用于检测玉米细菌性叶斑病菌的特异性引物和探针及实时荧光定量PCR检测试剂盒的制作方法

用于检测玉米细菌性叶斑病菌的特异性引物和探针及实时荧光定量pcr检测试剂盒
技术领域
1.本发明涉及用于检测玉米细菌性叶斑病菌的特异性引物和探针及实时荧光定量pcr检测试剂盒。


背景技术：

2.玉米细菌性叶斑病(acidovoraxavenaesubsp.avenae)是由细菌引起的，该病主要发生在叶片上，有时也发生在叶柄及茎部。病害症状表现为各种斑点、坏死甚至引起整株萎蔫。近年来，一些细菌引起的玉米叶斑病有逐年加重的趋势，感病品种既有普通玉米，也有甜糯玉米。玉米细菌性叶斑病具有传播快、发病迅速和控制难度大等特征，已在局部地区开始影响玉米生产。由于细菌性叶斑病的症状表现多样，品种和气候条件的差异，以及玉米生育期的不同都可能对症状特征的形成有影响，造成田间辨认困难，也加大了对这类病害的鉴定难度。为此，研究我国玉米细菌性叶斑病致病菌快速、高效的检测势在必行。
3.目前针对其检测方法主要有分离培养法、表型症状鉴定和普通pcr检测等方法。分离培养法检测方法操作复杂、耗时较长且检出效率低，不适合快速检测；田间种植表型症状鉴定结果不稳定、耗时长等；普通pcr技术灵敏度低，且无法实时鉴测pcr过程。随着分子生物学技术的不断发展，实时荧光定量pcr目前已广泛应用于菌种的检测，其与常规的分离培养和常规pcr技术相比，具有耗时短、操作简便、特异性好，且结果可直接观察，能有效避免交叉污染等优点。


技术实现要素：

4.为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了用于检测玉米细菌性叶斑病菌的特异性引物和探针及实时荧光定量pcr检测试剂盒。本发明旨在建立一种基于qpcr技术的用于植物病菌的检测方法，包括上游引物、下游引物和荧光探针，该方法所基于的序列高度保守、高度特异性，可选择性地扩增玉米细菌性叶斑病菌，从而将其与常见的玉米病害其它菌种分开。基于该病菌的实时荧光定量pcr检测方法，具有较高的特异性、灵敏性和操作便利性等优点。
5.本发明提供用于检测玉米细菌性叶斑病菌的特异性引物和探针，所述特异性引物为下述序列或为下述序列的互补链序列：
6.上游引物f：5'
‑
ctgcatggctgtcgtca
‑
3'；
7.下游引物r：5'
‑
accttcctccggtttatca
‑
3'；
8.所述探针序列为：5'
‑
atcctttgttgccagcgattcggt
‑
3'。
9.作为优选，所述探针中5’端标记的荧光报告基团为fam；3’端标记的荧光淬灭基团为tamra。
10.作为优选，所述上游引物和所述下游引物为向5’端和3’端方向延伸一至数个碱基或删减一至数个碱基得到的序列。
11.本发明提供一种用于检测玉米细菌性叶斑病菌的实时荧光定量pcr试剂盒，所述实时荧光定量pcr试剂盒包括上述的特异性引物和探针。
12.作为优选，在25ul pcr反应体系中，所述上游引物的用量为0.4ul，所述下游引物的用量为0.4ul，所述探针的用量为0.2ul。
13.作为优选，所述实时荧光定量pcr试剂盒还包括系列浓度标准品，所述标准品的核苷酸序列为序列表中seq id no.1。
14.本发明提供上述的特异性引物和探针、实时荧光定量pcr试剂盒在如下任一中的应用：
15.(1)定性检测或辅助检测玉米细菌性叶斑病菌；
16.(2)制备定性检测或辅助检测玉米细菌性叶斑病菌的产品。
17.本发明提供一种定性检测玉米细菌性叶斑病菌的方法，分别阳性质粒标准品和待测样品dna为模板，以ddh2o为空白对照，利用上述的特异性引物和探针进行实时荧光定量pcr，根据荧光曲线判断样品是否为阳性，具体为：ct值≤35时，为阳性，反之，则为阴性。
18.作为优选，所述实时荧光定量pcr的反应条件为：
[0019][0020]
本发明的有益效果在于：
[0021]
本发明提供用于检测玉米细菌性叶斑病菌的高度保守的特异性基因的耙序列，设计上游引物和下游引物，该序列的扩增长度为133bp，其对玉米细菌性叶斑病菌具有较高的特异性，能有效地将其与玉米其他的病菌害区分开来；同时还提供了与上游引物和下游引物相对应的探针，通过荧光探针的实时荧光定量pcr反应，应用于一步荧光法定性检测玉米细菌性叶斑菌的样品，其具有较高的灵敏度和特异性。
附图说明
[0022]
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
[0023]
图1为实施例1引物的ncbi primer
‑
blast结果图。
[0024]
图2为本发明建立体系的扩增曲线。
[0025]
图3为本发明的4个稀释浓度的标准品扩增曲线。
[0026]
图4为仪器自带软件绘制标准品的标准曲线。
[0027]
图5为本发明检测方法的灵敏度试验曲线。
[0028]
图6为本发明检测方法的特异性试验曲线。
[0029]
图7为本发明检测方法的稳定性评价的扩增曲线。
[0030]
图8为本发明检测方法对样品检测的扩增曲线。
具体实施方式
[0031]
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。所用引物和探针序列合成由安徽通用生物技术有限公司完成；质粒快速合成由武汉金凯瑞公司完成。
[0032]
实施例1引物和探针的设计与合成
[0033]
本发明根据ncbi的核酸序列数据库genebank公开的玉米细菌性叶斑病菌的高度保守的、特异的16s rrna基因序列(accession number:eu331415.1)作为靶序列，利用软件primer5.0和oligo 7设计引物和探针。在ncbi primer
‑
blast进行引物特异性比对，结果见图1。选择特异性高的2对引物送至公司合成，利用染料法进行引物筛选。根据筛选的引物合成特异性探针，探针序列的荧光报告基团设计：5’端标记的荧光报告基团为fam，3’端标记的荧光淬灭基团为tamra。
[0034]
图1为实施例1引物的ncbi primer
‑
blast结果图。
[0035]
目的片段如下所示：
[0036][0037]
其中，单下划线部分表示引物所在位置，虚线部分表示探针所在位置。
[0038]
上游引物f：5'
‑
ctgcatggctgtcgtca
‑
3'；
[0039]
下游引物r：5'
‑
accttcctccggtttatca
‑
3'；
[0040]
探针：fam
‑
atcctttgttgccagcgattcggt
‑
tamra。
[0041]
实施例2模板dna的制备
[0042]
1、将实施例1中目的片段，送至武汉金凯瑞公司快速合成标准阳性质粒，制备标准品。
[0043]
(1)利用北京百泰克生物科技有限公司超微量紫外可见分光光度计(nd5000)，对合成的质粒dna测定，测定a
260
、a
280
，根据a
260
/a
280
判断质粒的纯度；
[0044]
(2)在进行实时荧光定量pcr时，需要以“拷贝数”为单位，因此将单位转换成copies/μl。质粒浓度(拷贝数)计算：
[0045]
质粒copies/μl＝阿伏伽德罗常数
×
质粒摩尔数，其中，阿伏伽德罗常数＝6.02
×
10
23
copies/mol；质粒的分子量＝(目的基因长度 载体长度)bp
×
660(每对碱基的平均分子量)；即质粒copies/ul＝(6.02
×
10
23
)
×
(？ng/ul
×
10
‑9)/(dna length
×
660)。
[0046]
(3)测得质粒浓度为3.0ng/μl，因此质粒(6.02
×
10
23
)
×
(2.5ng/ul
×
10
‑9)/(3090
×
660)＝0.89
×
109copies/ul。
[0047]
(4)浓度为0.89
×
109copies/ul的质粒11.24ul，加入ddh2o 88.76ul，稀释浓度为1.0
×
108copies/ul作为标准品。再进行10倍比梯度稀释，获得1.0
×
107～1.0
×
101copies/
ul一系列浓度的阳性质粒标准品，并于
‑
20℃保存备用。
[0048]
2、提取玉米细菌性叶斑病菌、玉米细菌性枯萎病菌dna，采用北京百泰克公司的细菌基因组提取试剂盒，具体提取方法如下：
[0049]
(1)取1ml培养菌液，10,000rpm，离心30s，弃上清，收集菌体，尽可能的吸净上清；
[0050]
(2)加入200μl缓冲液rb重悬洗涤细胞，10,000rpm，离心30秒，弃上清后将细胞振荡或者吹打重悬于200μl缓冲液rb中；
[0051]
(3)加入200μl结合液cb，立刻剧烈颠倒轻摇充分混匀，再加入20μl蛋白酶k(20mg/ml))溶液，充分混匀，70℃放置10min；
[0052]
(4)冷却后加入100μl异丙醇，剧烈颠倒轻摇充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀；
[0053]
(5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱ac中，(吸附柱放入收集管中)10,000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液；
[0054]
(6)加入500ul抑制物去除液ir，10,000rpm离心30s，弃废液；
[0055]
(7)加入700ul漂洗液wb，10,000rpm离心30s，弃掉废液；
[0056]
(8)加入500ul漂洗液wb，10,000rpm离心30s，弃掉废液；
[0057]
(9)将吸附柱ac放回空收集管中，10,000rpm离心2min，尽量除去漂洗液；
[0058]
(10)取出吸附柱ac，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加100ul洗脱缓冲液eb(洗脱缓冲液事先在65
‑
70℃水浴中预热)，室温放置3min，12,000rpm离心1min；
[0059]
(11)dna可以存放在2
‑
8℃，如果要长时间存放，可以放置在
‑
20℃。
[0060]
玉米褪绿斑驳病毒的dna提取，采用北京百泰克公司的真菌基因组dna试剂盒，具体提取方法如下：
[0061]
(1)取1ml菌悬液，加入1.5ml离心管，8000r/min离心2分钟，弃上清液；
[0062]
(2)加入550ul 65℃预热buffer fp1和4ul rnasea剧烈涡旋震荡混匀菌液沉淀，混匀后放入65℃水浴30min，期间激烈涡旋震荡3次；
[0063]
(3)加入130ul buffer p2，充分混匀，12000rmp离心3min；
[0064]
(4)小心吸取上清到一个分离柱a，注意不要吸到界面物质，12000rmp离心1min，收集下液；
[0065]
(5)加入1.5倍体积的buffer p3立刻轻柔涡旋，充分混匀；
[0066]
(6)将上一步所得的混合物加入一个吸附柱ac中，12000rmp离心1min，倒掉收集管中的废液；
[0067]
(7)加入700μl漂洗液wb(请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rmp离心1min，弃掉废液；
[0068]
(8)加入500μl漂洗液wb，12000rmp离心1min，弃掉废液；
[0069]
(9)将吸附柱ac放回空收集管中，12000rmp离心3
‑
5min；
[0070]
(10)取出吸附柱ac，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加50ul洗脱缓冲液eb(在65
‑
70℃水浴中预热)，室温放置3
‑
5min，12000rmp离心1min收集dna；
[0071]
(11)dna存放在2
‑
8℃，如果要长时间存放，可以放置在
‑
20℃备用。
[0072]
实施例3实时荧光定量pcr反应条件的优化和标准曲线的绘制
[0073]
(1)实时荧光定量pcr反应条件的优化
[0074]
通过对实施例1筛选的引物和探针进行稀释，加入去离子水将其浓度稀释为10um
的工作液，进行实时荧光定量pcr扩增。建立反应体系。
[0075]
pcr反应体系为：2
×
acequ

master mix 12.5ul，10um上游引物0.4ul，10um下游引物0.4ul，10um探针0.2ul，模板dna2ul，ddh2o 9.5ul，反应总体积为25ul。以实施例2的阳性质粒标准品(浓度为1.0
×
107copies/ul)作为模板，ddh2o为空白对照。
[0076]
实时荧光定量pcr反应条件为：
[0077][0078]
图2为本发明建立体系的扩增曲线(进行3次平行试验)。其中，a：1.0
×
107copies/ul；b：空白对照。
[0079]
(2)实时荧光定量pcr标准曲线的绘制
[0080]
使用实施例1的引物和探针，分别以实施例2获得的系列浓度的阳性质粒标准品(浓度分别为：1.0
×
108、1.0
×
107、1.0
×
106、1.0
×
105copies/ul、1.0
×
104copies/ul)为模板，ddh2o为空白对照，采用步骤(1)中的反应体系和反应条件，进行实时荧光定量pcr扩增(每个浓度3次平行试验)，得到标准品的扩增曲线，见图3。以质粒标准品浓度的对数为横坐标，以ct值为纵坐标，用实时荧光定量pcr仪自带的分析软件绘制标准曲线见图4。本发明标准曲线方程为y＝
‑
3.38x 39.94。标准曲线呈良好的线性关系，r2＝0.9994，相关系数高，满足实时荧光定量pcr检测的要求。
[0081]
图3为本发明的5种浓度梯度的标准品扩增曲线。其中，a：1.0
×
108copies/ul；b：1.0
×
107copies/ul；c：1.0
×
106copies/ul；d：1.0
×
105copies/ul；e：1.0
×
104copies/ul；f：空白对照。
[0082]
图4为仪器自带软件绘制标准品的标准曲线。
[0083]
实施例4检测玉米细菌性叶斑病菌的实时荧光定量pcr试剂盒
[0084]
按照下列组成配制用于检测玉米细菌性叶斑病菌的试剂盒：2
×
acequ master mix，10um上游引物、10um下游引物、10um探针、实施例2制备的阳性质粒标准品(浓度为：1.0
×
106copies/ul)，ddh2o。
[0085]
上游引物、下游引物、探针均为实施例1中所述。
[0086]
该试剂盒的反应体系可以为：2
×
acequ

master mix 12.5ul，10um上游引物0.4ul，10um下游引物0.4ul，10um探针0.2ul，模板dna2ul，ddh2o 9.5ul，反应总体积为25ul。
[0087]
该试剂盒进行实时荧光定量pcr的反应条件为：
[0088][0089]
应用该试剂盒对样品进行检测时，根据仪器所检测到的荧光信号获得荧光曲线，并根据荧光曲线判断样品是否为阳性，具体为：ct值≤35时，为阳性，反之，则为阴性。
[0090]
实施例5检测玉米细菌性叶斑病菌的实时荧光定量pcr的灵敏度试验
[0091]
使用实施例4中所述的试剂盒，反应体系和反应条件，以实施例2制备的阳性质粒标准品1.0
×
104～1.0
×
101copies/ul为模板(每个浓度3次平行试验)，进行qpcr扩增检测，以确定本发明检测方法的最低检出限。根据仪器检测的荧光信号获得荧光曲线，结果见图5。由图5可知，实时荧光定量pcr的检出下限为1.0
×
102copies/ul。
[0092]
图5为本发明检测方法的灵敏度试验曲线。其中，a：1.0
×
104copies/ul；b：1.0
×
103copies/ul；c：1.0
×
102copies/ul；d：1.0
×
101copies/ul；e：空白对照。
[0093]
实施例6检测玉米细菌性叶斑病菌的实时荧光定量pcr的特异性试验
[0094]
以实施例2的步骤2中所述的玉米细菌性叶斑菌、玉米细菌性细菌性枯萎病菌、玉米褪绿斑驳病毒的dna为模板，ddh2o为空白对照，使用实施例4中所述的试剂盒，同时以实施例2步骤1中所述的浓度为1.0
×
107copies/ul的阳性质粒标准品为阳性对照，采用实施例4的方法进行3次平行试验qpcr扩增，以进行特异性试验检测。根据仪器所检测到的荧光信号获得荧光曲线，检测结果如图6所示。由图6可知，玉米细菌性叶斑病dna检测为阳性，玉米细菌性枯萎病菌、玉米褪绿斑驳病毒dna检测均为阴性，表明本发明具有很好的特异性。
[0095]
图6为本发明检测方法的特异性试验曲线。其中，a：阳性对照；b：玉米细菌性叶斑病菌；c：玉米细菌性枯萎病菌、玉米褪绿斑驳病毒、ddh2o。
[0096]
实施例7检测玉米细菌性叶斑病菌的实时荧光定量pcr的稳定性试验
[0097]
以实施例4建立的实时荧光定量pcr检测方法，进行3批重复性试验检测，每批重复3次平行试验，以稀释的标准品评价检测方法的稳定性，结果见图7。计算同一个批次内3次平行和3批重复检测批间的ct值误差均小于0.5，变异系数均小于5％(表1和表2)，表明本发明的方法具有较高的稳定性和重复性。
[0098]
图7为本发明检测方法的稳定性评价的扩增曲线。其中，a、b、c为3次稳定性重复扩增曲线；图中a～e分别为：a：1.0
×
108copies/ul；b：1.0
×
107copies/ul；c：1.0
×
106copies/ul；d：1.0
×
105copies/ul；e：空白对照。
[0099]
表1本发明方法的稳定性试验结果(同一批次)
[0100]
[0101][0102]
表2本发明方法的稳定性试验结果(不同批次)
[0103][0104]
实施例8玉米细菌性叶斑病菌的样品鉴定试验
[0105]
1、玉米细菌性叶斑病菌dna的制备：采用实施例2中步骤2所述的北京百泰克公司的细菌基因组提取试剂盒提取dna。
[0106]
2、利用实施例4所述的玉米细菌性叶斑病菌的实时荧光定量pcr检测试剂盒，检测样本。具体为：
[0107]
(1)以待测样品dna、实施例2制备的标准品质粒(1.0
×
107copies/ul)作为模板，ddh2o为空白对照，进行3次平行试验。
[0108]
(2)采用实施例4所述的实时荧光定量pcr反应体系为：2
×
acequ

master mix12.5ul，10um上游引物0.4ul，10um下游引物0.4ul，10um探针0.2ul，模板dna2ul，ddh2o 9.5ul，反应总体积为25ul。
[0109]
其中，上游引物f：5'
‑
ctgcatggctgtcgtca
‑
3'；
[0110]
下游引物r：5'
‑
accttcctccggtttatca
‑
3'；
[0111]
探针：fam
‑
atcctttgttgccagcgattcggt
‑
tamra。
[0112]
实时荧光定量pcr反应条件为：
[0113][0114]
根据仪器所检测到的荧光信号获得荧光曲线，如图8所示。检测结果如下表3。
[0115]
表3样品鉴定结果
[0116][0117][0118]
图8为本发明检测方法对样品检测的扩增曲线。其中，a：1.0
×
107copies/ul；b：样品；c：空白对照。
[0119]
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。