞。
133.在通过以2,000rpm的旋转速度在室温下离心5分钟来收集细胞之后，将上清液彻底除去并且使用涡旋机来使细胞分散。
134.在用0.1％人血清白蛋白溶液洗涤细胞两次之后，将溶液以2,000rpm的旋转速度在室温下进行离心以收集细胞，除去上清液，然后使用涡旋机来使细胞分散。
135.通过将人血清白蛋白和生理盐水混合来制备1％人血清白蛋白溶液。
136.将收集的细胞悬浮在1％人血清白蛋白溶液中，然后均匀地混合。收集一部分样本并且提供用于请求进行各试验(a至d)。
137.在将成品灌装袋的线用70％乙醇进行消毒之后，将线剪断并且与50ml注射器连接，然后用细胞悬液灌装成品灌装袋。
138.将成品灌装袋的线在距离入口1cm处密封3次(0.5cm)，然后将第二个密封部分剪断以最终完成活化淋巴细胞。
139.a：总细胞数测量试验和细胞活力试验
140.b：无菌试验
141.c：内毒素试验
142.d：支原体检测试验
143.2.制备方法2
144.(1)血液收集和淋巴细胞的分离
145.通过从患者中采集20至70ml自体外周血开始用于本发明的活化淋巴细胞的生产。将采集的血液转移至250ml试管中，用rpmi1640以1:2的比例稀释3倍，并且在不使各层混合的同时，将30至40ml稀释的血液分装至其中分装有ficoll
‑
paque的50ml试管中，然后以2,000rpm的旋转速度在室温下离心20分钟。
146.在将上层血浆层缓慢地除去以使淋巴细胞层的细胞不被吸入之后，将分离的单核细胞层转移至50ml试管中。将分离的单核细胞层用rpmi1640以1:2的比例稀释3倍，以2,000rpm的旋转速度在室温下离心5分钟，然后将上清液除去并且使收集的细胞分散。
147.(2)淋巴细胞培养
148.将在上述(1)中分离的淋巴细胞分散至50ml淋巴细胞培养基中，并且分装至在225cm2的底面积上覆有抗cd3抗体的培养瓶中，然后在细胞培养箱中在37℃、5％co2下开始进行培养。此时，淋巴细胞培养基中包含500至800u/ml的白介素
‑
2和10％的fbs。
149.在培养的第3天至第4天，将培养中的培养瓶取出以在显微镜下目视检查细胞，根据细胞浓度的增加将总计130ml淋巴细胞培养基添加至其中，然后在细胞培养箱中在37℃、5％co2下进行培养。
150.(3)淋巴细胞冷冻
151.在培养的第5天，将培养中的培养瓶取出以在显微镜下目视检查细胞，从而确定细胞是否合适。如果细胞通过目视检验是合适的，则通过用手轻拍培养瓶的侧边来除去附着至底部的细胞。此时，应当小心，不要产生气泡。收集500μl分离的细胞，对细胞数量计数，然
后计算达到每个冷冻管3
×
107个细胞以上的细胞数量，以确定需要多少个冷冻管。此后，准备所需的冷冻管。
152.对应于冷冻管的个数，添加fbs以达到10％浓度，由此制备细胞冷冻保存液。
153.将培养瓶中的培养的淋巴细胞转移至250ml试管，以1,200rpm的旋转速度在室温下离心5分钟，然后通过抽吸来将上清液除净。此时，应当小心不要在上清液中包含细胞。在用手轻拍没有上清液的细胞并且通过涡旋机使其分散之后，将细胞与细胞冷冻保存液混合，同时设置一定量的溶液以使每个冷冻管分装1.8ml溶液。将细胞悬液分装至所准备的冷冻管中。将经分装的冷冻管放置在冷冻容器中并且保存在深冻冰箱中。在深冻冰箱中保存之后，确认用于细菌检测试验的中间判断的结果。如果结果是合适的，则将冷冻管转移至
‑
196℃氮气罐并且保存直至解冻。
154.(4)冷冻淋巴细胞的稳定性试验
155.在将冷冻淋巴细胞转移至
‑
196℃氮气罐之后2天，将一个冷冻淋巴细胞取出并且置于冷冻容器中，然后将容器移至37℃干浴并且对其进行加热以使淋巴细胞融化。在使溶解于预先分装在15ml试管中的10ml洗涤液中的0.45ml(4倍稀释)冷冻淋巴细胞悬浮之后，以1,200rpm的旋转速度在室温下进行离心3分钟。在将分离的细胞的上清液除去之后，将细胞分散并且悬浮在10ml培养基中。在收集样品并且将其转移至15ml试管中之后，向质量控制团队请求进行试验a至c。将每孔2ml的剩余细胞悬液分装至24孔板中并且在用于培养瓶的细胞培养箱中在37℃、5％co2下培养2天。2天后，在显微镜下观察24孔板中的培养中的细胞以进行细胞目视检验。在将24孔板中的细胞收集至15ml试管中之后，在该过程期间收集10μl试样，然后测定细胞的数量和活力以确定它们是否适用于试验。通过确认冷冻淋巴细胞的稳定性实验中的质量试验a至c的结果，确定是否适合于完成冷冻保存。
156.a：细菌检测试验
157.b：内毒素试验
158.c：支原体检测试验
159.3.制备方法2
160.(1)淋巴细胞的解冻和培养
161.将一个冷冻淋巴细胞取出，置于冷冻容器中并且转移至37℃干浴，然后使其融化。使溶解于预先分装至试管中的10ml洗涤液(rpmi1640培养基 1.0n hcl 3ml)的细胞悬浮并且以1,200rpm的旋转速度在室温下离心3分钟。在将分离的细胞的上清液除去之后，使细胞分散并且使细胞悬浮于40ml淋巴细胞培养基中。在该过程期间，收集10μl试样，测定细胞的数量和活力，并且将每孔2ml的细胞悬液分装至24孔板中并且在用于培养瓶的细胞培养箱中在37℃、5％co2下培养。
162.在白介素
‑
2的情况下，将浓度保持在100至800u/ml直至培养结束。
163.(2)淋巴细胞培养1
164.在培养的第2天，目视检查24孔板中的培养中的细胞并且将其转移至t225培养瓶中。然后，添加50ml淋巴细胞培养基并且在用于培养瓶的细胞培养箱中在37℃、5％co2下培养。在培养的第4天，在通过显微镜目视检查细胞之后，使培养中的细胞分散，转移至在225cm2的底面积上覆有抗cd3抗体的培养瓶中，然后将150ml淋巴细胞培养基添加至其中。然后，在用于培养瓶的细胞培养箱中在37℃、5％co2下进行培养。
165.(3)淋巴细胞培养2
166.在培养的第6天至第8天，将培养瓶取出以在显微镜下目视检查细胞，从而确定细胞是否适合于检验。此后，通过用手轻拍培养瓶的侧边来除去附着至底部的细胞。收集500μl样品并且将其转移至15ml试管中以对细胞的数量进行计数并且测定细胞的活力(存活)。将fbs置于细胞从其中取出的培养瓶中，直至包袋培养基的最终浓度达到0.5％。然后，在打开培养袋的注射器口并且用70％乙醇对其进行消毒之后，将60ml锁式注射器连接至注射器口。在使用注射器将培养的细胞连同培养基一起转移至培养瓶中之后，使注射器与袋分离。在用于袋的细胞培养箱中在37℃、5％co2下进行封闭培养。
167.(4)淋巴细胞培养3
168.在袋中培养3至8天之后，准备包含1,000ml分离培养基的培养袋并且将fbs通过注射器口添加至其中直至fbs浓度达到1％。培养袋和包含培养中的细胞的袋的两条线使用无菌连接装置来接合。在将培养袋的全量分离培养基放入包含培养中的细胞的袋中之后，将细胞均匀地分开以使相同量的袋中的内容物进入各培养容器，然后使用无菌粘合剂将两个分开的袋分开接合。此后，在细胞培养箱中在37℃、5％co2下进行封闭培养3天。
169.(5)污染和性能的确认
170.在收集细胞之前，取培养中的产品的试样以确认产品的污染和性能。
171.(5)
‑
1：细胞收集前3天，在进行细胞目视检验之后，在收集之前振摇培养溶液以使细胞均匀地混合。对正在进行细胞培养的袋的注射器口进行消毒，然后使用注射器取32至55ml细胞培养溶液并且提供用于请求进行各试验(a至c)。
172.(5)
‑
2：细胞收集前一天或当天，在进行细胞目视检验之后，在收集之前振摇培养溶液以使细胞均匀地混合。对正在进行细胞培养的袋的注射器口进行消毒，然后使用注射器取24至30ml细胞培养溶液并且提供用于请求进行各试验(d和e)。
173.a：无菌试验
174.b：支原体阴性试验
175.c：外源病毒阴性试验
176.d：确认试验和纯度试验
177.e：效力试验
178.(6)细胞收集
179.在培养的第12天至第21天终止培养，并且将一个袋中的1,000ml细胞培养溶液转移至四个250ml试管中。此时，将培养袋的集线用70％乙醇灭菌，然后用剪刀剪断。
180.在通过以2,000rpm的旋转速度在室温下离心5分钟来收集细胞之后，将上清液除去并且使用涡旋机使细胞良好地分散。对于剩下的培养袋，将细胞培养溶液收集在4个相同的试管中，然后在如上所述相同的条件下离心，并且将上清液除去，同时使细胞良好地分散。
181.在通过将人血清白蛋白和生理盐水混合来制备0.1％人血清白蛋白溶液之后，用该溶液首次洗涤试管中的细胞。
182.在通过以2,000rpm的旋转速度在室温下离心5分钟来收集细胞之后，将上清液彻底除去并且使用涡旋机来使细胞分散。
183.在用0.1％人血清白蛋白溶液洗涤细胞两次之后，通过以2,000rpm的旋转速度在
室温下离心来收集细胞，然后将上清液除净并且使用涡旋机使细胞分散。
184.通过将人血清白蛋白和生理盐水混合来制备1％人血清白蛋白溶液。
185.将收集的细胞悬浮于1％人血清白蛋白溶液中，然后均匀地混合。收集一部分样品并且提供用于请求进行各试验(a至d)。
186.在将成品灌装袋的线用70％乙醇进行消毒之后，将线剪断并且与50ml注射器连接，然后用细胞悬液灌装成品灌装袋。将成品灌装袋的线在距离入口1cm处密封3次(0.5cm)，然后将第二个密封部分剪断以最终完成活化淋巴细胞。
187.a：总细胞数测量试验和细胞活力试验
188.b：无菌试验
189.c：内毒素试验
190.d：支原体检测试验
191.制备的活化淋巴细胞的细胞表型分析
192.为了确认细胞因子诱导的杀伤细胞的分布程度，收集所培养的细胞的一些样品并且通过荧光激活细胞分选(facs)来分析。
193.准备igg1
‑
fitc、igg1
‑
pe和igg1
‑
apc作为阴性对照抗体，同时准备抗
‑
cd3
‑
fitc、抗
‑
cd8
‑
pe、抗
‑
cd8
‑
fitc、抗
‑
cd56
‑
pe、抗
‑
cd56 apc和抗
‑
nkg2d
‑
pe作为实验组抗体(使用具有不同荧光的相同抗体来防止在双重染色和三重染色期间荧光的重叠)。缓冲溶液为包含0.5％白蛋白的磷酸盐缓冲溶液。
194.对所培养的抗癌免疫细胞治疗剂中的细胞的数量进行计数，然后制备细胞量为0.5
×
107个细胞/ml的药剂。在以1,600rpm的旋转速度在室温下离心4分钟之后，将上清液除去并且添加缓冲溶液以达到0.5
×
107个细胞/ml。在准备5ml试管之后，将100μl具有0.5
×
107个细胞/ml的各细胞悬液添加至其中，此外，进一步添加对照抗体和实验组抗体。在混合均匀之后，使溶液在黑暗状态下在室温下进行反应30分钟。在30分钟之后，添加1ml缓冲溶液，然后以1,600rpm的旋转速度在室温下离心4分钟。在将上清液除去之后，添加500μl缓冲溶液，用流式细胞分析仪来分析细胞表型。
195.所制备的活化淋巴细胞的抗癌功效评价项目和评价方法、以及用于各癌症类型的动物模型的制备
196.1.对人肾癌(achn)的抗癌作用的鉴定
197.动物模型制备和试验物质给药
198.购买裸鼠并且将其储存于韩国生物科学与生物技术研究院的无特定病原体的(spf)房间中，并且在使用前使其适应环境1周。将人肾癌，即，achn细胞以1.2
×
107个细胞的浓度皮下注射至各裸鼠。从癌症细胞移植后第二天起，将本发明的组合物注射至裸鼠的尾静脉中，每周一次，总计4次。作为阳性对照组，以2mg/kg的浓度静脉内给予阿霉素，每周一次，总计4次。
199.为了观察对肿瘤生长的影响，观察肿瘤尺寸、体重和一般症状来评价抗癌功效，并且测量动物的体重以验证对动物的毒性。
200.统计学
201.使用anova(prisim，graphpad软件，usa)和学生t检验来计算所有试验结果的标准偏差(sd)和p值。
202.2.对人胰腺癌(aspc
‑
1)的抗癌作用的鉴定
203.动物模型制备和试验物质给药
204.购买裸鼠并且将其储存于韩国生物科学与生物技术研究院的无特定病原体的(spf)房间中，并且在使用前使其适应环境1周。将人胰腺癌，即，aspc1细胞以9
×
106个细胞的浓度皮下注射至各裸鼠。从癌症细胞移植后第二天起，将本发明的组合物注射至裸鼠的尾静脉中，每周一次，总计4次。作为阳性对照组，以2mg/kg的浓度静脉内给予阿霉素，每周一次，总计4次。
205.为了观察对肿瘤生长的影响，观察肿瘤尺寸、体重和一般症状来评价抗癌功效，并且测量动物的体重以验证对动物的毒性。
206.统计学
207.使用anova(prisim，graphpad软件，usa)和学生t检验来计算所有试验结果的标准偏差(sd)和p值。
208.3.对人黑色素瘤癌(lox
‑
imv1)的抗癌作用的鉴定
209.动物模型制备和试验物质给药
210.购买裸鼠并且将其储存于韩国生物科学与生物技术研究院的无特定病原体的(spf)房间中，并且在使用前使其适应环境1周。将人黑色素瘤癌，即，lox
‑
imv1细胞以1.5
×
106个细胞的浓度皮下注射至各裸鼠。从癌症细胞移植后第二天起，将本发明的组合物注射至裸鼠的尾静脉中，每周一次，总计3次。作为阳性对照组，以2mg/kg的浓度静脉内给予阿霉素，每周一次，总计3次。
211.为了观察对肿瘤生长的影响，观察肿瘤尺寸、体重和一般症状来评价抗癌功效，并且测量动物的体重以验证对动物的毒性。
212.统计学
213.使用anova(prisim，graphpad软件，usa)和学生t检验来计算所有试验结果的标准偏差(sd)和p值。
214.4.对人前列腺癌(pc
‑
3)的抗癌作用的鉴定
215.动物模型制备和试验物质给药
216.购买裸鼠并且将其储存于韩国生物科学与生物技术研究院的无特定病原体的(spf)房间中，并且在使用前使其适应环境1周。将人前列腺癌，即，pc
‑
3细胞以9
×
106个细胞的浓度皮下注射至各裸鼠。从癌症细胞移植后第二天起，将本发明的组合物注射至裸鼠的尾静脉中，每周一次，总计4次。作为阳性对照组，以2mg/kg的浓度静脉内给予阿霉素，每周一次，总计4次。
217.为了观察对肿瘤生长的影响，观察肿瘤尺寸、体重和一般症状来评价抗癌功效，并且测量动物的体重以验证对动物的毒性。
218.统计学
219.使用anova(prisim，graphpad软件，usa)和学生t检验来计算所有试验结果的标准偏差(sd)和p值。
220.5.对人结肠癌(sw620)的抗癌作用的鉴定
221.动物模型制备和试验物质给药
222.购买裸鼠并且将其储存于韩国生物科学与生物技术研究院的无特定病原体的
(spf)房间中，并且在使用前使其适应环境1周。将人结肠癌，即，sw620细胞以6
×
106个细胞的浓度皮下注射至各裸鼠。从癌症细胞移植后第二天起，将本发明的组合物注射至裸鼠的尾静脉中，每周一次，总计4次。作为阳性对照组，以2mg/kg的浓度静脉内给予阿霉素，每周一次，总计4次。
223.为了观察对肿瘤生长的影响，观察肿瘤尺寸、体重和一般症状来评价抗癌功效，并且测量动物的体重以验证对动物的毒性。
224.统计学
225.使用anova(prisim，graphpad软件，usa)和学生t检验来计算所有试验结果的标准偏差(sd)和p值。
226.活化淋巴细胞的细胞表型分析结果
227.1)作为分析根据以上实施例制备的细胞因子诱导的杀伤细胞的细胞表型的结果，在各种亚群中显示最强细胞毒性的cd56

细胞占总细胞的46.9％。其中，作为细胞因子诱导的杀伤细胞的cd3

cd56

细胞群(不依赖于mhc并且相比于仅表达cd56

的细胞群具有更高的增殖率和细胞毒活性)占44.4％，进而占cd56

细胞的94.7％。测得共表达cd8

cd56

的细胞群为32.5％。测得共表达cd3

cd8

的细胞毒性t淋巴细胞为65％(参见图1)。
228.2)作为通过对具有cd8

的在以上实施例中制备的活化淋巴细胞进行门控(gating)来分析cd8

cd56

的表达的结果，同时表达cd8

cd56

nkg2d

的细胞占所有细胞的28％。
229.所制备的活化淋巴细胞的抗癌作用评价的结果
230.1.对人肾癌(achn)的抗癌作用的评价结果
231.1)肿瘤尺寸的变化
232.在对照组的情况下，使细胞在第28天生长至尺寸为321
±
47mm3，并且当以1
×
106个细胞/小鼠给予本发明的组合物时，尺寸为274
±
51mm3，表明14％的生长抑制。另一方面，当以3
×
106个细胞/小鼠给予本发明的组合物时，尺寸为209
±
26mm3，表明34％的生长抑制(p<0.05)。此外，当以10
×
106个细胞/小鼠给予本发明的组合物时，尺寸为138
±
32mm3，表明56％的生长抑制(p<0.01)。在用作阳性对照组的阿霉素给药组中，尺寸为192
±
44mm3，表明40％的癌症生长抑制。
233.2)肿瘤重量的变化
234.在最后一天(第28天)将肿瘤分离之后，测量重量。在对照组的情况下，平均肿瘤重量为651
±
164mg，并且当以1
×
106个细胞/小鼠给予本发明的组合物时，肿瘤重量为530
±
100mg，表明18％的生长抑制。另一方面，当以3
×
106个细胞/小鼠给予组合物时，肿瘤重量为435
±
118mg，表明33％的生长抑制(p<0.05)。此外，当以10
×
106个细胞/小鼠给予本发明的组合物时，肿瘤重量为308
±
95mg，表明52％的生长抑制(p<0.01)。在用作阳性对照组的阿霉素给药组中，肿瘤重量为409
±
41mg，表明37％的癌症生长抑制(p<0.05)。
235.3)体重的变化
236.与第1天的体重(100％)相比，在第28天，对照组显示体重变化为105％，而本发明组合物的给药组显示体重变化为104％至106％。此外，阿霉素给药组显示95％的正常体重变化。此外，未观察到异常行为。
237.4)一般症状的观察
238.在给予本发明的组合物的28天期间，没有观察到死亡的动物，并且没有观察到具有异常行为的动物。
239.2.对人胰腺癌(aspc
‑
1)的抗癌作用的鉴定
240.1)肿瘤尺寸的变化
241.在对照组的情况下，肿瘤在第25天生长至251
±
50mm3，并且当以1
×
106个细胞/小鼠给予本发明的组合物时，尺寸为192
±
25mm3，表明23％的生长抑制(p<0.05)。另一方面，当以3
×
106个细胞/小鼠给予本发明的组合物时，尺寸为146
±
26mm3，表明42％的生长抑制(p<0.01)。此外，当以10
×
106个细胞/小鼠给予本发明的组合物时，尺寸为73
±
30mm3，表明70％的生长抑制(p<0.01)。在用作阳性对照组的阿霉素给药组中，尺寸为130
±
28mm3，表明48％的癌症生长抑制。
242.2)肿瘤重量的变化
243.在最后一天(第25天)将肿瘤分离之后，测量重量。在对照组的情况下，平均肿瘤重量为790
±
193mg，并且当以1
×
106个细胞/小鼠给予本发明的组合物时，肿瘤重量为591
±
106mg，表明25％的生长抑制(p<0.05)。另一方面，当以3
×
106个细胞/小鼠给予组合物时，肿瘤重量为457
±
45mg，表明42％的生长抑制(p<0.05)。此外，当以10
×
106个细胞/小鼠给予本发明的组合物时，肿瘤重量为267
±
84mg，表明66％的生长抑制(p<0.01)。在用作阳性对照组的阿霉素给药组中，肿瘤重量为473
±
64mg，表明44％的癌症生长抑制(p<0.01)。
244.3)体重的变化
245.与第1天的体重(100％)相比，在第25天，对照组显示体重变化为130％，而本发明组合物的给药组显示体重变化为120％至125％。此外，阿霉素给药组显示125％的正常体重变化。此外，未观察到异常行为。
246.4)一般症状的观察
247.在给予本发明的组合物的25天期间，没有观察到死亡的动物，并且没有观察到具有异常行为的动物。
248.3.对人黑色素瘤癌(lox
‑
imv1)的抗癌作用的鉴定
249.1)肿瘤尺寸的变化
250.在对照组的情况下，肿瘤在第15天生长至254
±
43mm3，并且当以1
×
106个细胞/小鼠给予本发明的组合物时，尺寸为167
±
78mm3，表明34％的生长抑制(p<0.05)。另一方面，当以3
×
106个细胞/小鼠给予本发明的组合物时，尺寸为108
±
35mm3，表明57％的生长抑制(p<0.01)。此外，当以10
×
106个细胞/小鼠给予本发明的组合物时，尺寸为60
±
21mm3，表明76％的生长抑制(p<0.01)。在用作阳性对照组的阿霉素给药组中，尺寸为71
±
458mm3，表明72％的癌症生长抑制。
251.2)肿瘤重量的变化
252.在最后一天(第15天)将肿瘤分离之后，测量重量。在对照组的情况下，平均肿瘤重量为1676
±
530mg，并且当以1
×
106个细胞/小鼠给予本发明的组合物时，肿瘤重量为1158
±
631mg，表明30％的生长抑制(p<0.05)。另一方面，当以3
×
106个细胞/小鼠给予组合物时，肿瘤重量为799
±
258mg，表明52％的生长抑制(p<0.01)。此外，当以10
×
106个细胞/小鼠给予本发明的组合物时，肿瘤重量为401
±
166mg，表明76％的生长抑制(p<0.01)。在用作阳性对照组的阿霉素给药组中，肿瘤重量为496
±
306mg，表明70％的癌症生长抑制(p<
0.01)。
253.3)体重的变化
254.与第1天的体重(100％)相比，在第15天，对照组显示体重变化为130％，而本发明组合物的给药组显示体重变化为121％至126％。此外，阿霉素给药组显示122％的正常体重变化。此外，未观察到异常行为。
255.4)一般症状的观察
256.在给予本发明的组合物的15天期间，没有观察到死亡的动物，并且没有观察到具有异常行为的动物。
257.4.对人前列腺癌(pc
‑
3)的抗癌作用的鉴定
258.1)肿瘤尺寸的变化
259.在对照组的情况下，肿瘤在第22天生长至378
±
23mm3，并且当以1
×
106个细胞/小鼠给予本发明的组合物时，尺寸为300
±
54mm3，表明20％的生长抑制(p<0.01)。另一方面，当以3
×
106个细胞/小鼠给予本发明的组合物时，尺寸为211
±
33mm3，表明44％的生长抑制(p<0.01)。此外，当以10
×
106个细胞/小鼠给予本发明的组合物时，尺寸为183
±
22mm3，表明51％的生长抑制(p<0.01)。在用作阳性对照组的阿霉素给药组中，尺寸为225
±
59mm3，表明40％的癌症生长抑制。
260.2)肿瘤重量的变化
261.在最后一天(第22天)将肿瘤分离之后，测量重量。在对照组的情况下，平均肿瘤重量为1346
±
159mg，并且当以1
×
106个细胞/小鼠给予本发明的组合物时，肿瘤重量为1018
±
127mg，表明24％的生长抑制(p<0.01)。另一方面，当以3
×
106个细胞/小鼠给予组合物时，肿瘤重量为761
±
131mg，表明43％的生长抑制(p<0.01)。此外，当以10
×
106个细胞/小鼠给予本发明的组合物时，肿瘤重量为677
±
56mg，表明49％的生长抑制(p<0.01)。在用作阳性对照组的阿霉素给药组中，肿瘤重量为808
±
156mg，表明40％的癌症生长抑制(p<0.01)。
262.3)体重的变化
263.与第1天的体重(100％)相比，在第22天，对照组显示体重变化为103％，而本发明组合物的给药组显示体重变化为103％至106％。此外，阿霉素给药组显示102％的正常体重变化。此外，未观察到异常行为。
264.4)一般症状的观察
265.在给予本发明的组合物的22天期间，没有观察到死亡的动物，并且没有观察到具有异常行为的动物。
266.5.对人结肠癌(sw620)的抗癌作用的鉴定
267.1)肿瘤尺寸的变化
268.在对照组的情况下，肿瘤在第25天生长至473
±
190mm3，并且当以1
×
106个细胞/小鼠给予本发明的组合物时，尺寸为436
±
214mm3，表明7％的生长抑制(不显著)。另一方面，当以3
×
106个细胞/小鼠给予本发明的组合物时，尺寸为220
±
138mm3，表明53％的生长抑制(p<0.05)。此外，当以10
×
106个细胞/小鼠给予本发明的组合物时，尺寸为127
±
60mm3，表明73％的生长抑制(p<0.01)。在用作阳性对照组的阿霉素给药组中，尺寸为142
±
97mm3，表明48％的癌症生长抑制(p<0.05)。
269.2)肿瘤重量的变化
270.在最后一天(第25天)将肿瘤分离之后，测量重量。在对照组的情况下，平均肿瘤重量为1661
±
817mg，并且当以1
×
106个细胞/小鼠给予本发明的组合物时，肿瘤重量为1482
±
659mg，表明10％的生长抑制(不显著)。另一方面，当以3
×
106个细胞/小鼠给予组合物时，肿瘤重量为765
±
424mg，表明53％的生长抑制(p<0.05)。此外，当以10
×
106个细胞/小鼠给予本发明的组合物时，肿瘤重量为440
±
222mg，表明73％的生长抑制(p<0.001)。在用作阳性对照组的阿霉素给药组中，肿瘤重量为834
±
306mg，表明49％的癌症生长抑制(p<0.05)。
271.3)体重的变化
272.与第1天的体重(100％)相比，在第25天，对照组显示体重变化为116％，而本发明组合物的给药组显示体重变化为120％至121％。此外，阿霉素给药组显示114％的正常体重变化。此外，未观察到异常行为。
273.4)一般症状的观察
274.在给予本发明的组合物的25天期间，没有观察到死亡的动物，并且没有观察到具有异常行为的动物。
275.[表1]
[0276][0277]
a：给予裸鼠的人癌细胞数
[0278]
b：肿瘤重量测量和实验的最后一天
[0279]
c：对照组的肿瘤生长速率(％)
[0280]
d：给予抗癌免疫细胞治疗剂组合物(1
×
106个细胞/小鼠)的组相比于对照组的肿瘤生长速率(％)
[0281]
e：给予抗癌免疫细胞治疗剂组合物(3
×
106个细胞/小鼠)的组相比于对照组的肿瘤生长速率(％)
[0282]
f：给予抗癌免疫细胞治疗剂组合物(1
×
106个细胞/小鼠)的组相比于对照组的肿瘤生长速率(％)
[0283]
g：给予阿霉素(2mg/kg)的组相比于对照组的肿瘤生长速率(％)
[0284]
活化淋巴细胞的国内临床试验
[0285]
1.肝癌临床试验
[0286]
根据肝癌ajcc分期方法(第6版)，在肝细胞癌的一期或二期接受根治性治疗(手术切除、射频热疗法(radiofrequency heat therapy)或经皮乙醇输注)的230名患者中评价本发明的组合物的安全性和有效性。无复发生存期(rfs)的中位值在免疫治疗组中为44个月并且在对照组中为30个月(p＝0.010)，由此证明了统计学上的显著性差异，hr0.63(95％
ci，0.43
‑
0.94)。作为次要结果变量(secondary outcome variable)，免疫治疗组中的总生存期比对照组长，hr0.21(95％ci，0.06
‑
0.75；p＝0.008)。
[0287]
2.肝癌临床试验的长期随访
[0288]
在参加临床试验的患者中，对通过签字而同意长期随访的患者，从临床试验结束之日起长达36个月，以长达6个月的间隔随访复发的长期生存率。在60个月时的无复发生存率在免疫治疗组中为44.8％并且在对照组中为33.1％，由此证明了统计学上的显著性差异(p＝0.0033)。
[0289]
3.恶性胶质瘤临床试验
[0290]
针对患有恶性胶质瘤的患者，评价本发明的组合物的有效性。无进展生存期(pfs)的中位值在免疫治疗组中为8.1个月(95％置信区间(ci)，5.8至8.5个月)并且在对照组中为5.4个月(95％ci，3.3至7.9个月，p＝0.0401)。总生存期的中位值在免疫治疗组中为22.5个月(95％ci，17.2至23.9个月)并且在对照组中为16.9个月(95％ci，13.9至21.9个月)，并且不存在统计学上的显著性差异。然而，在免疫治疗组中延长了5.6个月。
[0291]
4.胰腺癌临床试验
[0292]
针对患有胰腺癌的患者，评价本发明的组合物的有效性。无疾病进展生存期的中位值为11.0周(95％ci，8.8至13.2周)，并且总生存期的中位值为26.6周(95％ci，8.6至44.6周)。从登记之日起6个月生存率为60％。