包含与白蛋白结合的Slit3蛋白的LRRD2的用于预防或治疗肌肉疾病的组合物的制作方法

包含与白蛋白结合的slit3蛋白的lrrd2的用于预防或治疗肌肉疾病的组合物
技术领域
1.本发明涉及包含与白蛋白结合的slit3蛋白的lrrd2的用于预防或治疗肌肉疾病的组合物，更具体地，本发明提供包含与白蛋白结合的slit3蛋白的lrrd2的融合蛋白、编码上述融合蛋白的核酸分子、包含上述核酸分子的重组载体、包含上述重组载体的转化体、利用上述转化体的融合蛋白的制备方法、包含上述融合蛋白的用于预防或治疗肌肉疾病的组合物以及包含上述融合蛋白的用于增强slit3蛋白的lrrd2的体内半衰期的组合物。


背景技术：

2.slit蛋白是在神经系统的发育过程中调节神经元和轴突的运动而周知的蛋白质。slit蛋白可与robo受体相互作用来调节生理活性，作为在心脏、肺、肾脏、乳房组织等各种组织中起到调节各种细胞内过程的因子的作用而周知，最近，据报告，在细胞的生长、附着能力及迁移能力的调节中起到重要作用，并且，据报告，slit蛋白可参与细胞的分化过程中的移动及癌症的产生和转移过程。具体地，据报告，在脊椎动物的胚胎发育阶段中，表达slit蛋白及robo蛋白，slit3、robo1及robo2蛋白的表达在肌肉组织中增加(neil vargesson et.al.,mechanisms of development 106.1(2001):175
‑
180)。根据该报告，slit3蛋白的表达在胚胎后肢肌肉组织的成肌细胞中增加，但是在报告中提到，仅参与迁移(migration)，不参与成肌细胞的分化。
3.本发明人已揭示，slit3蛋白的lrrd2促进成肌细胞的分化来诱导肌肉量的增加，由此可用于预防或治疗肌肉减少症(韩国公开专利第10
‑
2017
‑
0138920号)。lrrd2通过注射剂向访问医院的患者给药，但体内半衰期非常短，为了发挥其药效，必须缩短给药周期，由此预测发生由于使用过多的药剂而降低功效的问题。
4.由此，本发明人研发了通过增强lrrd2的体内半衰期来改善其功效的hsa
‑
slit3 lrrd2融合蛋白(hsa
‑
slit3 lrrd2 fusion protein)，从而完成了本发明。


技术实现要素：

5.技术问题
6.本发明的目的在于，提供用于改善slit3蛋白的lrrd2的体内半衰期的融合蛋白。
7.本发明的再一目的在于，提供编码如上所述的融合蛋白的核酸分子、包含上述核酸分子的重组载体以及包含上述重组载体的转化体。
8.本发明的又一目的在于，提供如上所述的融合蛋白的制备方法。
9.本发明的还有一目的在于，提供改善slit3蛋白的lrrd2的肌肉疾病的预防或治疗功效的组合物。
10.本发明的又一目的在于，提供增强slit3蛋白的lrrd2的体内半衰期的组合物。
11.技术方案
12.为了解决如上所述的问题，本发明提供包含与白蛋白结合的slit3蛋白的lrrd2的
融合蛋白。
13.根据本发明的优选一实施例，上述白蛋白可以为人血清白蛋白(human serum albumin)。
14.根据本发明的优选再一实施例，在上述融合蛋白中，上述人血清白蛋白可与slit3蛋白的lrrd2的n
‑
末端结合。
15.根据本发明的优选另一实施例，上述人血清白蛋白可包含seq id no:2的氨基酸序列。
16.根据本发明的优选还有一实施例，上述slit3蛋白的lrrd2可包含seq id no:3的氨基酸序列。
17.根据本发明的优选又一实施例，在上述白蛋白与slit3蛋白的lrrd2之间还可包含连接子。
18.根据本发明的优选又一实施例，上述连接子为(ggggs)n(seq id no:5)，其中，n可以为1至10的整数。
19.并且，本发明提供编码如上所述的融合蛋白的核酸分子。
20.并且，本发明提供包含如上所述的核酸分子的重组载体及包含其的转化体。
21.并且，本发明提供包括培养如上所述的转化体的步骤的融合蛋白的制备方法。
22.并且，本发明提供包含如上所述的融合蛋白的用于预防或治疗肌肉疾病的药学组合物。
23.根据本发明的优选又一实施例，上述药学组合物可通过注射剂给药。
24.根据本发明的优选又一实施例，上述肌肉疾病可以为选自由张力缺乏(atony)、肌萎缩症(muscular atropy)、肌营养不良症(muscular dystrophy)、肌无力症、恶病质(cachexia)及肌肉减少症(sarcopenia)组成的组中的一种以上。
25.并且，本发明提供包含与白蛋白结合的slit3蛋白的lrrd2的用于增强slit3蛋白的lrrd2的体内半衰期的组合物。
26.发明的效果
27.本发明的与白蛋白结合的slit3蛋白的lrrd2示出与未与白蛋白结合的slit3蛋白的lrrd2相同的细胞学功效，与未与白蛋白结合的slit3蛋白的lrrd2相比，体内半衰期显著增加，由此可更有效地预防或治疗骨相关疾病。
附图说明
28.图1示出本发明的白蛋白与slit3 lrrd2的n
‑
末端结合的融合蛋白的组成及其氨基酸序列。
29.图2示出分离纯化sp胱抑素s
‑
hsa
‑
slit3 lrrd2融合蛋白后，执行十二烷基硫酸钠
‑
聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds
‑
page)的结果。
30.图3示出各种形态的hsa
‑
slit3 lrrd2融合蛋白的受体结合能力的曲线图。
31.图4为示出向禁食雄性icr小鼠给药slit3 lrrd2(
●
，“slit3”)和hsa
‑
slit3lrrd2(
■
，“hsa
‑
slit3”)的iv后的slit3 lrrd2的血浆浓度时间曲线图。
具体实施方式
32.如上所述，slit3蛋白的lrrd2可通过促进成肌细胞的分化来诱导肌肉量的增加，由此可用于预防或治疗肌肉减少症，但体内半衰期非常短，为了发挥其药效，必须缩短给药周期，从而预测，发生由于使用过多的药剂而降低功效的问题。
33.由此，本发明人研发了通过增强lrrd2的体内半衰期来改善其功效的hsa
‑
slit3 lrrd2融合蛋白，从而寻求如上所述的问题的解决方案。本发明的与白蛋白结合的slit3蛋白的lrrd2示出与未与白蛋白结合的slit3蛋白的lrrd2相同的细胞学功效，与未与白蛋白结合的slit3蛋白的lrrd2相比，体内半衰期显著增加，由此可更有效地预防或治疗肌肉相关疾病。
34.以下，更详细地说明本发明。
35.本发明提供与白蛋白结合的slit3蛋白的lrrd2的融合蛋白。
36.在本发明的融合蛋白中，“slit3蛋白的lrrd2”是指slit3蛋白内的第二个富亮氨酸重复结构域(leucine rich repeat domain，lrrd2)。本发明人通过之前的研究确认，slit3蛋白或其蛋白质内的lrrd2与robo1或robo2受体结合，来通过slit
‑
robo系统使与成肌细胞的m
‑
钙粘蛋白(m
‑
cadherin)结合的β
‑
连环蛋白(β
‑
catenin)游离来激活β
‑
连环蛋白，增加肌细胞生成素(myogenin)的表达来诱导成肌细胞(myoblast)的分化，从而促进肌肉形成。在本发明中，术语“slit3lrrd2”是指“slit3蛋白的lrrd2”，可互换来使用。
37.在本发明的融合蛋白中，上述白蛋白可以为人血清白蛋白、恒河猴(rhesus)血清白蛋白(rhsa)、食蟹猴(cynomolgous monkey)血清白蛋白(cysa)或者小鼠(murine)血清白蛋白(musa)，优选为人血清白蛋白。在上述slit3 lrrd2中，存在人血清白蛋白时的slit3 lrrd2的体内半衰期与不存在人血清白蛋白时的slit3 lrrd2的体内半衰期相比至少长10倍。在本发明的一具体实施例中，存在人血清白蛋白时的slit3 lrrd2的血清半衰期与不存在人血清白蛋白时的slit3lrrd2相比长14倍。
38.本发明的融合蛋白可按照人血清白蛋白及slit3 lrrd2的顺序结合，或者按照其相反顺序结合。优选地，按照人血清白蛋白及slit3 lrrd2的顺序结合。例如，当人血清白蛋白与slit3 lrrd2的n末端结合时，slit3 lrrd2的体内半衰期及其肌肉疾病相关功效最优秀，当人血清白蛋白与c末端结合时，可具有程度差异，但可示出有效的功效。
39.在本发明的融合蛋白中，上述人血清白蛋白可用作包含由609个氨基酸组成的全长或其一部分氨基酸序列的片段。人血清白蛋白的全长氨基酸序列在ncbi genbank:aaa98797.1中公开，在本发明的一具体实施例中，使用在由609个氨基酸组成的全长人血清白蛋白中由第25个至第609个氨基酸(585个氨基酸)组成的片段的形态。在本发明的融合蛋白中，人血清白蛋白由下述seq id no:2的氨基酸序列组成。
40.dahksevahrfkdlgeenfkalvliafaqylqqcpfedhvklvnevtefaktcvadesaencdkslhtlfgdklctvatlretygemadccakqepernecflqhkddnpnlprlvrpevdvmctafhdneetflkkylyeiarrhpyfyapellffakrykaafteccqaadkaacllpkldelrdegkassakqrlkcaslqkfgerafkawavarlsqrfpkaefaevsklvtdltkvhtecchgdllecaddradlakyicenqdsissklkeccekpllekshciaevendempadlpslaadfveskdvcknyaeakdvflgmflyeyarrhpdysvvlllrlaktyettlekccaaadphecyakvfdefkplveepqnlikqncelfeqlgeykfqnallvrytkkvpqvstptlvevsrnlgkvgskcckhpeakrmpcaedylsvvlnqlcvlhektpvsdrvtkccteslvnrrpcfsalevdetyvpkefnaetftfhadictlsekerqik
kqtalvelvkhkpkatkeqlkavmddfaafvekcckaddketcfaeegkklvaasqaalgl(seq id no:2)
41.在本发明的融合蛋白中，上述slit3 lrrd2是人源性的，可用作包含由1523个氨基酸组成的slit3蛋白内的lrrd2的全长或其一部分氨基酸序列的片段。slit3蛋白的全长氨基酸序列在ncbi genbank:aaq89243.1中公开，在本发明的一具体实施例中，slit3 lrrd2使用在由1523个氨基酸组成的全长slit3蛋白中由第278个至第486个氨基酸(209个氨基酸)组成的片段的形态。在本发明的融合蛋白中，slit3 lrrd2由下述seq id no:3的氨基酸序列组成。
42.iscpspctcsnnivdcrgkglmeipanlpegiveirleqnsikaipagaftqykklkridisknqisdiapdafqglksltslvlygnkiteiakglfdglvslqllllnankinclrvntfqdlqnlnllslydnklqtiskglfaplqsiqtlhlaqnpfvcdchlkwladylqdnpietsgarcssprrlankrisqikskkfrcs(seq id no:3)
43.在本发明的融合蛋白中，“slit3 lrrd2”可包含与seq id no:3的氨基酸序列的功能等价物。
44.上述“功能等价物”是指如下的蛋白质或肽：由于蛋白质或肽的氨基酸附加、取代或缺失，与本发明的seq id no:1至seq id no:4的氨基酸序列至少具有70％以上的序列同源性，优选地，具有80％以上的序列同源性，更优选地，具有90％以上的序列同源性，更加优选地，具有95％以上的序列同源性，示出与由seq id no:1至seq id no:4的氨基酸序列组成的蛋白质或肽实质上相同的生理活性。
45.具体地，上述融合蛋白不仅可包含具有其野生型氨基酸序列的蛋白质或肽，其氨基酸序列变体也可包含在本发明的范围内。上述氨基酸序列变体是指slit3 lrrd2的野生型氨基酸序列通过一种以上的氨基酸残基的缺失、插入、非保守或保守取代或它们的组合具有不同序列的蛋白质或肽。
46.可在整体上不变更分子活性的蛋白质及肽中交换氨基酸是本领域公知的(h.neurath,r.l.hill,the proteins,academic press,new york,1979)。最常见的交换是氨基酸残基ala/ser、val/ile、asp/glu、thr/ser、ala/gly、ala/thr、ser/asn、ala/val、ser/gly、thy/phe、ala/pro、lys/arg、asp/asn、leu/ile、leu/val、ala/glu、asp/gly之间的交换。根据情况还可通过磷酸化(phosphorylation)、硫化(sulfation)、乙酰化(acetylation)、糖基化(glycosylation)、甲基化(methylation)、法尼基化(farnesylation)等修饰(modification)。
47.本发明的slit3 lrrd2或其变体从天然提取或合成(merrifleld,j.amer.chem.soc.85:2149
‑
2156,1963)或者可通过基于脱氧核糖核酸(dna)序列的基因重组方法制备(sambrook et al,molecular cloning,cold spring harbour labor atory press,new york,usa,第2版,1989)。
48.为了增强其体内半衰期，除白蛋白融合之外，本发明的slit3 lrrd2可执行免疫球蛋白g(igg)的fc蛋白融合或聚乙二醇化(pegylation)等。
49.在本发明的融合蛋白中，在白蛋白与slit3蛋白的lrrd2之间还可包含连接子。优选的连接子的种类可以为(ggggs)n(seq id no:5)，其中，n可以为1至10的整数，优选地，n可以为1至5的整数。
50.并且，本发明提供核酸分子，其编码slit3 lrrd2的n末端与人血清白蛋白连接的
形态的融合蛋白，而且，在上述人血清白蛋白的n末端可连接有胱抑素s。
51.在本发明的核酸分子中，胱抑素s为信号肽，编码上述胱抑素s的碱基序列与编码人血清白蛋白的碱基序列的5'末端连接，编码上述人血清白蛋白的碱基序列与编码slit3 lrrd2的碱基序列的5'末端连接，由此可生产胱抑素s
‑
hsa
‑
slit3lrrd2。
52.在本发明的核酸分子中，上述胱抑素s是人源性的，可用作编码由141个氨基酸组成的全长或其一部分氨基酸序列的碱基序列。胱抑素s的全长氨基酸序列在ncbi genbank:eax10135.1中公开，在本发明的一具体实施例中，使用编码由141个氨基酸组成的全长胱抑素s中的第1个至第20个氨基酸(20个氨基酸)组成的片段的碱基序列。在本发明的核酸分子中，胱抑素s为编码下述seq id no:1的氨基酸序列的碱基序列。
53.marplctllllmatlagala(seq id no:1)
54.并且，本发明提供包含编码上述融合蛋白的碱基序列及与上述碱基序列功能性连接的启动子的重组载体。
55.术语“功能性连接”是指核酸表达调节序列(启动子、信号序列或转录调节因子结合位点的阵列)与二级碱基序列之间功能性连接，上述表达调节序列影响与二级序列相应的核酸的转录和/或翻译。
56.如在文献[sambrook et al.,molecular cloning,a laboratory manual,cold spring harbor laboratory press(2001)]中所记载，可根据本领域周知的方法制备本发明的载体系统。
[0057]
通常，载体能够以克隆或表达的目的制备。并且，载体可为了在真核或原核宿主细胞中使用而制备。例如，若载体为了在原核细胞中表达而制备，则包含用于启动转录的强启动子(例，plλ启动子、trp启动子、lac启动子、tac启动子及t7启动子)、核糖体结合位点或翻译起始及转录/翻译终止序列。尤其，当将大肠杆菌(e.coli)用作宿主细胞时，为了生物合成位于大肠杆菌的色氨酸，可将启动子及位于操纵子的操纵基因(yanofsky,c.,j.bacteriol.,158:1018
‑
1024(1984))及噬菌体λ的左侧方向启动子(plλ启动子，herskowitz,i.and hagen,d.,ann.rev.genet.,14:399
‑
445(1980))用作调节序列。当将芽孢杆菌用作宿主细胞时，可将编码苏云金芽孢杆菌的毒素蛋白的基因的启动子(appl.environ.microbiol.64:3932
‑
3938(1998)；and mol.gen.genet.250:734
‑
741(1996))或位于芽孢杆菌的其他可操作的启动子用作调节序列。
[0058]
可在原核细胞中使用的诸多常规载体是普通技术人员周知的，选择适当载体是筛选问题。在本发明中使用的常规载体包括psc101、pgv1106、pacyc177、cole1、pkt230、pme290、pbr322、puc8/9、puc6、pbd9、phc79、pij61、plafr1、phv14、pgex series、pet series、puc19、λgt
·
4λb、λ
‑
charon、λδz1及m13，但并不限定于此。
[0059]
例如，当为了真核宿主细胞而制备载体时，其中，可使用动物细胞、源自哺乳动物细胞的基因组的启动子(例，金属硫蛋白启动子)或者源自哺乳动物病毒(例，腺病毒晚期启动子、牛痘病毒7.5k启动子、sv40启动子、巨细胞病毒启动子及hsv的tk启动子)的启动子。载体通常包含转录体的聚腺苷酸化位点。市售的基于病毒的载体的例有pcdna 3(invitrogen；包含巨细胞病毒启动子及聚腺苷酸化信号)、psi(promega；包含sv 40启动子及聚腺苷酸化信号)、pci(promega；包含巨细胞病毒启动子及聚腺苷酸化信号)以及prep7(invitrogen；包含rsv启动子及sv 40聚腺苷酸化信号)。
[0060]
当对于酵母制备载体时，可将对于磷酸甘油酸激酶、甘油醛
‑3‑
磷酸脱氢酶、乳糖酶、烯醇酶及醇脱氢酶的基因的启动子用作调节序列。
[0061]
当对于植物细胞制备表达载体时，可使用本领域周知的各种植物功能启动子，包括花椰菜花叶病毒(camv)35s启动子、玄参花叶病毒35s启动子、甘蔗杆状病毒启动子、鸭跖草黄斑驳病毒启动子、源自核酮糖
‑
1,5
‑
双
‑
磷酸羧化酶的亚单位(ssrubisco)的光
‑
诱导性启动子、水稻胞质磷酸丙糖异构酶(tpi)启动子、源自拟南芥(arabidopsis)的腺嘌呤磷酸核糖转移酶(aprt)启动子、水稻肌动蛋白1基因启动子以及甘露碱合酶及章鱼碱合成酶启动子。
[0062]
并且，本发明的重组载体包含可简单分离所表达的融合蛋白的碱基序列，包括谷胱甘肽s
‑
转移酶(pharmacia，usa)、麦芽糖结合蛋白(neb，usa)、flag(ibi，usa)及6x his(六聚组氨酸(hexahistidine)；quiagen，usa)，但并不限定于此。由于这种追加序列，可通过快速且简单的方法通过亲和层析分离所表达的融合蛋白。
[0063]
在本发明的一具体实施例中，使用flag序列，flag蛋白包含seq id no:4的氨基酸序列。seq id no:4的氨基酸序列如下。
[0064]
dykddddk(seq id no:4)
[0065]
根据本发明的另一实例，通过亲和层析分离融合蛋白。例如，在谷胱甘肽s
‑
转移酶的情况下，使用包含谷胱甘肽的洗脱缓冲液，在为了快速且简单地分离外源蛋白质而使用6x his的情况下，使用ni
‑
nta his
‑
结合树脂(novagen，usa)。
[0066]
优选地，本发明的表达载体包含可筛选转化的宿主的一种或一种以上的标记物，例如，具有对于如氨苄青霉素、庆大霉素、氯霉素、链霉素、卡那霉素、新霉素、遗传霉素及四环素的抗生素具有抗性的基因、ura3基因、对于如金属离子的其他毒性化合物具有抗性的基因。
[0067]
并且，本发明提供包含在上文中记载的本发明的重组载体的转化体。
[0068]
能够有效制备转化体的宿主在本领域是周知的。例如，可使用原核细胞宿主、大肠杆菌jm109、大肠杆菌bl21、大肠杆菌rr1、大肠杆菌le392、大肠杆菌b、大肠杆菌x 1776、大肠杆菌w3110、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、粘质沙雷氏菌及各种假单胞菌、棒状杆菌及链霉菌。
[0069]
在真核细胞中，可使用酵母(酿酒酵母)、昆虫细胞、人类细胞(例，cho、w138、bhk、cos
‑
7、293、hepg2、3t3、rin及mdck细胞株)及植物细胞。
[0070]
宿主细胞的转化可通过本领域周知的多种方法执行。例如，当使用原核细胞作为宿主细胞时，可将cacl2方法、汉森方法(cohen,s.n.et al.,proc.natl.acac.sci.usa,9:2110
‑
2114(1973)；and hanahan,d.,j.mol.biol.,166:557
‑
580(1983))及电泳用于转化。并且，当使用真核细胞作为宿主细胞时，可将显微注射、磷酸钙沉淀、电击、脂质体介导的转染、deae
‑
葡聚糖处理法及颗粒碰撞法用于转化。并且，当使用植物细胞作为宿主细胞时，最优选的方法为土壤杆菌属介导的转化，这是因为提供为了从原生质体再分化相邻的植物所需的旁路。
[0071]
并且，本发明提供生产hsa
‑
slit3 lrrd2的融合蛋白的方法。上述方法包括：步骤(a)，在用于表达在上文中记载的转化体的条件下培养上述转化体；以及步骤(b)，获取所生产的融合蛋白。
[0072]
本发明的用于制备融合蛋白的转化体的培养可通过本领域周知的适当培养基和培养条件进行。只要是普通技术人员，可根据选择的菌株容易调整来使用这种培养过程。细胞培养根据细胞的生长方式分为悬浮培养和附着培养，根据培养方法分为分批式、补料分批式及连续培养式的方法。用于培养的培养基需适当满足特定菌株的要求。
[0073]
用于培养动物细胞的上述培养基包含各种碳源、氮源及微量元素成分。可使用的碳源的例包括如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉及纤维素的碳水化合物、如大豆油、葵花油、蓖麻油及椰子油的脂肪、如棕榈酸、硬脂酸及亚油酸的脂肪酸、如甘油及乙醇的醇以及如乙酸的有机酸。这些碳源可单独使用或组合来使用。可使用的氮源的例包括如蛋白胨、酵母提取物、肉汤、麦芽提取物、玉米浸渍液(csl)及大豆小麦的有机氮源以及如尿素、硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵及硝酸铵的无机氮源。这些氮源可单独使用或组合来使用。上述培养基可包含磷酸二氢钾、磷酸氢二钾及相应的含钠盐作为磷源。并且，可包含如硫酸镁或硫酸铁的金属盐。除此之外，可包含氨基酸、维生素及适当的前体等。
[0074]
在培养过程中，可通过适当的方式向培养物添加如氢氧化铵、氢氧化钾、氨、磷酸及硫酸的化合物来调整培养物的ph值。并且，在培养过程中，可通过使用如脂肪酸聚乙二醇酯的消泡剂来抑制气泡的生成。并且，为了保持培养物的好氧状态，向培养物内注入氧或含氧气体(例，空气)。培养物的温度通常为20℃至45℃，优选为25℃至40℃。
[0075]
在本发明的生产hsa
‑
slit3 lrrd2的融合蛋白的方法中，上述步骤(b)的获取可为了获取分离形态的融合蛋白而执行。例如，在融合蛋白被大容量转化的细菌表达的情况下，通常在诱导启动子后表达，但表达持续且蛋白质形成不溶性沉淀物(即，包涵体)。有几种适合分离包涵体的几种方案。用于形成包涵体的融合蛋白可利用适当的缓冲液且通过稀释或透析再次形成。之后，融合蛋白可使用硫酸铵、尺寸差异过滤(超滤)及柱层析(取决于大小、净表面电荷、疏水性或亲和力)且通过溶解度分级的本领域周知的常规方法执行。
[0076]
本发明的融合蛋白可在植物中表达。植物细胞的转化可根据本领域周知的常规方法执行，可根据电击、颗粒碰撞及土壤杆菌属
‑
诱导的转化执行。其中，最优选为土壤杆菌属
‑
诱导的转化。土壤杆菌属
‑
诱导的转化通常可利用如叶切片及子叶及胚轴的其他组织执行。
[0077]
转化的细胞的筛选可将转化的培养暴露于如代谢抑制剂(metabolic inhibitor)、抗生素及除草剂的筛选制剂来执行。若细胞被转化且稳定表达对于筛选基因具有抗性的标记物基因，则在培养过程中生长及分化。例如，标记物有糖磷酸抗性基因及新霉素磷酸转移酶(nptii)系统，但并不限定于此。从植物原生质体或各种外源物质的植物的发育或再分化在本领域是周知的。将生产的转化生根的新芽置于适合的植物生长培养基。包含通过土壤杆菌属诱导的外源基因的植物的发育或再分化可通过本领域周知的方法执行。
[0078]
本发明提供包含与白蛋白结合的slit3蛋白的lrrd2的用于预防或治疗肌肉疾病的药学组合物。
[0079]
本发明的药学组合物可以为各种口服剂型或肠胃外剂型。当将上述药学组合物剂型化时，可通过使用一种以上的缓冲剂(例如，生理盐水或磷酸盐缓冲液(pbs))、抗氧化剂、抑菌剂、络合剂(例如，乙二胺四乙酸(edta)或谷胱甘肽)、填充剂、增量剂、结合剂、佐剂(例如，氢氧化铝)、悬浮剂、增稠剂、湿润剂、崩解剂或表面活性剂、稀释剂或赋形剂来配制。
[0080]
用于口服给药的固体制剂包括片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂等，这种固体制剂可通过向一种以上的化合物混合一种以上的赋形剂来配制，上述赋形剂可例举淀粉(包括玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉等)、碳酸钙(calcium carbonate)、蔗糖(sucrose)、乳糖(lactose)、右旋糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠及羟丙基甲基纤维素或明胶等。例如，将活性成分与固体赋形剂混合后粉碎其，添加适合的辅助剂后加工成颗粒混合物，由此可获取片剂或糖衣丸。
[0081]
并且，除简单的赋形剂之外，还使用如硬脂酸镁、滑石粉等的润滑剂。用于口服给药的液相制剂有悬浮剂、口服溶液、乳剂或糖浆剂等，除经常使用的简单稀释剂的水、液体石蜡之外，还可包含各种赋形剂，例如湿润剂、甜味剂、芳香剂或保存剂等。并且，可根据情况添加交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、海藻酸或海藻酸钠等作为崩解剂，还可包含如抗凝剂、润滑剂、湿润剂、香料、乳化剂及防腐剂等。
[0082]
用于肠胃外给药的制剂包括无菌水溶液、非水溶剂、悬浮溶剂、乳剂、冻干制剂或栓剂等。可使用丙二醇(propylene glycol)、聚乙二醇、如橄榄油的植物油、如油酸乙酯的可注射的酯等作为非水溶剂及悬浮溶剂。可使用witepsol、聚乙二醇(macrogol)、吐温(tween)61、可可脂、月桂脂、甘油、明胶等作为栓剂的基质。
[0083]
本发明的药学组合物可口服给药或肠胃外给药，当肠胃外给药时，可根据本领域公知的方法剂型化为如下形态：皮肤外用；腹腔内注射、直肠注射、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、子宫内注射、硬膜注射或脑血管内注射的注射剂；透皮给药剂；或者鼻腔吸入剂。
[0084]
在上述注射剂的情况下，必须进行消毒，并保护其免受如细菌及真菌的微生物的污染。在注射剂的情况下，适合的载体可例举水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇及液体聚乙二醇等)、它们的混合物和/或包含植物油的溶剂或分散介质，但并不限定于此。更优选地，适合的载体可使用hanks溶液、林格氏液、包含三乙醇胺的磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline)或如注射用无菌水、10％乙醇、40％丙二醇及5％葡萄糖的等渗溶液等。为了保护上述注射剂免受微生物的污染，还可包含如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等的抗菌剂及抗真菌剂。并且，在大部分的情况下，上述注射剂还可包含如糖或氯化钠等的等渗剂。
[0085]
在透皮给药剂的情况下，包括软膏剂、霜剂、乳剂、凝胶剂、外用溶液剂、糊剂、搽剂、气雾剂等形态。在上文中，透皮给药是指将药学组合物局部给药至皮肤来使得包含在药学组合物的有效量的活性成分传递至皮肤中。
[0086]
在吸入给药剂的情况下，根据本发明使用的融合蛋白可使用适合的推进剂，例如二氯氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他适合的气体，由此可便利地从加压包或雾化器以气溶胶喷雾形态传递。在加压气溶胶的情况下，可提供传递计量的量的阀来确定给药单位。例如，用于吸入器或吹入器的明胶胶囊及药筒可剂型化为包含化合物及乳糖或如淀粉的适合的粉末基质的粉末混合物。用于肠胃外给药的剂型记载于通常在所有制药化学中公知的处方文献(remi ngton's pharmaceutical science,15th edition,1975.mack publishing company,easton,pennsylvania 18042,chapter 87:blaug,seymour)。
[0087]
本发明的药学组合物以药剂学有效量给药。在本发明中，“药剂学有效量”是指足
以能够以适用于医学治疗的合理的获益/风险比例治疗疾病的量，有效剂量水平可根据包括患者的疾病种类、严重程度、药物的活性、对于药物的敏感性、给药时间、给药途径及排泄率、治疗时间、同时使用的药物在内的因素及其他医学领域中周知的因素确定。本发明的药学组合物可作为单独治疗剂给药或可与其他治疗剂组合给药，可与现有的治疗剂依次给药或同时给药，可单次给药或多次给药。即，本发明组合物的总有效量能够以单剂量(single dose)给药至患者，可通过多剂量(multiple dose)长期给药的分次治疗方法(fractionated treatment protocol)给药。考虑如上所述的所有因素，重要的是以无副作用的最小量获取最大效果的量给药，普通技术人员可容易确定其。
[0088]
本发明药学组合物的剂量的范围根据患者的体重、年龄、性别、健康状态、饮食、给药时间、给药方法、排泄率及疾病的严重程度不同。作为一日剂量，当肠胃外给药时，以hsa
‑
slit3 lrrd2为基准，优选地，每1kg的体重每天给药0.01mg至50mg，更优选地，给药0.1mg至30mg的量，并且，当口服给药时，以本发明的hsa
‑
slit3 lrrd2为基准，优选地，每1kg的体重每天给药0.01mg至100mg，更优选地，给药0.01mg至10mg的量，可每天给药一次或多次。但是，可根据给药途径、肥胖的严重程度、性别、体重、年龄等增减，因此，上述剂量不以任何方法限定本发明的范围。
[0089]
本发明的药学组合物可单独使用，或者可与手术、放射疗法、激素疗法、化学疗法及使用生物反应调节剂的方法组合使用。
[0090]
本发明的药学组合物还能够以外用剂的剂型提供。当将本发明的用于预防及治疗肌肉疾病的药学组合物用作皮肤外用剂时，还可包含脂肪物质、有机溶剂、增溶剂、增稠剂及凝胶剂、软化剂、抗氧化剂、悬浮剂、稳定剂、发泡剂(foaming agent)、芳香剂、表面活性剂、水、离子型乳化剂、非离子型乳化剂、填充剂、螯合剂、络合剂、保存剂、维生素、阻断剂、湿润剂、精油、染料、颜料、亲水活性剂、亲油活性剂或脂囊泡等如在皮肤外用剂中通常使用的任意其他成分的在皮肤科学领域中通常使用的助剂。并且，上述成分能够以在皮肤科学领域中通常使用的量引入。
[0091]
在本发明的用于预防及治疗肌肉疾病的药学组合物作为皮肤外用剂提供的情况下，可以为软膏、贴剂、凝胶、霜剂或喷雾剂等的剂型，但并不局限于此。
[0092]
本发明的肌肉疾病为肌肉功能降低、肌肉萎缩或肌肉退化引起的肌肉疾病，优选为本领域报告的疾病，具体地，更优选为选自由张力缺乏、肌萎缩症、肌营养不良症、肌肉退化、肌无力症、恶病质及肌肉减少症组成的组中的一种以上，但并不限定于此。
[0093]
上述肌肉萎缩或退化由于先天因素、后天因素、衰老等原因发生，肌肉萎缩的特征在于，肌肉量的逐渐减少、肌肉的弱化及退行，尤其，骨骼肌或横纹肌及心肌的弱化及退行。
[0094]
更具体地，上述肌肉为肌腱、肌肉、腱的统称，肌功能或肌肉功能是指可通过肌肉的收缩发挥力的能力，包括：肌肉为了克服肌肉的阻力而发挥最大限度的收缩力的肌肉力量；示出作为肌肉可在给定的重量下重复多久的收缩或松弛或者重复多少次的收缩或松弛的能力的肌肉耐力；以及作为可在短时间内发挥强大力量的爆发力。上述肌功能与肌肉量成比，术语肌功能改善是指以更加积极的方向改善肌功能。
[0095]
并且，本发明提供包含与白蛋白结合的slit3蛋白的lrrd2的用于预防或改善肌肉疾病的保健功能食品组合物。包含在本发明的保健功能食品组合物的有效成分的组成及其效果与前述的药学组合物的说明相同，因此将省略其记载。
[0096]
本发明的保健功能食品组合物可根据本领域公知的常规方法制备为各种形态。可在作为普通食品的饮料(包括酒精饮料)、水果及其加工食品(例：水果罐头、瓶装食品、酱、果酱等)、鱼类、肉类及其加工食品(例：火腿、香肠等)、面包类及面类(例：乌冬面、荞麦面、拉面、意大利面、通心粉等)、果汁、各种饮料、饼干、糖浆、乳制品(例：黄油、奶酪等)、食用植物油、人造黄油、植物蛋白、蒸煮食品、冷冻食品、各种调味料(例：大奖、酱油、调味汁等)等添加本发明的hsa
‑
slit3 lrrd2融合蛋白来制备，但并不限定于此。并且，作为营养补充剂可向胶囊、片剂、丸剂等添加本发明的hsa
‑
slit3 lrrd2融合蛋白来制备，但并不限定于此。并且，例如，作为保健功能食品可将本发明的hsa
‑
slit3 lrrd2融合蛋白本身制备为茶、果汁及饮料的形态，来以能够饮用(健康饮料)的方式液相化、颗粒化、胶囊化及粉末化来摄取，但并不限定于此。并且，为了以食品添加剂的形态使用本发明的hsa
‑
slit3 lrrd2融合蛋白，能够以粉末或浓缩液形态制备来使用。并且，可将本发明的hsa
‑
slit3 lrrd2融合蛋白与以具有预防肌肉疾病及改善肌功能效果而周知的公知的活性成分一同混合来制备为组合物的形态。
[0097]
在将本发明的hsa
‑
slit3 lrrd2融合蛋白用作健康饮料的情况下，如通常的饮料，上述健康饮料组合物可包含各种香味剂或天然碳水化合物等作为追加成分。如上所述的天然碳水化合物可以为如葡萄糖、果糖的单糖、如麦芽糖、蔗糖的二糖、如糊精、环糊精的多糖、如木糖醇、山梨糖醇、赤藓糖醇等的糖醇。甜味剂可使用如索马甜、甜菊苷提取物的天然甜味剂、如糖精、阿斯巴甜的合成甜味剂等。通常，每100ml的本发明的组合物的上述天然碳水化合物的比例约为0.01g～0.04g，优选为约0.02g～0.03g。
[0098]
并且，本发明的hsa
‑
slit3 lrrd2融合蛋白可作为用于预防肌肉疾病及改善肌功能的食品组合物的有效成分包含，其量为可实现用于预防肌肉疾病及改善肌功能的作用的有效量，优选地，相对于整个组合物的总重量，为0.01重量百分比至100重量百分比，但并不限定于此。本发明的保健功能食品组合物可通过将hsa
‑
slit3 lrrd2融合蛋白与以对于用于预防肌肉疾病及改善肌功能的组合物有效而周知的其他活性成分混合来制备。
[0099]
除上述之外，本发明的保健功能食品组合物可包含各种营养剂、维生素、电解质、风味剂、着色剂、果胶酸、果胶酸盐、海藻酸、海藻酸盐、有机酸、保护性胶体增稠剂、ph值调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、醇或碳酸化剂等。此外，本发明的健康食品可包含用于制备天然果汁、果汁饮料或蔬菜饮料的果肉。这种成分可单独使用或混合使用。虽并不重要，这种添加剂的比例如下，即，相对于100重量份的本发明的组合物，通常在0.01重量份～0.1重量份的范围内选择。
[0100]
并且，本发明提供包含hsa
‑
slit3 lrrd2融合蛋白的用于改善肌功能的化妆品组合物。包含在本发明的化妆品组合物的有效成分的组成及其效果与前述的药学组合物的说明相同，因此将省略其记载。
[0101]
上述化妆品组合物可用于皮肤外用，但并不局限于此。
[0102]
本发明的化妆品组合物包含hsa
‑
slit3 lrrd2融合蛋白作为有效成分，可与皮肤学可接受的赋形剂一同制备为基础化妆品组合物(化妆水、霜、精华、如洗面奶及卸妆水的洁颜剂、面膜、身体乳等)、彩妆组合物(粉底液、口红、睫毛膏、妆前乳)、美发产品组合物(洗发水、护发素、润发乳、发胶)及香皂等的形态。
[0103]
上述赋形剂可包括如皮肤软化剂、皮肤渗透增强剂、着色剂、芳香剂、乳化剂、稠化
剂及溶剂，但并不限定于此。并且，还可包含香料、色素、杀菌剂、抗氧化剂、防腐剂及保湿剂等，以改善物性为目的可包含增稠剂、无机盐类、合成高分子物质等。例如，在利用本发明的化妆品组合物制备洁颜剂及香皂的情况下，可通过向常规洁颜剂及皂基中添加hsa
‑
slit3 lrrd2融合蛋白来容易制备。在制备霜的情况下，可通过向常规水包油(o/w)的霜基添加hsa
‑
slit3 lrrd2融合蛋白来制备。其中，还可添加香料、络合剂、色素、抗氧化剂、防腐剂等和以改善物性为目的的蛋白质、矿物质、维生素等合成或天然材料。
[0104]
相对于整个组合物的总重量，包含在本发明的化妆品组合物的hsa
‑
slit3 lrrd2融合蛋白的含量优选为0.001重量百分比至10重量百分比，更优选为0.01重量百分比至5重量百分比，但并不限定于此。当上述含量小于0.001重量百分比时，无法期待所目的的效果，当上述含量大于10重量百分比时，可能在安全性或剂型方面存在困难。
[0105]
并且，本发明提供包含与白蛋白结合的slit3蛋白的lrrd2的用于改善肌功能的饲料添加物。包含在本发明的饲料添加物的有效成分的组成及其效果与前述的药学组合物的说明相同，因此将省略其记载。
[0106]
本发明的饲料添加物相当于饲料管理法上的辅助饲料。
[0107]
在本发明中，术语“饲料”是指用于使动物食用、摄取且消化或适合于其的任意天然或人工规定食、或一餐食等或上述一餐食的成分。
[0108]
上述饲料的种类并不特别受限，可使用在本技术领域中通常使用的饲料。作为上述饲料的非限制性例，可例举如谷物类、坚果类、食品加工副产品类、藻类、纤维类、制药副产物类、油脂类、淀粉类、葫芦类或谷物副产品类等的植物饲料以及如蛋白质类、无机物类、油脂类、矿物类、单细胞蛋白类、浮游动物类或食物等的动物饲料。它们可单独使用或混合两种以上来使用。
[0109]
并且，上述饲料添加物还可包含单位动物可接受的载体。在本发明中，可直接添加上述饲料添加物或者可添加公知的载体、稳定剂等，可根据需求添加维生素、氨基酸、矿物质等的各种养分、抗氧化剂及其他添加剂等，其形状可以为粉末、颗粒、小丸、悬浮液等的适当状态。当供给本发明的饲料添加物时，对于单位动物可单独供给或与饲料混合来供给。
[0110]
并且，本发明提供包含与白蛋白结合的slit3蛋白的lrrd2的用于增强slit3蛋白的lrrd2的体内半衰期的组合物。
[0111]
以下，通过实施例更详细地说明本发明。这些实施仅用于例示本发明，不应解释为本发明的范围局限于这些实施例，这对普通技术人员而言是显而易见的。
[0112]
在下述实施例中使用的简称及其含义如下述表1所示。
[0113]
表1
[0114][0115]
本发明的实施方式
[0116]
实施例1
[0117]
制备hsa
‑
slit3 lrrd2融合蛋白
[0118]
在expi293f悬浮液细胞转染1.6mg/ml的pc dna 3.1载体sp胱抑素s
‑
hsa
‑
slit3 lrr d2
‑
flag dna来进行表达。在125ml的293f细胞悬浮液中，将细胞培养至4.5
×
106细胞/ml～5
×
106细胞/ml为止，仅更换新培养基后，将400μl的expifectamine和7.5ml的opti
‑
mem(a样品)在常温条件下反应5分钟，将150ug的dna、7.5ml的opti
‑
mem(b样品)在常温条件下反应5分钟后，将a样品和b样品相混合来在常温条件下反应20分钟并进行转染。24小时后，将增强子1和增强子2混合处理后培养7天。
[0119]
对于培养7天的培养液，通过离心机在4℃的温度、8000rpm的条件下将细胞沉淀20分钟后，利用康宁(corning)公司的0.22μm的过滤器过滤上清液来使用。作为树脂，使用sigma公司的抗
‑
flag树脂来进行。树脂分别使用1.2ml，在4℃的温度、1ml/分钟的速度下进行纯化。流入树脂的20倍的利用tbs(tris glycine，ph值为7.4)的洗涤缓冲液。当进行洗脱时，混合200μl的sigm a公司的flag肽和9.8ml的tbs来使用，每馏分(fraction)为500μl，共获取8个馏分，收集蛋白质馏分并将缓冲液更换为杜尔贝科磷酸盐缓冲液(dpbs)来浓缩后，测定浓度。
[0120]
图2为示出通过上述过程分离纯化融合蛋白后执行十二烷基硫酸钠
‑
聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果的图，确认了在本实施例中制备的图1中示出的融合蛋白的大小为75kda。
[0121]
实施例2
[0122]
确认各种形态的hsa
‑
slit3 lrrd2融合蛋白的受体结合能力
[0123]2‑
1.制备各种形态的hsa
‑
slit3 lrrd2融合蛋白
[0124]
基于实施例1的制备方法，制备了如下述表2的12种不同的hsa
‑
slit3 lrrd2融合蛋白。连接子使用(ggggs)3(seq id no:6)。
[0125]
表2
[0126][0127][0128]
在表3示出上述12种hsa
‑
slit3 lrrd2融合蛋白的氨基酸序列。
[0129]
表3
[0130]
[0131]
[0132]
[0133]
[0134]
[0135]
[0136][0137]
*在上述表3中，通过下划线表示的序列为连接has与lrrd2的gs连接子，通过粗体表示的序列为连接为了以最终形态表达融合蛋白而在c
‑
末端附加的序列的gs连接子。
[0138]2‑
2.确认各种形态的hsa
‑
slit3 lrrd2融合蛋白的受体结合能力
[0139]
slit3 lrrd2与robo1或robo2受体结合来通过slit
‑
robo系统释放(release)与成肌细胞的m
‑
钙粘蛋白结合的β
‑
连环蛋白并激活β
‑
连环蛋白，通过增加肌细胞生成素的表达来诱导成肌细胞的分化并促进肌肉的形成。因此，在本实施例中，确认了在实施例2
‑
1中制备的12种hsa
‑
slit3 lrrd2融合蛋白的受体结合能力。通过使用酶联免疫吸附测定(elisa)系统来定量12种hsa
‑
slit3 lrrd2融合蛋白与robo1受体的结合能力。详细条件如下。
[0140]
12种hsa
‑
slit3 lrrd2融合蛋白考虑分子量来在4℃的温度下向96
‑
孔微量滴定板(microtiter plates)(nunc公司)涂敷18小时，以使每孔成为0nm、1nm、10nm、100nm、1000nm。使用包含0.05％的吐温20的磷酸盐缓冲液(pbst)洗涤3次涂敷的物质。为了阻断非特异性结合，使用添加有1％的牛血清白蛋白(bsa)的磷酸盐缓冲液在室温条件下阻断2小时。为了去除阻断缓冲液，利用磷酸盐缓冲液洗涤3次。将洗涤后从相应细胞株获取的30ug
的蛋白(裂解缓冲液(lysis buffer)：0.5％的np40、50mm的tris ph值为7.5、150mm的nacl、1mm的乙二胺四乙酸、0.2mm的naf、1mm的na3vo4、1mm的二硫苏糖醇(dtt)、1mm的苯甲基磺酰氟(pmsf)、蛋白酶抑制剂混合物(proteinase inhibitor cocktail))在室温条件下附着2小时。使用磷酸盐缓冲液洗涤3次后，将利用0.1％的牛血清白蛋白以1∶1000稀释的robo1抗体(abcam：ab7279)在室温条件下附着2小时。使用磷酸盐缓冲液洗涤3次后，将利用0.1％的牛血清白蛋白以1∶2000稀释的辣根过氧化物酶(hrp)结合抗体(细胞信号传导(cell signa ling)：7074)在室温条件下附着2小时。利用磷酸盐缓冲液洗涤5次后，利用四甲基联苯胺(tmb)溶液在37℃的温度下反应30分钟。为了终止上述反应，使用100μl的1n h2so4，在450nm的波长下测定吸光度。
[0141]
结果如图3所示，确认了lrrd2
‑
3与lrrd2
‑
6的受体结合能力最为优秀。
[0142]
实施例3
[0143]
小鼠中的slit3 lrrd2及hsa
‑
slit3 lrrd2融合蛋白的药代动力研究
[0144]
在本实施例中，基于实施例2的结果，选择受体结合能力最优秀的lrrd2
‑
3来执行药代动力研究。
[0145]
药代动力学研究为在新药开发过程中的一部分，通过根据时间的体内药物浓度的变化评价来获取与试验药物的吸收、分布、代谢及排泄有关的信息为目标。在本实施例中，单次静脉给药slit3 lrrd2
‑
3及hsa
‑
slit3 lrrd2融合蛋白(lrrd2
‑
3)后，在小鼠中确认药代动力特性。
[0146]3‑
1.化学物质及溶剂
[0147]
从sigma aldrich公司购入在本实施例中使用的卡马西平(carbamazepine)，乙腈和甲醇为hplc级，从j.t.baker公司购入。
[0148]3‑
2.动物及给药条件
[0149]
在本实施例中，使用体重在30g～32.5g范围内的icr类雄性小鼠(6周龄，orientbio inc.,城南，韩国)。实验前，小鼠禁食4小时，并将禁食保持至给药后4小时为止。饲养场以12小时提供明暗，并保持适当温度(20℃～25℃)及湿度(40％～60％)。
[0150]
表4
[0151]
药代动力试验
[0152]
给药物质动物数量剂量slit3 lrrd2410mg/kghsa
‑
slit3 lrrd2(lrrd2
‑
30)335mg/kg总计7
‑
[0153]
将slit3 lrrd2以1mg/ml的容量溶解于磷酸盐缓冲液来准备。在hsa
‑
slit3lrrd2(lrrd2
‑
3)的情况下，考虑分子量，以3.5mg/ml的容量(作为slit3 lrrd2，1mg/ml)溶解于磷酸盐缓冲液来准备。两组剂量均为10ml/kg，通过左侧尾静脉给药。
[0154]3‑
3.药代动力试验
[0155]
在药代动力试验的情况下，通过尾静脉向禁食的小鼠分别给药10mg/kg及35mg/kg的slit3 lrrd2和hsa
‑
slit3 lrrd2(lrrd2
‑
3)。给药后，分别在0.05小时、0.12小时、0.33小时、1小时、3小时、7小时、10小时、24小时、48小时及72小时，用手固定小鼠后，用涂有肝素的毛细管从右侧眼眶静脉丛采集70μl的血液。将采集的血液离心分离5分钟后，分离血浆并直
至分析前为止在
‑
20℃的温度下冷冻保存。
[0156]3‑
4.分析方法
[0157]
在血浆试样中，利用hplc/ms/ms系统定量slit3 lrrd2的浓度。在预处理试样前，利用ni
‑
nta磁珠纯化血浆试样。向纯化的slit3 lrrd2及hsa
‑
slit3lrrd2(lrrd2
‑
3)添加6m的尿素和18mm的二硫苏糖醇(dtt)并改性后，利用225mm的碘乙酰胺诱导烷基化。之后，为了获取信号肽(signature peptide)，添加850ng的重组猪胰蛋白酶(v5117，promega，madison，wi，usa)来在设定为37℃的恒温水箱(water bath)反应24小时。向70μl的反应后生成的胰蛋白酶消化物添加50μl的溶解在meoh的3％的甲酸后，利用旋涡混合器(vortex mixer)将混合试样悬浮10分钟，在13500rpm的条件下离心分离10分钟，取出160μl的上清液并移入分析容器后，将其中的5μl注入至hplc/ms/ms系统来进行分析。
[0158]
详细的分析条件如下。
[0159]
‑
hplc系统：agilent 1100(agilent technologies，santa clara，ca)
[0160]
‑
柱：c
8 3.5μm，2.1*50mm(agilent)
[0161]
‑
流动相(mobile phase)：
[0162]
a：溶解在蒸馏水的0.1％的甲酸
[0163]
b：乙腈
[0164]
(等度洗脱)
[0165][0166]
‑
流速：300μl/min
[0167]
‑
温度：在柱中为20℃，在自动进样器托盘(autosampler tray)中为10℃
[0168]
‑
运行时间：5分钟
[0169]
‑
检测：串联四极质谱仪(api 4000，applied biosystems/mds sciex，foster city，ca，usa)
[0170]
‑
幕气(curtain gas)：20psi
[0171]
‑
离子源气体1(ion source gas 1)：50psi
[0172]
‑
离子源气体2(ion source gas 2)：60psi
[0173]
‑
离子喷雾电压(ionspray voltage)：5500v
[0174]
‑
温度：600℃
[0175]
‑
多反应监测(multiple
‑
reaction
‑
monitoring，mrm)模式：阳性
[0176]
silt3 lrrd2的信号肽(p6)的分子离子被23v的碰撞能量(collision energy)断裂，碰撞气体(collision gas)在设备中设置为“medium(8psi)”。在esi阳性多反应监测模式下检测离子，在m/z 587.97
→
491.50的条件下定量p6。利用a nalyst software version 1.4.2(applied biosystems/mds sciex)进行检测峰值的积分。血浆中的silt3 lrrd2的可定量的范围为1μg/ml～100μg/ml，在hsa
‑
silt3 lrrd2(lrrd2
‑
3)的情况下，为3μg/ml～100μg/ml。在该分析中，slit3lrrd2示出3.29分钟的峰保留时间。
[0177]3‑
5.数据分析
[0178]
利用在上述实施例3
‑
4记载的lc
‑
ms/ms分析法获取根据时间的血浆中的cnc00000的浓度，通过4.2(pharsight corp.,cary，nc，usa)软件的非区划的分析法
(non
‑
compartmental analysis)计算药代动力学参数(pk parameters)。最高浓度(c
max
)和达到最高浓度的时间(t
max
)通过根据血浆药物浓度和时间的曲线随时间获取，耗散速率常数(k
e
)在对数尺度(log scale)的末期(terminal phase)通过线性回归模型计算。通过将ln2除以k
e
来求得半衰期(t
1/2
)，通过线性梯形法则(linear trapezoidal rule)和标准面积外推法(standard area extrapolation method)计算血药浓度与时间曲线下的面积(auc0‑
∞
)及血药时刻与时间曲线下的面积(aumc0‑
∞
)。通过下述式1至式3计算清除率(clearance，cl)和稳态分布容积(steady state volume of distribution，vss)。
[0179]
式1：
[0180][0181]
式2：
[0182]
v
ss
＝mrtxcl
[0183]
式3：
[0184][0185]3‑
6.结果
[0186]
在图4及表5、表6示出根据时间的血浆内slit3 lrrd2及hsa
‑
slit3 lrrd2(lrrd2
‑
3)的浓度，在表7示出药代动力学参数。计算每个个体的相关参数和所有值后以平均示出。参照根据时间的血中浓度模式和动物实验记录，在数据分析中排除具有异常的个体组，用于数据解释的实验组至少为n＝3以上。
[0187]
表5
[0188]
静脉内给药slit3后的血浆浓度
[0189][0190]
*bql：低于定量限时处理为“0”。
[0191]
表6
[0192]
静脉给药hsa
‑
slit3(lrrd2
‑
3)后的血浆浓度
[0193][0194][0195]
*bql：低于定量限时处理为“0”。
[0196]
如可在下述表7确认，hsa
‑
结合slit3 lrrd2(lrrd2
‑
3)示出与slit3 lrrd2相比改善约14倍的半衰期。
[0197]
表7
[0198][0199]
实施例4
[0200]
确认hsa
‑
结合slit3 lrrd2的生物体功效
[0201]
对于9周龄的balbc
‑
nude小鼠，在9周龄切除卵巢后，从11周龄开始处理未与白蛋白结合的slit3 lrrd2或hsa
‑
slit3 lrrd2融合蛋白(lrrd2
‑
3)，共处理4周。各药物通过静脉注射给药，每天给药一次，每周给药5次，slit3 lrrd2每天注射10mg，hsa
‑
结合slit3 lrrd2(lrrd2
‑
3)每天注射37.13mg(slit3lrrd2相当于每天10mg)。给药结束后，摘取比目鱼肌(soleus muscle)并测量肌肉重量，在下述表8示出其结果。
[0202]
表8
[0203]
[0204]
*p<0.05，vs.未处理对照组
[0205]
如表8所示，未与白蛋白结合的slit3 lrrd2和hsa
‑
结合slit3 lrrd2均显著增加比目鱼肌的肌肉量。但是确认了，hsa
‑
结合slit3 lrrd2与未与白蛋白结合的slit3 lrrd2相比示出更强的治疗功效。
[0206]
产业上的可利用性
[0207]
本发明的与白蛋白结合的slit3蛋白的lrrd2示出与未与白蛋白结合的slit3蛋白的lrrd2相同的细胞学功效，与未与白蛋白结合的slit3蛋白的lrrd2相比，显著增加体内半衰期，由此可更加有效地预防或治疗骨相关疾病。
[0208]
支持本发明的韩国国家研究研发项目如下。
[0209]
(1)支持本发明的韩国国家研究研发项目
[0210]
课题唯一编号：2017
‑
1229(hi15c0377010017)
[0211]
部门名：保健福祉部
[0212]
研究管理主管机构：韩国保健产业振兴院
[0213]
研究项目名：疾病中心中介重点研究
[0214]
研究课题名：具有骨形成促进作用的巨核细胞分泌因子发掘
[0215]
贡献率：75/100
[0216]
主办机构：首尔峨山医院
[0217]
研究时间：2017年09月07日～2018年09月06日
[0218]
(2)支持本发明的韩国国家研究研发项目
[0219]
课题唯一编号：2013
‑
2234(hi13c1634060018)
[0220]
部门名：保健福祉部
[0221]
研究管理主管机构：韩国保健产业振兴院
[0222]
研究项目名：疾病中心中介重点研究
[0223]
研究课题名：slit3 lrrd2的药代动力学研究及利用slit3 tg小鼠验证体内毒性
[0224]
贡献率：25/100
[0225]
主办机构：忠南大学产学协力团
[0226]
研究时间：2013年11月01日～2019年06月30日