具有抗菌活性的多肽、包含该多肽的用于预防或治疗败血症的组合物和抗菌组合物的制作方法

1.本发明涉及具有抗菌活性的多肽、包含该多肽的用于预防或治疗败血症的组合物和抗菌组合物等。
2.本技术要求于2019年2月28日提交的韩国专利申请10
‑
2019
‑
0023534和2020年2月26日提交的韩国专利申请10
‑
2020
‑
0023629的优先权和权益，其公开内容通过引用整体并入本文。


背景技术：

3.败血症是一种炎症反应，由脂多糖(lps)过度激活身体的免疫系统引起，脂多糖是细胞壁的组成部分，当身体被致病性革兰氏阴性菌感染时充当毒素，并且败血症可能导致全身感染，或症状严重时可伴有休克。具体来说，败血症一般出现于患有恶性肿瘤、白血病、恶性淋巴瘤、获得性免疫缺陷综合征(aids)、胶原病、肾衰竭、肝病、脑血管疾病、糖尿病等基础疾病的患者或具有体液或细胞免疫缺陷的抵抗力弱的宿主(如接受肾上腺类固醇或抗肿瘤药物的化疗、钴照射等放射治疗或留置导管、血液透析、器官移植和心脏手术等治疗和手术的老年人和早产儿)。败血症已成为进入医院重症监护病房的患者死亡的主要原因，是一种非常严重的疾病，病死率通常在30％以上。尽管医疗技术不断进步，但世界范围内还有许多作为手术后遗症由于感染导致的败血症的案例，新生儿或老人等身体免疫力较弱的人的感染往往会发展为败血症。通常，已知在1000个足月婴儿中有大约3个会发生新生儿败血症，并且其发生率在早产儿中增加3至4倍。
4.虽然败血症通常用抗生素治疗，但在治疗延迟导致大量细菌增殖或被对抗生素具有抗性的菌株感染的情况下，仅用抗生素不能有效治疗。对各种抗生素具有抗性的病原体的数量逐渐增多。为此，迫切需要开发新型败血症治疗剂。
5.同时，抗杀菌剂的细菌是指对特定抗菌剂具有抗性且因此该抗菌剂不起作用的细菌。例如，抗杀菌剂的细菌包括耐青霉素的金黄色葡萄球菌，其导致青霉素完全无效。此外，已知的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)在1961年在学术界首次报道并已成为世界范围内的一个主要致病感染菌，耐万古霉素肠球菌(vre)1988年在欧洲首次发现。此外，对万古霉素(已知为作为人类感染最常见原因的金黄色葡萄球菌的最后的治疗剂)表现出高度抗性的耐万古霉素金黄色葡萄球菌(vrsa)于2002年由美国疾病控制和预防中心首次报道。综上所述，可以看出，所谓的超级细菌的传播正在高度增加。


技术实现要素：

6.技术问题
7.因此，作为满足上述需求的反复研究的结果，发明人证实具有特定氨基酸序列的肽由于去除从死细菌分离出的内毒素的优异效果而有效抑制细菌增殖以及治疗败血症，并选择性地对革兰氏阳性/阴性细菌表现出优异的抗菌活性，从而完成了本发明。
8.相应地，本发明所要解决的技术问题是提供一种具有抗菌活性的肽、含有该肽的用于预防或治疗败血症的组合物、抗菌组合物等。
9.然而，本发明要解决的技术问题不限于上述技术问题，本领域普通技术人员通过以下描述将充分理解本文中未描述的其他问题。
10.技术方案
11.为实现本发明的目的，本发明提供了一种由以下序列通式表示的多肽：
12.[通式]
[0013]
ln
‑
x1
‑
l
‑
x2
‑
v
‑
x3
‑
x4
‑
x5
‑
r
‑
x6
‑
l
‑
x7
[0014]
在通式中，
[0015]
n为0或1；
[0016]
l是亮氨酸；
[0017]
v是缬氨酸；
[0018]
r是精氨酸；
[0019]
x1是赖氨酸(k)或精氨酸(r)；
[0020]
x2是甘氨酸(g)或精氨酸(r)；
[0021]
x3是谷氨酸(e)或赖氨酸(k)；
[0022]
x4是丙氨酸(a)或亮氨酸(l)；
[0023]
x5是赖氨酸(k)或精氨酸(r)；
[0024]
x6是酪氨酸(y)、丙氨酸(a)、色氨酸(w)、赖氨酸(k)或天冬氨酸(d)；和
[0025]
x7是天冬氨酸(d)或精氨酸(r)，
[0026]
然而，在通式中，由k
‑
l
‑
g
‑
v
‑
e
‑
a
‑
k
‑
r
‑
y
‑
l
‑
d的序列表示的多肽被排除。
[0027]
在本发明的一个实施方式中，提供了由以下1)至9)组成的9种类型多肽中的任一种：
[0028]
1)由通式表示的多肽，其中
[0029]
n为0；
[0030]
x1是赖氨酸(k)；
[0031]
x2是甘氨酸(g)；
[0032]
x3是谷氨酸(e)；
[0033]
x4是丙氨酸(a)；
[0034]
x5是赖氨酸(k)；
[0035]
x6是酪氨酸(y)，并且
[0036]
x7是精氨酸(r)；
[0037]
2)由通式表示的多肽，其中
[0038]
n为1；
[0039]
x1是精氨酸(r)；
[0040]
x2是甘氨酸(g)；
[0041]
x3是谷氨酸(e)；
[0042]
x4是丙氨酸(a)；
[0043]
x5是赖氨酸(k)；
[0044]
x6是酪氨酸(y)，并且
[0045]
x7是精氨酸(r)；
[0046]
3)由通式表示的多肽，其中
[0047]
n为1；
[0048]
x1是精氨酸(r)；
[0049]
x2是甘氨酸(g)；
[0050]
x3是谷氨酸(e)；
[0051]
x4是亮氨酸(l)；
[0052]
x5是赖氨酸(k)；
[0053]
x6是酪氨酸(y)，并且
[0054]
x7是精氨酸(r)；
[0055]
4)由通式表示的多肽，其中
[0056]
n为0；
[0057]
x1是赖氨酸(k)；
[0058]
x2是甘氨酸(g)；
[0059]
x3是谷氨酸(e)；
[0060]
x4是丙氨酸(a)；
[0061]
x5是亮氨酸(l)；
[0062]
x6是酪氨酸(y)，并且
[0063]
x7为天冬氨酸(d)；
[0064]
5)由通式表示的多肽，其中
[0065]
n为0；
[0066]
x1是精氨酸(r)；
[0067]
x2是精氨酸(r)；
[0068]
x3是赖氨酸(k)；
[0069]
x4是亮氨酸(l)；
[0070]
x5是精氨酸(r)；
[0071]
x6是酪氨酸(y)，并且
[0072]
x7是精氨酸(r)；
[0073]
6)由通式表示的多肽，其中
[0074]
n为0；
[0075]
x1是赖氨酸(k)；
[0076]
x2是精氨酸(r)；
[0077]
x3是赖氨酸(k)；
[0078]
x4是亮氨酸(l)；
[0079]
x5是精氨酸(r)；
[0080]
x6是酪氨酸(y)，并且
[0081]
x7是精氨酸(r)；
[0082]
7)由通式表示的多肽，其中
[0083]
n为0；
[0084]
x1是赖氨酸(k)；
[0085]
x2是精氨酸(r)；
[0086]
x3是赖氨酸(k)；
[0087]
x4是亮氨酸(l)；
[0088]
x5是精氨酸(r)；
[0089]
x6是丙氨酸(a)，并且
[0090]
x7是精氨酸(r)；
[0091]
8)由通式表示的多肽，其中
[0092]
n为0；
[0093]
x1是赖氨酸(k)；
[0094]
x2是精氨酸(r)；
[0095]
x3是赖氨酸(k)；
[0096]
x4是亮氨酸(l)；
[0097]
x5是精氨酸(r)；
[0098]
x6是色氨酸(w)，并且
[0099]
x7是精氨酸(r)；和
[0100]
9)由通式表示的多肽，其中
[0101]
n为0；
[0102]
x1是赖氨酸(k)；
[0103]
x2是精氨酸(r)；
[0104]
x3是赖氨酸(k)；
[0105]
x4是亮氨酸(l)；
[0106]
x5是精氨酸(r)；
[0107]
x6是赖氨酸(k)，并且
[0108]
x7是精氨酸(r)。
[0109]
在本发明的一个实施方式中，多肽是指包括l型肽、d型肽和类肽的模拟肽，或非天然氨基酸。
[0110]
在本发明的一个实施方式中，多肽的末端被烷基化、聚乙二醇化或酰胺化。
[0111]
在本发明的一个实施方式中，胺基(nh2)被添加到多肽的c
‑
末端。
[0112]
在本发明的一个实施方式中，多肽具有以下一项或多项特征：
[0113]
与革兰氏阴性菌的脂多糖(lps)的结合能力；
[0114]
对细菌细胞膜的选择性破坏能力；
[0115]
对蛋白水解酶的抗性；
[0116]
对革兰氏阳性菌的细胞膜破坏能力；和
[0117]
与革兰氏阳性菌衍生的脂磷壁酸(lta)或脂蛋白(lpp)的结合能力。
[0118]
此外，本发明提供了由序列通式表示的多肽的三氟乙酸(tfa)的乙酸盐取代物。
[0119]
此外，本发明提供了一种用于预防、减轻或治疗败血症的组合物，其包括由序列通式表示的多肽或其三氟乙酸的乙酸盐取代物作为活性成分。
[0120]
此外，本发明提供了一种用于预防、减轻或治疗败血症的药物/食品/保健食品/化妆品/准药物/饲料组合物，其包括由序列通式表示的多肽或其三氟乙酸的乙酸盐取代物作为活性成分。
[0121]
本发明提供了一种预防或治疗败血症的方法，其包括将序列通式表示的多肽或其三氟乙酸的乙酸盐取代物施用于有需要的受试者。
[0122]
此外，本发明提供了由序列通式表示的多肽或其三氟乙酸的乙酸盐取代物用于预防、减轻或治疗败血症的用途。
[0123]
进一步地，本发明提供了由序列通式表示的多肽或其三氟乙酸的乙酸盐取代物用于制备预防、减轻或治疗败血症的制剂的用途。
[0124]
此外，本发明提供了一种抗菌组合物，其包括由序列通式表示的多肽或其三氟乙酸的乙酸盐取代物作为活性成分。
[0125]
此外，本发明提供了一种抗菌药物/食品/保健食品/化妆品/准药物/饲料组合物，其包括由序列通式表示的多肽或其三氟乙酸的乙酸盐取代物作为活性成分。
[0126]
本发明提供一种抗菌方法，其包括将由序列通式表示的多肽或其三氟乙酸的乙酸盐取代物施用于有需要的受试者。
[0127]
此外，本发明提供了由序列通式表示的多肽或其三氟乙酸的乙酸盐取代物的抗菌用途。
[0128]
进一步地，本发明提供了由序列通式表示的多肽或其三氟乙酸的乙酸盐取代物用于制备抗菌剂的用途。
[0129]
在本发明的一个实施方式中，抗菌组合物所针对的细菌包括选自由大肠杆菌dh5α、大肠杆菌k1、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌组成的组中的一种或多种类型。
[0130]
在本发明的一个实施方式中，抗菌组合物所针对的细菌包括一种或多种类型的耐抗生素细菌，其选自由耐超广谱β内酰胺酶(esbl)细菌、耐碳青霉烯类细菌和耐粘菌素细菌组成的组.
[0131]
在本发明的一个实施方式中，所述耐抗生素细菌包括选自由esbl(大肠杆菌)、耐碳青霉烯(cr)
‑
鲍曼不动杆菌、cr
‑
肺炎克雷伯菌、cr
‑
铜绿假单胞菌和耐粘菌素鲍曼不动杆菌组成的组中的一种或多种类型。
[0132]
此外，本发明提供一种用于预防、减轻或治疗传染病的组合物，其包括由序列通式表示的多肽或其三氟乙酸的乙酸盐取代物作为活性成分。
[0133]
此外，本发明提供了一种用于预防、减轻或治疗传染病的药物/食品/保健食品/化妆品/准药物/饲料组合物，其包括由序列通式表示的多肽或其三氟乙酸的乙酸盐取代物作为活性成分。
[0134]
本发明提供了一种预防或治疗传染病的方法，该方法包括将序列通式表示的多肽或其三氟乙酸的乙酸盐取代物施用于有需要的受试者。
[0135]
此外，本发明提供了由序列通式表示的多肽或其三氟乙酸的乙酸盐取代物在预防、减轻或治疗传染病中的用途。
[0136]
进一步地，本发明提供了由序列通式表示的多肽或其三氟乙酸的乙酸盐取代物的制备用于预防、减轻或治疗传染病的制剂的用途。
[0137]
在本发明的一个实施方式中，传染病是革兰氏阴性菌感染相关的疾病，选自由肺炎、腹膜炎、脑膜炎、伤口感染、骨关节炎、胆囊炎、尿路感染、心内膜炎、心肌炎、心包炎、关节炎、咽炎、淋病、细菌性痢疾、肠炎、结膜炎、胃炎、中耳炎、膀胱炎和淋巴管炎组成的组。
[0138]
在本发明的一个实施方式中，传染病是革兰氏阳性菌感染疾病，选自喉咽炎、脓疱病、风湿热、肾小球肾炎、新生儿败血症、脑膜炎、咽炎、肺炎、心内膜炎、猩红热、ssti(皮肤和软组织感染)、深部软组织感染、积脓症和阴道炎组成的组。
[0139]
此外，本发明提供了编码由序列通式表示的多肽的多核苷酸。
[0140]
此外，本发明提供了包含该多核苷酸的重组载体。
[0141]
此外，本发明提供了一种制备由序列通式表示的多肽的方法，包括培养用重组载体转化的宿主细胞。
[0142]
有益效果
[0143]
本发明的肽具有优良效果，不仅抑制标准菌和耐抗生素菌增殖，而且还去除细菌来源的内毒素，从而表现出优良的败血症治疗效果，当与抗生素联合使用时，该肽可以使抗生素引起的副作用最小化，因此可以有效地用于预防或治疗败血症。
[0144]
此外，根据本发明的肽选择性地对革兰氏阳性/阴性细菌具有优异的抗菌活性，因此可以有效地用于针对革兰氏阳性/阴性细菌的抗菌组合物中或用于预防或治疗由革兰氏阳性/阴性细菌引起的各种传染病。
[0145]
此外，根据本发明的肽不仅对人体安全，而且针对蛋白水解酶表现出稳定性，因此可以用于多种目的。
附图说明
[0146]
图1是说明根据本发明实施例4溶血活性测量结果的一组图：
[0147]
从左上到右，fp12
‑
nh2(seq id no:6)/alld_fp12
‑
nh2(seq id no:8)；和fp13
‑
nh2(seq id no:7)/alld_fp13
‑
nh2(seq id no:9)。
[0148]
从左下到右，alld_fp13_9a(seq id no:10)/alld_fp13_9d(seq id no:18)；和alld_fp13_9w(seq id no:11)/alld_fp13_9k(seq id no:12)。
[0149]
图2是说明根据本发明的实施例5通过圆偏振二色光谱法测量肽的二级结构的结果的一组图。
[0150]
图3是示出本发明的实施例6的肽对模拟细菌细胞膜(上)和红细胞膜(下)的脂质体的破坏能力的测量结果的一组图。
[0151]
图4说明了根据本发明实施例8的alld fp13
‑
nh2肽的抗菌作用。从左到右，alld fp13
‑
nh2肽对标准菌株大肠杆菌k1的抗菌作用；alld fp13
‑
nh2肽对临床菌株大肠杆菌(esbl)的抗菌作用；以及alld fp13
‑
nh2肽对临床菌株耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌的抗菌作用。
[0152]
图5a至5c说明了根据本发明实施例9的alld fp13
‑
nh2(acoh)肽的抗菌作用、毒性作用和抗炎细胞因子抑制作用：
[0153]
图5a示出了alld fp13
‑
nh2(tfa)(上)和alld fp13
‑
nh2(acoh)(下)对大肠杆菌(esbl)的抗菌作用的比较；
[0154]
图5b示出了alld fp13
‑
nh2(tfa)(上)和alld fp13
‑
nh2(acoh)(下)之间的体内毒
性比较；和
[0155]
图5c示出了alld fp13
‑
nh2(tfa；上)和alld fp13
‑
nh2(acoh；下)之间的抗炎细胞因子(il
‑
6)抑制作用的比较。
[0156]
图6是示出了根据本发明实施例11的肽对模拟革兰氏阳性菌细胞膜的脂质体的破坏能力的测量结果的一组图。
具体实施方式
[0157]
本发明提供了一种由以下序列通式表示的多肽：
[0158]
[通式]
[0159]
ln
‑
x1
‑
l
‑
x2
‑
v
‑
x3
‑
x4
‑
x5
‑
r
‑
x6
‑
l
‑
x7
[0160]
在通式中，
[0161]
n为0或1；
[0162]
l是亮氨酸；
[0163]
v是缬氨酸；
[0164]
r是精氨酸；
[0165]
x1是赖氨酸(k)或精氨酸(r)；
[0166]
x2是甘氨酸(g)或精氨酸(r)；
[0167]
x3是谷氨酸(e)或赖氨酸(k)；
[0168]
x4是丙氨酸(a)或亮氨酸(l)；
[0169]
x5是赖氨酸(k)或精氨酸(r)；
[0170]
x6是酪氨酸(y)、丙氨酸(a)、色氨酸(w)、赖氨酸(k)或天冬氨酸(d)；和
[0171]
x7是天冬氨酸(d)或精氨酸(r)，
[0172]
然而，具有k
‑
l
‑
g
‑
v
‑
e
‑
a
‑
k
‑
r
‑
y
‑
l
‑
d氨基酸序列的多肽被排除。
[0173]
在本发明的一个实施方式中，通式1)至9)表示的9种类型多肽中的一种或多种如下：
[0174]
1)由通式表示的多肽，其中
[0175]
n为0；
[0176]
x1是赖氨酸(k)；
[0177]
x2是甘氨酸(g)；
[0178]
x3是谷氨酸(e)；
[0179]
x4是丙氨酸(a)；
[0180]
x5是赖氨酸(k)；
[0181]
x6是酪氨酸(y)，并且
[0182]
x7是精氨酸(r)，
[0183]
即，具有klgveakrylr(seq id no：2)氨基酸序列的多肽；
[0184]
2)由通式表示的多肽，其中
[0185]
n为1；
[0186]
x1是精氨酸(r)；
[0187]
x2是甘氨酸(g)；
[0188]
x3是谷氨酸(e)；
[0189]
x4是丙氨酸(a)；
[0190]
x5是赖氨酸(k)；
[0191]
x6是酪氨酸(y)，并且
[0192]
x7是精氨酸(r)，
[0193]
即，具有lrlgveakrylr(seq id no：3)氨基酸序列的多肽；
[0194]
3)由通式表示的多肽，其中
[0195]
n为1；
[0196]
x1是精氨酸(r)；
[0197]
x2是甘氨酸(g)；
[0198]
x3是谷氨酸(e)；
[0199]
x4是亮氨酸(l)；
[0200]
x5是赖氨酸(k)；
[0201]
x6是酪氨酸(y)，并且
[0202]
x7是精氨酸(r)，
[0203]
即，具有lrlgvelkrylr(seq id no：4)氨基酸序列的多肽；
[0204]
4)由通式表示的多肽，其中
[0205]
n为0；
[0206]
x1是赖氨酸(k)；
[0207]
x2是甘氨酸(g)；
[0208]
x3是谷氨酸(e)；
[0209]
x4是丙氨酸(a)；
[0210]
x5是亮氨酸(l)；
[0211]
x6是酪氨酸(y)，并且
[0212]
x7是天冬氨酸(d)，
[0213]
即，具有klgvealryld(seq id no:5)氨基酸序列的多肽；
[0214]
5)由通式表示的多肽，其中
[0215]
n为0；
[0216]
x1是精氨酸(r)；
[0217]
x2是精氨酸(r)；
[0218]
x3是赖氨酸(k)；
[0219]
x4是亮氨酸(l)；
[0220]
x5是精氨酸(r)；
[0221]
x6是酪氨酸(y)，并且
[0222]
x7是精氨酸(r)，
[0223]
即，具有rlrvklrrylr(seq id no：15)氨基酸序列的多肽；
[0224]
6)由通式表示的多肽，其中
[0225]
n为0；
[0226]
x1是赖氨酸(k)；
[0227]
x2是精氨酸(r)；
[0228]
x3是赖氨酸(k)；
[0229]
x4是亮氨酸(l)；
[0230]
x5是精氨酸(r)；
[0231]
x6是酪氨酸(y)，并且
[0232]
x7是精氨酸(r)，
[0233]
即，具有klrvklrrylr(seq id no：16)氨基酸序列的多肽；
[0234]
7)由通式表示的多肽，其中
[0235]
n为0；
[0236]
x1是赖氨酸(k)；
[0237]
x2是精氨酸(r)；
[0238]
x3是赖氨酸(k)；
[0239]
x4是亮氨酸(l)；
[0240]
x5是精氨酸(r)；
[0241]
x6是丙氨酸(a)，并且
[0242]
x7是精氨酸(r)，
[0243]
即，具有klrvklrralr(seq id no:10)氨基酸序列的多肽；
[0244]
8)由通式表示的多肽，其中
[0245]
n为0；
[0246]
x1是赖氨酸(k)；
[0247]
x2是精氨酸(r)；
[0248]
x3是赖氨酸(k)；
[0249]
x4是亮氨酸(l)；
[0250]
x5是精氨酸(r)；
[0251]
x6是色氨酸(w)，并且
[0252]
x7是精氨酸(r)，
[0253]
即，具有klrvklrrwlr(seq id no：11)氨基酸序列的多肽；和
[0254]
9)由通式表示的多肽，其中
[0255]
n为0；
[0256]
x1是赖氨酸(k)；
[0257]
x2是精氨酸(r)；
[0258]
x3是赖氨酸(k)；
[0259]
x4是亮氨酸(l)；
[0260]
x5是精氨酸(r)；
[0261]
x6是赖氨酸(k)，并且
[0262]
x7是精氨酸(r)，
[0263]
即，具有klrvklrrklr(seq id no：12)氨基酸序列的多肽。
[0264]
本文所用术语“多肽”是指通过肽键连接氨基酸残基形成的线性分子。本发明的多肽可以通过本领域已知的化学合成方法(例如固相合成技术)以及分子生物学方法
(merrifield,j.amer.chem.soc.85:2149
‑
54(1963)；stewart等，solid phase peptide synthesis，第2版，pierce chem.co.：rockford，111(1984))制备。
[0265]
此外，在本发明的多肽的范围内，可以包括显示出与本发明的多肽等效的生物活性的在氨基酸序列中具有变异的生物功能等效物。氨基酸序列的变异可基于氨基酸取代基的相对相似性(例如疏水性、亲水性、电荷或大小)而产生。通过对氨基酸侧链取代基的大小、形状和类型的分析，可以看出精氨酸、赖氨酸和组氨酸都是带正电荷的残基；丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸具有相似的大小；苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸具有相似的形状。因此，基于这些考虑，精氨酸、赖氨酸和组氨酸；丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；或苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸可以是生物学功能等价物。
[0266]
为了引入变异，可以考虑氨基酸的疏水性指数。根据疏水性和电荷为每个氨基酸指定疏水性指数。此外，还已知具有相似亲水性的氨基酸之间的取代导致具有等效生物活性的肽。
[0267]
不完全改变分子活性的肽中的氨基酸交换是本领域已知的(h.neurath,r.l.hill,the proteins,academic press,new york,1979)。最常见的交换是氨基酸残基之间的交换，例如，ala/ser、val/ile、asp/glu、thr/ser、ala/gly、ala/thr、ser/asn、ala/val、ser/gly、thy/phe、ala/pro、lys/arg、asp/asn、leu/ile、leu/val、ala/glu和asp/gly。
[0268]
考虑到具有上述生物等效活性的变异，本发明的多肽被解释为包括与所附序列表中列出的序列表现出基本同一性的序列。基本同一性可以涉及，当任何不同的序列与本发明的序列尽可能多地比对并使用本领域常规使用的算法进行分析时，表现出至少80％、90％或95％同源性的序列。用于序列比较的比对方法是本领域已知的(huang等,comp.appl.biosci.8:155
‑
65(1992)；pearson等,meth.mol.biol.24:307
‑
31(1994))。
[0269]
此外，在本发明的一个实施方式中，根据本发明的由序列通式表示的多肽可以是包括l型肽、d型肽和类肽的模拟肽，或非天然氨基酸。
[0270]
d型多肽是与l型多肽具有相同氨基酸序列的对映异构体，也指异质同晶型多肽。
[0271]
在本发明的一个示例性实施方式中，例如，作为具有与fp12
‑
nh2(seq id no：6)相同氨基酸序列的异质同晶型多肽，提供alld fp12
‑
nh2(seq id no：8)。
[0272]
本文中用于命名多肽的术语“alld”是指d型多肽。
[0273]
多肽是包括l型、d型和类肽的模拟肽或非天然氨基酸，可以根据预定的氨基酸序列通过本领域已知的各种方法制备。
[0274]
在本发明的一个实施方式中，根据本发明的由序列通式表示的多肽的末端被烷基化、聚乙二醇化或酰胺化。
[0275]
在本发明的一个示例性实施方式中，在根据本发明的多肽中，alld fp13
‑
nh2(acoh)(seq id no:13)的n末端被聚乙二醇化，从而提供peg
‑
alld fp13
‑
nh2(acoh)(seq id no：14)。对于聚乙二醇化，根据本发明的多肽可以与fmoc
‑
nh
‑
peg2
‑
ch2cooh反应，但本发明不限于此。此处，聚乙二醇的分子量(mw)为385.4da。
[0276]
本领域普通技术人员可以根据选择的多肽调整聚乙二醇化的条件，可以通过本领域已知的各种方法进行聚乙二醇化。
[0277]
烷基化或酰胺化的条件也可由本领域普通技术人员根据所选多肽进行调整，烷基化或酰胺化可通过本领域已知的各种方法进行。
[0278]
在本发明的一个实施方式中，根据本发明由序列通式表示的多肽的c末端可以添加氨基(nh2)。
[0279]
在本发明的一个示例性实施方式中，提供fp12
‑
nh2(seq id no：6)作为在根据本发明的多肽中的fp12(seq id no：15)的c末端添加氨基(nh2)的多肽，。
[0280]
本文中用于命名多肽的术语
“‑
nh
2”是指添加了氨基(nh2)的多肽的c末端。
[0281]
可以通过本领域已知的各种方法向多肽的c末端添加胺基(nh2)。
[0282]
此外，在本发明多肽的范围内，还可以包括其药学上可接受的盐。
[0283]
本文使用的术语“药学上可接受的”是指这样的肽，由于合理的益处/风险比而没有过度毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症，其适合用于与受试者(例如人)的组织接触，并包括在合理的医学判断范围内。药学上可接受的盐包括例如由药学上可接受的游离酸形成的酸加成盐和药学上可接受的金属盐。
[0284]
合适的酸的实施例可以包括盐酸、溴酸、硫酸、硝酸、高氯酸、富马酸、马来酸、磷酸、乙醇酸、乳酸、水杨酸、琥珀酸、对甲苯磺酸、酒石酸、乙酸、柠檬酸、甲磺酸、甲酸、苯甲酸、丙二酸、葡萄糖酸、萘
‑2‑
磺酸和苯磺酸。酸加成盐可以通过常规方法制备，例如，通过将化合物溶解在过量的酸性水溶液中，并使用与水互溶的有机溶剂(如甲醇、乙醇、丙酮或乙腈)沉淀盐。此外，酸加成盐可以通过将等摩尔量的化合物和酸或醇在水中加热，蒸发然后干燥混合物，或抽滤沉淀的盐来制备。
[0285]
由合适的碱诱发的盐可以包括碱金属(如钠和钾)、碱土金属(如镁)和铵，但本发明不限于此。碱金属或碱土金属可以通过例如将化合物溶解在过量的碱金属氢氧化物或碱土金属氢氧化物溶液中、过滤未溶解的复合盐并蒸发和干燥滤液来获得。在此，制备金属盐(特别是钠盐、钾盐或钙盐)在药学上是合适的，此外，可以通过使碱金属或碱土金属盐与合适的银盐(例如，硝酸银)反应来获得与其对应的银盐。
[0286]
作为上述多肽的药学上可接受的盐，本发明提供了上述多肽的乙酸盐。
[0287]
更具体地，提供了根据本发明的多肽的三氟乙酸(tfa)的乙酸盐取代物。
[0288]
更具体地，本发明提供了由上述序列通式表示的多肽的乙酸盐；多肽，其是包括l型肽、d型肽和类肽的模拟肽，或非天然氨基酸；末端被烷基化、聚乙二醇化或酰胺化的多肽；或在c末端添加氨基(nh2)的多肽。
[0289]
本文中用于命名多肽的术语“acoh”是指多肽的乙酸盐。
[0290]
本发明的多肽及其盐取代物具有如下一个或多个特征：
[0291]
与革兰氏阴性菌的脂多糖(lps)的结合能力；
[0292]
对细菌细胞膜的选择性破坏能力；
[0293]
对蛋白水解酶的抗性；
[0294]
对革兰氏阳性菌的细胞膜破坏能力；和
[0295]
与革兰氏阳性菌衍生的脂磷壁酸(lta)或脂蛋白(lpp)的结合能力。
[0296]
在本发明的一个示例性实施方式中，确认了根据本发明的多肽及其盐取代物的以下特征，但本发明不限于此。
[0297]
在本发明的一个示例性实施方式中，证实了根据本发明的多肽及其盐取代物对脂多糖(lps)具有强结合能力(实施例1)。
[0298]
此外，在本发明的一个示例性实施方式中，证实了根据本发明的多肽及其盐取代
物具有破坏细菌细胞膜的能力(实施例6和11)。特别地，其没有表现出对红细胞的细胞膜的破坏能力，证明了安全性(实施例6)。
[0299]
此外，在本发明的一个示例性实施方式中，证实了根据本发明的多肽及其盐取代物对蛋白水解酶具有优异的抗性(实施例7)。即使当与蛋白水解酶一起处理时，根据本发明的多肽及其盐取代物也表现出优异的抗菌活性，证实确保了对蛋白水解酶的稳定性。
[0300]
此外，在本发明的一个示例性实施方式中，证实了根据本发明的多肽及其盐取代物对作为革兰氏阳性菌细胞壁成分的脂磷壁酸(lta)和脂蛋白(lpp)具有优异的结合能力(实施例12)。
[0301]
此外，在本发明的一个示例性实施方式中，证实了根据本发明的多肽及其盐取代物表现出微不足道的溶血活性，证实毒性非常低(实施例4)。
[0302]
此外，本发明提供了一种用于预防、减轻或治疗败血症的组合物，其包括由序列通式表示的多肽或其三氟乙酸的乙酸盐取代物作为活性成分。
[0303]
此外，本发明提供了一种用于预防、减轻或治疗败血症的药物/食品/保健食品/化妆品/准药物/饲料组合物，其包括由序列通式表示的多肽或其三氟乙酸的乙酸盐取代物作为有效成分。
[0304]
本发明提供了一种预防或治疗败血症的方法，包括将序列通式表示的多肽或其三氟乙酸的乙酸盐取代物施用于有需要的受试者。
[0305]
此外，本发明提供了由序列通式表示的多肽或其三氟乙酸的乙酸盐取代物用于预防、减轻或治疗败血症的用途。
[0306]
进一步地，本发明提供了由序列通式表示的多肽或其三氟乙酸的乙酸盐取代物的制备用于预防、减轻或治疗败血症的制剂的用途。
[0307]
本文使用的术语“败血症”是指一种病症，其中通过微生物感染在全身发生严重炎症反应。当通过血液检查观察到体温升高至38℃或以上的发烧、体温降低至36℃或以下的体温过低、呼吸频率增加至每分钟24次(呼吸急促)、心率增加到每分钟90次(心动过速)或白细胞数量增加或显着减少中的两种或两种以上症状时，称为全身炎症反应综合征(sirs)。当sirs由微生物感染引起时，称为败血症。病原体连续地或间歇性地从身体感染性病变进入血流，并在各器官组织中定居，从而形成病变，并表现出严重的全身症状。致病菌包括葡萄球菌、链球菌、埃希氏菌、绿脓假单胞菌、结核分枝杆菌、肺炎克雷伯菌、真菌和厌氧菌，但本发明不限于此。
[0308]
此外，本发明提供了一种抗菌组合物，其包括由序列通式表示的多肽或其三氟乙酸的乙酸盐取代物作为活性成分。
[0309]
此外，本发明提供了一种抗菌药物/食品/保健食品/化妆品/准药物/饲料组合物，其包含由序列通式表示的多肽或其三氟乙酸的乙酸盐取代物作为活性成分。
[0310]
本发明提供了一种抗菌方法，包括将序列通式表示的多肽或其三氟乙酸的乙酸盐取代物施用于有需要的受试者。
[0311]
此外，本发明提供了由序列通式表示的多肽或其三氟乙酸的乙酸盐取代物的抗菌用途。
[0312]
进一步地，本发明提供了由序列通式表示的多肽或其三氟乙酸的乙酸盐取代物用于制备抗菌剂的用途。
[0313]
本文所用的术语“抗菌”或“抗菌活性”是指对微生物如细菌或真菌具有抗性的特性，更具体地，是指通过抗生素材料抑制细菌生长或增殖的特性。
[0314]
在此使用的术语“抗菌组合物”是具有抑制微生物(如细菌或真菌)生长的活性的组合物，并且可以包括在需要抗菌作用的各个领域中使用的所有类型，例如医药、化妆品、准药物、食品添加剂或饲料添加剂。具体地，这样的组合物可以在医药中用作抗生素或防污剂，在食品中用于防腐或抗菌目的，在农业中用于抗菌、杀菌或抗败血症作用，可以用于与微生物直接相关的产品中以预防头皮屑、预防脚气、抑制腋臭，或在化妆品和家用产品中抗粉刺，或在清洁产品或用于洗碗的洗涤剂中用于防腐、抗菌或杀菌作用的目的，但本发明不限于此。
[0315]
在本发明的一个实施方式中，根据本发明的抗菌组合物的抗菌目标包括革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、耐抗生素革兰氏阴性菌和耐抗生素革兰氏阳性菌。
[0316]
本文使用的“革兰氏阴性菌”是指用革兰氏染色法染色时染成红色的细菌，一般具有较强的色素抗性和表面活性剂抗性。本发明的革兰氏阴性菌包括含有内毒素的所有类型的革兰氏阴性菌，例如大肠杆菌属、假单胞菌属、不动杆菌属、沙门氏菌属、克雷伯菌属、奈瑟菌属、肠杆菌属、志贺氏菌属、莫拉克斯氏菌属、螺杆菌属、寡养单胞菌属、蛭弧菌属和军团菌属的菌株，但本发明不限于此。具体来说，革兰氏阴性菌包括但不限于大肠杆菌、铜绿假单胞菌、荧光假单胞菌、恶臭假单胞菌、绿针假单胞菌、穿孔假单胞菌、施氏假单胞菌、丁香假单胞菌、鲍曼不动杆菌、鲁氏不动杆菌、醋酸钙不动杆菌、溶血不动杆菌、肠沙门氏菌、邦戈沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌、姆班达卡沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、汤普森沙门氏菌、婴儿沙门氏菌、德尔比沙门氏菌、肺炎克雷伯菌、肉芽肿克雷伯菌、产酸克雷伯菌、土生克雷伯菌、淋球奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、鲍氏志贺菌、痢疾志贺菌、福氏志贺菌、宋氏志贺菌、卡他莫拉克斯氏菌、腔隙莫拉克斯氏菌、牛莫拉克斯氏菌、幽门螺杆菌、海尔曼螺杆菌、猫螺杆菌、鼬鼠螺杆菌、芬纳尔螺杆菌、芜菁螺杆菌、肝螺杆菌、胆汁螺杆菌、鸡白痢螺杆菌、嗜麦芽寡养单胞菌、还原亚硝酸盐寡养单胞菌、噬菌蛭弧菌、嗜肺军团菌、茴香军团菌、伯明翰军团菌、波兹曼军团菌、辛辛那提军团菌、杜莫夫军团菌、菲氏军团菌、戈尔曼尼军团菌、假鹤虱军团菌、以色列军团菌、约旦军团菌、兰辛军团菌、长滩军团菌、麦氏军团菌、橡树岭军团菌、圣赫伦斯军团菌、图森军团菌和沃氏军团菌。
[0317]
本文所用的术语“革兰氏阳性菌”是指经革兰氏染色呈品蓝色或紫色的细菌，可包括葡萄球菌属、肠球菌属、链球菌属和梭菌属的菌株，但本发明不限于此。具体地，革兰氏阳性菌包括金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、屎肠球菌、肺炎链球菌和炭疽杆菌，但本发明不限于此。
[0318]
本文所用的术语“耐抗生素革兰氏阳性菌”包括例如耐甲氧西林革兰氏阳性菌、耐碳青霉烯革兰氏阳性菌、耐万古霉素革兰氏阳性菌、耐大环内酯类和多药的革兰氏阳性菌，但本发明不限于此。
[0319]
本文所用的“耐抗生素革兰氏阴性菌”包括例如耐链霉素革兰氏阴性菌、耐粘菌素革兰氏阴性菌、耐碳青霉烯革兰氏阴性菌、耐氯霉素革兰氏阴性菌、耐四环素革兰氏阴性菌、耐头孢噻肟革兰氏阴性菌、耐亚胺培南革兰氏阴性菌、耐esbl革兰氏阴性菌、耐替加环素革兰氏阴性菌和耐多药革兰氏阴性菌，但本发明不限于此。
[0320]
在本发明的一个实施方式中，抗菌组合物所针对的细菌可以是选自由大肠杆菌dh5α、大肠杆菌k1、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌组成的组中的一种或多种细菌。
[0321]
此外，在本发明的一个实施方式中，抗菌组合物所针对的细菌可以是选自耐esbl细菌、耐碳青霉烯细菌和耐粘菌素细菌组成的组中的一种或多种耐抗生素细菌。例如，耐抗生素细菌可以是esbl(大肠杆菌)、耐碳青霉烯(cr)
‑
鲍曼不动杆菌、cr
‑
肺炎克雷伯菌、cr
‑
铜绿假单胞菌、耐粘菌素鲍曼不动杆菌，但本发明不限于此。
[0322]
此外，本发明提供一种用于预防、减轻或治疗传染病的组合物，其包括由序列通式表示的多肽或其三氟乙酸的乙酸盐取代物作为活性成分。
[0323]
此外，本发明提供了一种用于预防、减轻或治疗传染病的药物/食品/保健食品/化妆品/准药物/饲料组合物，其包括由序列通式表示的多肽或其三氟乙酸的乙酸盐取代物作为活性成分。
[0324]
本发明提供了一种预防或治疗传染病的方法，该方法包括将序列通式表示的多肽或其三氟乙酸的乙酸盐取代物施用于有需要的受试者。
[0325]
此外，本发明提供了由序列通式表示的多肽或其三氟乙酸的乙酸盐取代物用于预防、减轻或治疗传染病的用途。
[0326]
进一步地，本发明提供了由序列通式表示的多肽或其三氟乙酸的乙酸盐取代物的用于制备预防、减轻或治疗传染病的制剂的用途。
[0327]
本文所用术语“传染病”是指由病毒、细菌、真菌和寄生虫等致病病原体传播或侵入动物或人类而引起的疾病，为了本发明的目的，传染病指由革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌引起的所有类型的传染病。
[0328]
例如，传染病包括革兰氏阴性菌引起的传染病，如肺炎、腹膜炎、脑膜炎、伤口感染、骨关节炎、胆囊炎、尿路感染、心内膜炎、心肌炎、心包炎、关节炎、咽炎、淋病、细菌性痢疾、肠炎、结膜炎、胃炎、中耳炎、膀胱炎和淋巴管炎，但本发明不限于此。
[0329]
例如，传染病包括革兰氏阳性菌引起的传染病，如咽喉炎、脓疱病、风湿热、肾小球肾炎、新生儿败血症、脑膜炎、咽炎、肺炎、心内膜炎、猩红热、ssti(皮肤和软组织感染)、深部软组织感染、积脓症、阴道炎，但本发明不限于此。
[0330]
本发明的药物组合物还可以包括合适的载体、赋形剂和稀释剂，它们通常用于制备药物组合物。根据本发明的药物组合物可以用于口服制剂(例如粉末、颗粒、片剂、胶囊、混悬剂、乳剂、糖浆或气雾剂)、外用制剂、栓剂或根据常规方法的无菌注射液。
[0331]
可包含在本发明的药物组合物中的载体、赋形剂和稀释剂的实施例可包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油。
[0332]
本发明的药物组合物可以与稀释剂或赋形剂(例如常规使用的填充剂、膨胀剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、表面活性剂)一起配制。用于口服给药的固体制剂可以是片剂、丸剂、粉末、颗粒或胶囊，并且这种固体制剂可以通过混合至少一种赋形剂(例如淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖和明胶)与活性成分来制备。此外，除了简单的赋形剂外，还可以使用润滑剂，如硬脂酸镁和滑石粉。作为用于口服给药的液体制剂，可以使用混悬剂、口服液、乳剂或糖浆，并
且可以包括通常使用的简单稀释剂(如水或液体石蜡)以及各种类型的赋形剂(例如，润湿剂、甜味剂、香料和防腐剂)。肠胃外给药的制剂可以是无菌水溶液、非水溶剂、混悬剂、乳剂、冻干产品或栓剂。作为非水溶剂或混悬剂，可以使用丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄榄油)、或可注射的酯(如油酸乙酯)。作为栓剂基质，可以使用witepsol、聚乙二醇、吐温61、可可脂、月桂(laurinum)或甘油明胶。
[0333]
本文使用的术语“预防”是指通过施用根据本发明的组合物来预防、抑制或延迟由疾病产生的症状的所有活动。
[0334]
本文所用的术语“治疗”或“减轻”是指通过施用根据本发明的组合物来改善或有益地改变症状所涉及的所有活动。
[0335]
本文使用的术语“给药”是指通过合适的方法向受试者提供本发明的组合物。
[0336]
本文使用的术语“受试者”是指需要预防或治疗的目标。例如，受试者可以是哺乳动物例如人或非人灵长类动物、小鼠、狗、猫、马、羊或牛。
[0337]
根据本发明的组合物以药学有效量给药。在本发明中，本文所用的“药学有效量”是指在适用于医学治疗的合理获益/风险比下足以治疗疾病的量，通过以下参数确定有效剂量，包括：患者疾病类型、严重性、药物活性、对药物的敏感性、给药时间、给药途径和排泄率、治疗持续时间和同时使用的药物，以及医学领域中众所周知的其他参数。具体地，药物组合物可以以0.001至1000mg/kg、0.01至100mg/kg、0.01至10mg/kg、0.1至10mg/kg或0.1至1mg/kg的剂量每天一次或分次施用。考虑到上述所有所有参数，以最小剂量达到最大效果且无副作用是很重要的，该剂量可由本领域普通技术人员确定。具体地，本发明药物组合物的有效量可根据患者的年龄、性别、状况、体重、活性成分在体内的吸收率、失活率、排泄率、疾病类型或伴随药物而确定。
[0338]
本发明的药物组合物可以通过多种途径给予受试者。可以预期所有给药途径，并且本发明的药物组合物可以通过例如口服、或直肠内、静脉内、肌肉内、皮下、子宫内、硬膜内或脑血管内注射给药。
[0339]
本发明的药物组合物还可包含一种或多种有效减轻、预防或治疗败血症或败血性休克；预防细菌感染；减轻、预防或治疗传染病的已知物质。
[0340]
除了活性成分之外，本发明的药物组合物还可以包含支气管扩张剂、抗组胺剂或抗炎镇痛药。
[0341]
例如，支气管扩张剂可以是β激动剂、抗胆碱能药或甲基黄嘌呤，抗组胺剂可以是阿伐斯汀、西替利嗪、地氯雷他定、非索非那定、左西替利嗪、氯雷他定、咪唑斯汀、阿利马嗪、氯西替利嗪(chlocertirizine)、氯马斯汀、赛庚啶、羟嗪、酮替芬或异丙嗪，抗炎镇痛药可以是阿司匹林、双氯芬酸、非诺洛芬、氟比洛芬、布洛芬、消炎痛、酮洛芬、萘普生、吡罗昔康、舒林酸、塞来昔布、伐地昔布或罗非昔布。
[0342]
在本发明的一个示例性实施方式中，通过测量根据本发明的多肽及其盐与lps的结合能力，证实了根据本发明的多肽及其盐对lps具有高结合能力(实施例1)。
[0343]
此外，在本发明的一个示例性实施方式中，证实了根据本发明的多肽及其盐表现出优异的抗菌活性(实施例2、3和10)。
[0344]
此外，在本发明的一个示例性实施方式中，证实了根据本发明的多肽及其盐表现出很强的抗菌作用(实施例8和9)。
[0345]
此外，本发明提供了编码该多肽的多核苷酸。
[0346]
术语“多核苷酸”是以单链或双链存在的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的聚合物。除非另有说明，多核苷酸包括rna基因组序列、dna(gdna和cdna)和由其转录的rna序列，并且包括天然多核苷酸的类似物。
[0347]
多核苷酸包括核苷酸序列，还包括与其互补的序列。互补序列不仅包括完全互补的序列，还包括基本互补的序列。它是指在本领域已知的严格条件下能够与核苷酸序列杂交的序列。
[0348]
此外，多核苷酸可以被修饰。修饰包括核苷酸的添加、缺失、非保守取代或保守取代。编码氨基酸序列的多核苷酸被解释为还包括与该核苷酸序列表现出基本同一性的核苷酸序列。基本同一性是指，当核苷酸序列与任何不同的序列比对时，具有至少80％、90％或95％的同源性的序列，使得它们对应于最大对应，并且比对的序列使用本领域常规使用的算法进行分析。
[0349]
此外，本发明提供了包含该多核苷酸的重组载体。
[0350]
本文使用的术语“载体”是指用于在宿主细胞中表达靶基因的手段。例如，载体包括质粒载体、粘粒载体、噬菌体载体和病毒载体(如腺病毒载体、逆转录病毒载体和腺相关病毒载体)。可用作重组载体的载体可通过操作本领域常用的质粒(例如，psc101、pgv1106、pacyc177、cole1、pkt230、pme290、pbr322、puc8/9、puc6、pbd9、phc79、pij61、plafr1、phv14、pgex系列、pet系列或puc19)、噬菌体(例如，λ例如，9)7δ或m13)或病毒(例如，cmv或sv40)来构建。
[0351]
在重组载体中，编码肽的多核苷酸可与启动子可操作地连接。本文使用的术语“可操作地连接”是指核苷酸表达调控序列(例如启动子序列)和不同核苷酸序列之间的功能连接。因此，调控序列可以调控不同核苷酸序列的转录和/或翻译。
[0352]
重组载体通常可以构建为用于克隆或表达的载体。表达载体可以是本领域用于在植物、动物或微生物中表达外源蛋白的常规载体。重组载体可以通过本领域已知的各种方法构建。
[0353]
此外，本发明提供了由重组载体转化的宿主细胞。
[0354]
作为宿主细胞，可以使用本领域已知的任何宿主细胞，并且可以使用原核细胞，例如肠杆菌科的菌株，包括大肠杆菌jm109、大肠杆菌bl21、大肠杆菌rr1、大肠杆菌le392、大肠杆菌b、大肠杆菌x 1776或大肠杆菌w3110，芽孢杆菌属的菌株，例如枯草芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌，鼠伤寒沙门氏菌、粘质沙雷氏菌和各种假单胞菌，并且当转化到真核细胞中时，作为宿主细胞，可以使用酵母细胞(酿酒酵母)、昆虫细胞、植物细胞和动物细胞，例如sp2/0、中国仓鼠卵巢(cho)k1、cho dg44、per.c6、w138、bhk、cos
‑
7、293、hepg2、huh7、3t3、rin和mdck细胞系。
[0355]
本发明提供了一种制备本发明序列通式表示的多肽的方法，包括培养宿主细胞。
[0356]
可通过本领域公知的插入方法将多核苷酸或包含其的重组载体插入到宿主细胞中。递送方法可以是，例如，当宿主细胞是原核细胞时，cacl2法或电穿孔法；当宿主细胞是真核细胞时，可以是微注射、磷酸钙、沉淀、脂质体介导的转染和基因轰击，但本发明不限于此。
[0357]
选择转化的宿主细胞的方法可以通过使用选择标记表达的表型的本领域公知的
方法容易地进行。例如，当选择标记是特异性耐抗生素的基因时，转化体在含有抗生素的培养基中培养，从而可以容易地选择转化体。
[0358]
在下文中，为了帮助理解本发明，将给出示例性实施例。然而，提供以下实施例只是为了容易地理解本发明，并不用于限制本发明。
[0359]
实施例1：测量adk衍生肽候选物对大肠杆菌k1的lps结合能力fp1(adk 44
‑
54)用野生型(wt)表示，并制造了在wt中在不同位点发生点突变的肽(fp3、fp5、fp6和fp9)。为了增加与fp3残基序列中lps的相互作用，基于fp3和lps结合模型设计肽(fp12
‑
nh2和fp13
‑
nh2)，并通过额外引入非天然氨基酸和氨基酸异构体(异质同晶的d型氨基酸)设计肽(alld fp12
‑
nh2、alld fp13
‑
nh2、alld fp
‑
13
‑
9a、alld fp
‑
13
‑
9w、alld fp
‑
13
‑
9k和alld fp13
‑
nh2(acoh))。此外，anygen,co.ltd.还设计、合成并提供了n末端聚乙二醇化的肽(peg
‑
alld fp13
‑
nh2(acoh))。所提供的每种肽与脂多糖(lps)之间的结合能力通过使用等温滴定量热计(itc)测量结合亲和力(kd)确认。
[0360]
具体地，分析肽与lps之间的结合亲和力(kd)的方法如下。
[0361]
使用malvern microcal peaq
‑
itc细胞仪器进行测量，并进行以下预处理以确认与lps的相互作用。样品池的数量和形态分别为300μl和硬币形，固定到位；注射器转速为1200rpm；温度为30℃、35℃或25℃。
[0362]
实验前，lps和肽预先用pbs稀释，从而制备2mm lps和0.2mm肽。将300μl肽加入洗涤过的itc仪器中的池中，将40μl lps放入注射器中。设定itc的测量条件(温度、注射次数)后，将注射器插入池内，开始itc测量。测量结束后进行分析，计算lps和肽的kd值。
[0363]
作为测量的结果，确认了fp3、fp5、fp6、fp9、fp12
‑
nh2、fp13
‑
nh2、alld fp12
‑
nh2、alld fp13
‑
nh2、alld fp
‑
13
‑
9a、alld fp
‑
13
‑
9w、alld fp
‑
13
‑
9k、alld fp13
‑
nh2(acoh)中的所有类型的肽都具有很强的lps结合亲和力，等于或高于fp1(野生型，wt)的lps结合亲和力。
[0364]
[表1]
[0365]
[0366][0367]
[表2]
[0368][0369]
(表1和表2中，alld表示d型氨基酸)
[0370]
(在表1和2中，(acoh)表示盐取代，其中肽的n末端的第9个氨基酸末端的三氟乙酸(tfa)被乙酸盐取代。)
[0371]
(表2中，peg表示聚乙二醇化。肽n端聚乙二醇化信息：聚乙二醇(peg)，分子量(mw)＝385.4da，fmoc
‑
nh
‑
peg2
‑
ch2cooh)
[0372]
实施例2：alld fp13
‑
nh2和四种市售抗生素对革兰氏阳性/阴性标准菌株的抗菌活性的比较评价
[0373]
比较实施例1中设计的已证实对lps具有强亲和力的肽(alld fp13
‑
nh2)和四种市售抗生素对革兰氏阳性/阴性标准菌株的抗菌活性。
[0374]
为了比较四种市售抗生素(氨苄西林、庆大霉素、左氧氟沙星和亚胺培南)和alld fp13
‑
nh2(acoh)肽之间的抗菌活性，进行了抗菌活性测试以测量革兰氏阴性和革兰氏阳性标准菌株(大肠杆菌dh5α、大肠杆菌k1、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌和肺炎克雷伯菌)的最低抑菌浓度(mic
50
和mic
80
)。
[0375]
更具体地，将100μl培养基分配到96孔板的每个孔中，并且在第一列中分配200μl培养基中的抗生素和肽。从第1列到第11列进行1/2系列稀释，将先前培养的革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌稀释(稀释时的od
600nm
值：约0.0025)并分配到每个孔中。将板在37℃培养箱中培养4小时，并在od
600nm
处测量。以空白(仅含有培养基和细菌的孔)的od
600nm
值确定细菌生长率为100％，通过确定具有显示出50％生长抑制率的od
600nm
值的抗生素和肽的浓度来确
定mic
50
，并且通过确定具有显示出80％的生长抑制率的浓度(μg/ml)来确定mic
80
。
[0376]
结果，通过将alld fp13
‑
nh2(acoh)肽与四种市售抗生素(氨苄西林、庆大霉素、左氧氟沙星和亚胺培南)进行比较，证实alld fp13
‑
nh2(acoh)肽对所有七种革兰氏阳性/阴性菌的菌株表现出相同或优越的抗菌活性。
[0377]
[表3]
[0378]
[0379][0380]
实施例3：肽和三种抗生素对耐抗生素细菌(esbl和耐碳青霉烯细菌)的抗菌活性比较评价
[0381]
为了分析9种肽的抗菌活性，确认对耐氨苄西林(amp)、亚胺培南、粘菌素和另外5种抗生素的细菌(esbl
‑
大肠杆菌、耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌、耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌、耐碳青霉烯铜绿假单胞菌和耐粘菌素鲍曼不动杆菌)的抗菌活性。
[0382]
抗菌活性根据用于测量最低抑菌浓度50(mic
50
；杀死50％细菌的最低浓度)的抗菌活性测试方法进行评价。
[0383]
更具体地，将100μl培养基分配到96孔板的每个孔中，并且在第一列中分配200μl培养基中的抗生素和肽。对第1列至第11列进行1/2连续稀释，之前培养的5种耐抗生素细菌(耐esbl大肠杆菌、耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌、耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌、耐碳青霉烯铜绿假单胞菌、耐粘菌素鲍曼不动杆菌)进行稀释(稀释时的od
600nm
值：约0.0025)并分配到每个
孔中。将所述板在37℃培养箱中培养4小时，并在od
600nm
处测量。以空白(仅含有培养基和细菌的孔)的od
600nm
值确定细菌生长率为100％，并通过确认具有显示出50％生长率的od
600nm
值的抗生素和肽的浓度来测量mic
50
值。
[0384]
结果证实，与三种比较抗生素(氨苄西林(amp)、亚胺培南和粘菌素)相比，根据本发明的肽具有改进的抗菌活性。特别地，证实了根据本发明的肽针对对于这些抗生素具有抗性的细菌(特别是耐碳青霉烯或粘菌素的菌株)也具有抗菌活性。
[0385]
[表4]
[0386][0387]
实施例4：肽溶血活性的测量
[0388]
进行以下实验以通过测量人体中的红细胞溶血活性来确定肽的毒性。
[0389]
人红细胞用pbs稀释洗涤，离心10分钟，洗涤过程重复3次。将用pbs稀释的8.0％红细胞溶液按100μl加入96孔微量滴定板并和100μl肽溶液混合，混合物在37℃培养1小时，然后96孔微量滴定板离心5分钟。取100μl上清液并转移至另一个96孔微量滴定板，然后在405nm处测量吸光度。此处，当用0.1％triton x
‑
100处理时获得的值计算为100％溶血，并且肽的溶血活性通过以下公式1计算为％溶血。
[0390]
[公式1]
[0391][0392]
这里，a是肽溶液中405nm处的吸光度，b是0.1％triton x
‑
100中405nm处的吸光度，c是pbs溶液中405nm处的吸光度。
[0393]
这里，作为对照的肽，使用了蜂毒肽，它是一种表现出强抗菌活性和强溶血活性的抗菌肽。
[0394]
结果，如图1所示，可以看到，本发明的肽即使在100μm的高浓度下也几乎没有表现出溶血活性。另一方面，作为对照的蜂毒肽即使在低浓度下也显示出100％的溶血活性，表明毒性非常高。
[0395]
实施例5：使用圆偏振二色光谱测量肽的二级结构
[0396]
为了测量fp12
‑
nh2和fp13
‑
nh2肽的二级结构，如下进行实验。
[0397]
为了在生物膜样环境中研究肽的二级结构，将肽溶解在0.3ml溶剂中，使肽浓度变
为在水溶液100mm sds或50mm dpc中每个样品100μm。使用jasco j
‑
720圆二色分光光度计分析1mm路径长度的细胞，从而在100nm/min的注入速率下获得每0.1nm的吸收值，并平均六次注入，从而获得测量值。
[0398]
圆偏振二色光谱显示出取决于多肽主链二级结构的特征吸收图。fp12
‑
nh2和fp13
‑
nh2肽在水溶液中没有二级结构，但在大约208和222nm的波长处有两个极小点，这是dpc胶束中(这是一个类似生物膜的环境)α
‑
螺旋结构的特征吸收图(图2)。
[0399]
由以上结果可以预测，这些肽将表现出抗菌活性，同时在细菌生物膜中形成α
‑
螺旋结构。另一方面，可以看出，经过d
‑
氨基酸取代的alld(fp12
‑
nh2)和alld(fp13
‑
nh2)肽恰好具有母体肽的镜像。与显示右旋α
‑
螺旋结构的母体肽的cd谱相反，肽具有负强度，表明它们具有左旋α
‑
螺旋结构(图2)。
[0400]
实施例6：肽对模拟革兰氏阴性菌细胞膜和红细胞膜的脂质体的破坏能力的测量
[0401]
为了研究fp12
‑
nh2、fp13
‑
nh2、alld fp12
‑
nh2和alld fp13
‑
nh2肽的作用机制，测量了肽对模拟细菌细胞膜和红细胞膜的脂质体的破坏能力。
[0402]
为了确认肽的抗菌作用是否表现出通过靶向细菌细胞膜杀死细菌的作用机制，分别制造包裹了一种荧光染料钙黄绿素的脂质体，它由模拟革兰氏阴性菌细胞膜的eypc/eypg(7:3,w/w)和模拟人类红细胞的eypc/ch(1:10,w/w)组成，以进行荧光染料渗漏测定。
[0403]
eypg是蛋黄l
‑
α
‑
磷脂酰
‑
dl
‑
甘油的缩写，eypc是蛋黄1,2
‑
二酰基
‑
sn
‑
甘油
‑3‑
磷酸胆碱的缩写。ch是胆固醇的缩写。将按各组分含量组成的磷脂溶于氯仿后，用旋转蒸发仪除去氯仿，冻干过夜。然后，将干燥的脂质膜溶解在tris缓冲溶液中，并将钙黄绿素溶解在液氮中。反复冻融后，用挤出机制造包裹钙黄绿素的脂质体。随后，将荧光分光计(日本岛津rf 5301pc分光荧光计)的激发波长设置为490nm，将发射波长设置为520nm，将肽给药于脂质体以测量相对染料泄漏，前提是，100％染料泄漏表示为添加0.01％triton
‑
x
100
时的荧光强度。
[0404]
结果示于图3。图3的上图示出了模拟细菌细胞的eypc/eypg(7:3，w/w)脂质体的％染料渗漏，根据肽浓度用肽包裹荧光染料钙黄绿素。这里，作为对照(表现出细胞膜靶向作用机制的肽)，使用了抗菌肽蜂毒肽。图3的下图示出了eypc/ch(10:1，w/w)脂质体的染料渗漏百分比，该脂质体是模仿人红血的甘油三酯，根据肽浓度用肽包裹荧光染料钙黄绿素。在这里，抗菌肽蜂毒肽用作对照(表现出细胞膜靶向作用机制的肽)。
[0405]
如图3所示，即使在低浓度下，对照肽也会导致钙黄绿素从模拟细菌细胞膜的由pc/pg(7:3,w/w)组成的脂质体泄漏。对于模拟人类红细胞的pc/ch(10:1,w/w)脂质体，由于在0.25μm蜂毒肽时可能显示几乎100％钙黄绿素渗漏，因此可以预测对细菌细胞没有选择性，并且毒性非常高。
[0406]
另一方面，fp12
‑
nh2、fp13
‑
nh2、alld fp12
‑
nh2和alld fp13
‑
nh2肽导致模拟细菌细胞膜的pc/pg(7:3,w/w)脂质体的高染料泄漏，表明破坏细菌细胞膜的能力很强。对于模拟哺乳动物红细胞膜的pc/ch(1:1,w/w)脂质体，fp12
‑
nh2、fp13
‑
nh2、alld fp12
‑
nh2和alld fp13
‑
nh2肽选择性地显示几乎没有染料泄漏，这与低溶血活性一致。因此，可以看出本发明的肽具有选择性破坏细菌细胞膜的作用机制。
[0407]
实施例7：通过测量肽的蛋白水解酶抗性来评估稳定性
[0408]
通过测量设计的alld fp12
‑
nh2和alld fp13
‑
nh2肽的蛋白水解酶抗性来确认血液
或8x107)在穆勒辛顿肉汤(mhb)液体培养基中准备，腹腔注射(1ml)入6周大的小鼠以诱导感染。每个实验将小鼠分为数组(每组n＝5或6)，将混合有hartmann's dex溶液(载体)的alld fp13
‑
nh2在0、1、2、3、4或5小时六次腹腔注射到小鼠中，然后每隔12小时观察一次存活率，持续3天。
[0421]
结果，在感染了大肠杆菌k1、大肠杆菌(esbl)和耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌的败血症动物模型中，在每千克3mg至12mg的浓度范围内确认了存活率的提高(杀菌效果)(图4)。经验证，实施例1中设计的肽在标准菌株和临床菌株感染的动物模型中也表现出体内杀菌和抗败血症作用。
[0422]
实施例9:肽的乙酸盐取代物
[0423]
为了确认alld fp13
‑
nh2的乙酸盐取代物的治疗和药学效果，通过腹膜内施用每种大肠杆菌(标准菌株和esbl)菌株诱导的败血症动物模型或正常小鼠用alld fp13
‑
nh2(acoh)处理。将盐取代物的杀菌效果、毒性和抗炎细胞因子il
‑
6的抑制活性与三氟乙酸(tfa)端部的相同肽进行了比较。
[0424]
一种实验方法如下：
[0425]
使用平均体重为25g的六周龄雌性icr小鼠(spf小鼠，samtako)作为实验动物。为实验动物提供无菌饲料和水，每笼饲养少于10只小鼠，昼夜周期为12小时。
[0426]
测试菌株在37℃培养箱[血琼脂平板(bap)]中培养2天，根据接种菌株的量(1x108)在穆勒辛顿肉汤(mhb)液体培养基中准备，腹腔内注射(1
×
108/200μl)到6周龄小鼠以诱导感染。每个实验将小鼠分成数组(每组n＝5或6)，并在0、1、2、3、4、5小时腹腔内注射与hartmann's dex溶液(载体)混合的alld fp13
‑
nh2(tfa)和alld fp13
‑
nh2(acoh)6次，然后每隔12小时观察一次存活率。
[0427]
为了评估体内毒性，每个实验将小鼠分成数组(每组n＝5或6)，并用与hartmann's dex溶液(载体)混合的alld fp13
‑
nh2(tfa)和alld fp13
‑
nh2(acoh)在0、1、2、3、4或5小时腹腔内处理6次，然后72小时内以12小时的间隔观察存活率。
[0428]
此外，通过评估lps介导的alld fp13
‑
nh2(tfa)和alld fp13
‑
nh2(acoh)的免疫反应，比较分析肽处理30分钟后由于lps分泌的细胞因子，从而对骨髓来源的树突细胞(bmdc)进行il
‑
6分泌试验。
[0429]
结果，根据败血症动物模型(大肠杆菌esbl诱导模型)的杀菌作用和毒性试验，由于ed
50
约为1mpk(mg/kg)，ld
50
为80mpk，表现出毒性的药物剂量与表现出所需反应的药物剂量之比(治疗指数＝ld
50
/ed
50
)大于80，预计将确保足够的安全范围，证实存在开发新型抗败血症药物的极好可能性。此外，证实alld fp13
‑
nh 2(acoh)显著降低了由于lps而增加的il
‑
6的分泌(图5a至5c)。
[0430]
实施例10：alld型肽对三种革兰氏阳性菌(两种金黄色葡萄球菌和一种表皮葡萄球菌)的抗菌活性评价
[0431]
为了分析alld型肽对革兰氏阳性菌的抗菌活性，确认了对三种革兰氏阳性菌(两种金黄色葡萄球菌和一种表皮葡萄球菌)的抗菌活性。
[0432]
为了测量最低抑菌浓度(mic
50
，杀灭50％细菌的最低浓度；mic
100
，完全杀灭细菌所需的最低浓度)，评估了一种抗菌活性实验方法。
[0433]
更具体地，将100μl培养基分配到96孔板的每个孔中，并且在第一列中分配200μl
培养基中的抗生素和肽。从第1列至第11列进行1/2连续稀释，将先前培养的三种革兰氏阳性菌(两种金黄色葡萄球菌和一种表皮葡萄球菌)稀释(稀释时的od
600nm
值：约0.0025)并分配到每个孔中。将所述板在37℃培养箱中培养4小时，并在od
600nm
处测量。以空白(仅含培养基和细菌的孔)的od
600nm
值确定细菌生长率为100％，确定具有50％或100％生长抑制率的od
600nm
值处的抗生素和肽的浓度以计算mic
50
和mic
100
值。
[0434]
因此，作为对革兰氏阳性菌的抗菌活性分析的结果，证实了三种类型的肽(alld fp12
‑
nh2、alld fp13
‑
nh2和alld fp21
‑
nh2)(其中进一步引入了非天然氨基酸和氨基酸异构体(异质同晶的d型氨基酸))对革兰氏阳性菌表现出与蜂毒肽同等水平的优异抗菌活性。
[0435]
[表7]
[0436][0437]
实施例11：肽对模拟革兰氏阳性菌细胞膜的脂质体的破坏能力的测量
[0438]
为了研究fp12
‑
nh2、fp13
‑
nh2、alld fp12
‑
nh2和alld fp13
‑
nh2肽的作用机制，测量了肽对模拟细菌细胞膜的脂质体的破坏能力。
[0439]
为了执行确认肽的抗菌作用是否表现出通过靶向革兰氏阳性菌的细胞膜来杀死细菌的作用机制的实验，制备由eypg/eypc(6:4,w/w)组成的模仿革兰氏阳性菌的细胞膜的脂质体，其包裹了荧光染料钙黄绿素，用于染料渗漏试验。
[0440]
因此，fp12
‑
nh2、fp13
‑
nh2、alld fp12
‑
nh2和alld fp13
‑
nh2肽导致模拟细菌细胞膜的eypg/eypc(6:4,w/w)脂质体的高染料泄漏，表明极好的破坏细菌细胞膜的能力。因此，可以看出本发明的fp12
‑
nh2、fp13
‑
nh2、alld fp12
‑
nh2和alld fp13
‑
nh2肽具有破坏革兰氏阳性菌细胞膜的作用机制(图6)。
[0441]
实施例12：测量alld fp13
‑
nh2的革兰氏阳性菌衍生的lta和lpp结合能力
[0442]
进行以下实验以通过确认肽对革兰氏阳性菌的抗菌活性来确认作用机制。
[0443]
使用alld fp13
‑
nh2通过itc分析证实对脂磷壁酸(lta)和脂蛋白(lpp)的结合亲和力，它们是革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌)的细胞壁成分。
[0444]
结合亲和力使用itc分析法确认，并加以必要的修正应用实施例1中的实验方法。
[0445]
结果证实，alld fp13
‑
nh2与作为革兰氏阳性菌细胞壁成分的lta和lpp结合。确认lpp包含在lta中，但不与包括突变的lta的lpp结合，并且预期lpp在fp13
‑
nh2和lta的结合中起更重要的作用。因此，证实lpp结合在fp13
‑
nh2对革兰氏阳性菌的抗菌活性机制中是重要的。
[0446]
以上对本发明的描述仅用于说明目的，本发明所属领域的普通技术人员可以理解，在不脱离本发明技术精神或基本特征的前提下，可以容易地将本文公开的示例性实施方式修改为其他具体形式。因此，上述示例性实施方式在所有方面都应被解释为说明性而
[0479]
alld fp13
‑
nh2[0480]
lys leu arg val lys leu arg arg tyr leu arg
[0481]
10
[0482]
alld fp
‑
13
‑
9a
‑
nh2[0483]
lys leu arg val lys leu arg arg ala leu arg
[0484]
11
[0485]
alld fp
‑
13
‑
9w
‑
nh2[0486]
lys leu arg val lys leu arg arg trp leu arg
[0487]
12
[0488]
alld fp
‑
13
‑
9k
‑
nh2[0489]
lys leu arg val lys leu arg arg lys leu arg
[0490]
13
[0491]
alld fp13
‑
nh2(acoh)
[0492]
lys leu arg val lys leu arg arg tyr leu arg
[0493]
14
[0494]
peg
‑
alld fp13
‑
nh2(acoh)
[0495]
lys leu arg val lys leu arg arg tyr leu arg
[0496]
15
[0497]
fp12
[0498]
arg leu arg val lys lys leu arg arg tyr leu arg
[0499]
16
[0500]
fp13
[0501]
lys leu arg val lys leu arg arg tyr leu arg
[0502]
17
[0503]
alld fp21
‑
nh2[0504]
arg leu arg val list lys leu arg arg trp leu arg
[0505]
18
[0506]
alld fp
‑
13
‑
9d
‑
nh2[0507]
lys leu arg val lys leu arg arg asp leu arg