一种抗新冠病毒N蛋白的单克隆抗体及其应用的制作方法

一种抗新冠病毒n蛋白的单克隆抗体及其应用
技术领域
1.本发明涉及一种抗新冠病毒n蛋白的单克隆抗体及其应用，属于生物技术领域。


背景技术：

2.新冠病毒(severe actue respiratory syndrome coronavirus，sars
‑
cov
‑
2)是具有包膜的正链rna病毒，属于冠状病毒β属，其感染引起的肺炎被世界卫生组织命名为covid
‑
19。核衣壳蛋白(nucleocapsid protein)即n蛋白，是新冠病毒的主要结构蛋白之一，在病毒的结构蛋白中所占比例最大，由n
‑
端区(n
‑
terminal domain，ntd)和c
‑
端区(c
‑
terminal domain，ctd)组成。n蛋白与病毒基因组rna结合构成病毒核衣壳，参与调节病毒rna的转录及复制，与致病性密切相关。通过公开的新冠病毒的全基因组数据分析发现，n蛋白在不同地区的新冠病毒中几乎没有变异，在冠状病毒间变异也较小，且核心结构区域保守。n蛋白的保守性和高抗原性导致其常被用来作为冠状病毒的诊断抗原，对n蛋白的研究也有助于对新冠病毒的更透彻了解。目前，新冠病毒来源尚未阐明，是否存在跨种传播也有待明确。新冠病毒的感染机制研究、流行病学调查和临床诊断方法建立都需使用单克隆抗体。


技术实现要素：

3.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种抗新冠病毒n蛋白的单克隆抗体及其应用，所述单克隆抗体具有较高的亲和力。
4.为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
5.本发明以大肠杆菌中表达并纯化的n蛋白为抗原免疫balb/c小鼠，通过杂交瘤技术筛选阳性细胞，选取上清效价高的细胞通过小鼠腹水诱生法制备单抗，检测抗体亲和力及结合结构域，扩增抗体轻重链可变区并分析其互补决定区(cdr)序列。
6.一种抗新冠病毒n蛋白的单克隆抗体，所述单克隆抗体具有seq no.9所示的重链互补决定区cdr3和seq no.15所示的轻链互补决定区cdr3。
7.进一步的，所述单克隆抗体具有seq no.5所示的重链互补决定区cdr1、seq no.7所示的重链互补决定区cdr2、seq no.11所示的轻链互补决定区cdr1和seq no.13所示的轻链互补决定区cdr2。
8.进一步的，所述单克隆抗体的重链具有seq no.3所示的氨基酸序列；所述单克隆抗体的轻链具有seq no.4所示的氨基酸序列。
9.进一步的，编码所述重链互补决定区cdr3的核苷酸序列如seq no.10所示，编码所述轻链互补决定区cdr3的核苷酸序列如seq no.16所示。
10.进一步的，编码所述重链互补决定区cdr1的核苷酸序列如seq no.6所示，编码所述重链互补决定区cdr2的核苷酸序列如seq no.8所示；编码所述轻链互补决定区cdr1的核苷酸序列如seq no.12所示，编码所述轻链互补决定区cdr2的核苷酸序列如seq no.14所示。
11.进一步的，编码所述重链的核苷酸序列如seq no.1所示；编码所述轻链的核苷酸序列如seq no.2所示。
12.一种抗新冠病毒n蛋白的单克隆抗体的应用，所述单克隆抗体用于新冠病毒的检测。
13.有益效果
14.本发明所述单克隆抗体亲和力为9.21
×
10
‑
10
mol/l，达到pm级，且其结合昆虫细胞制备的n蛋白与结合大肠杆菌制备的n蛋白效果相当；所述抗新冠病毒n蛋白的高亲和力鼠单抗为新冠病毒检测和感染机制研究奠定基础。
附图说明
15.图1为实施例1中n蛋白纯化前的聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds
‑
page)分析结果；
16.图2为实施例1中n蛋白纯化后的sds
‑
page分析结果；
17.图3为实施例2中小鼠尾血效价测定结果；
18.图4为实施例5中纯化后3h12抗体的sds
‑
page分析结果；
19.图5为实施例6中3h12抗体特异性鉴定结果；
20.图6为实施例7中3h12抗体结合结构域鉴定结果；
21.图7为实施例8中3h12抗体亲和力测试结果。
具体实施方式
22.下面结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
23.以下实施例中材料来源如下：
24.spf级雌性balb/c小鼠；sp2/0小鼠骨髓瘤细胞(实验室保存)；包含目的基因的pet22b
‑
n、pet22b
‑
ntd、pet22b
‑
ctd质粒(实验室保存)；大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司)；弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂(sigma公司)；dmem培养基(gibco公司)；胎牛血清(gibco公司)；青链霉素混合液(gibco公司)；抗体亚型鉴定试剂盒(北京博奥龙免疫技术有限公司)；超纯rna提取试剂盒(江苏康为世纪生物科技有限公司)；ta/blunt
‑
zero cloning kit(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)；hitrp protein ghp亲和层析柱(ge公司)；pd10脱盐柱(ge公司)；带hrp标记山羊抗小鼠二抗(北京博奥龙免疫技术有限公司)；96孔酶标板(corning公司)；bca蛋白定量试剂盒(上海雅酶生物科技有限公司)。
25.实施例1
26.蛋白纯化：
27.将包含目的基因的pet22b
‑
n、pet22b
‑
ntd、pet22b
‑
ctd质粒分别转化大肠杆菌bl21(de3)感受态，挑取克隆接种于200ml的lb(amp)培养基中37℃、200rpm培养至对数中期，加入终浓度为0.5mm的异丙基
‑
β
‑
d
‑
硫代半乳糖苷(iptg)于20℃、200rpm诱导过夜，4℃、12000rpm离心20min收集菌体，加入20ml结合缓冲液(20mmol/l pb，100mmol/l nacl，20mmol/l咪唑，ph7.2)重悬，冰水浴中超声裂解菌体，4℃、12000rpm离心20min收集上清，0.45μm滤膜过滤，上样至已用结合缓冲液平衡过的ni
2
亲和层析柱，再用洗脱缓冲液(20mmol/l pb，500mmol/l nacl，500mmol/l咪唑，ph7.2)线性梯度洗脱目标蛋白，收集各阶
段洗脱组份进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds
‑
page)分析，得到纯化后的n蛋白。
28.纯化前蛋白的sds
‑
page结果如图1所示，与阴性对照(
‑
)相比，相邻的泳道可见特异性蛋白表达条带，分子量大小约50kda，与n蛋白预期大小相符。如图2所示，经纯化得到的n蛋白纯度大于90％，本实施例所述方法实现了n蛋白在大肠杆菌中的可溶性高表达。
29.采用相同方法表达了n蛋白n端结构域(ntd)和c端结构域(ctd)(如图1所示)，纯化后目标蛋白纯度均在85％以上(如图2所示)。
30.实施例2
31.动物免疫：
32.选取5只spf级6～8周龄雌性balb/c小鼠，编号1～5(mouse1、mouse2、mouse3、mouse4、mouse5)。初次免疫每只小鼠经皮下注射50μg实施例1所述的纯化后的n蛋白。具体地：将300μg实施例1所述的纯化后的n蛋白用磷酸盐缓冲液(pbs)稀释后加入等体积弗氏完全佐剂，充分混匀直至形成稳定的油包水型乳剂，在每只小鼠背部选取5个点，0.2ml/点进行皮下注射；第21d和第42d 50μg实施例1所述的纯化后的n蛋白/只鼠各加强免疫1次(佐剂为弗氏不完全佐剂)；第49d小鼠尾静脉取血，采用间接elisa法测定血清效价。
33.采用间接elisa法测定3次加强免疫后的5只小鼠尾血效价，结果如图3所示。根据结果选取免疫效果最好的5号鼠进行杂交瘤细胞融合实验。
34.实施例3
35.细胞融合：
36.选取三次免疫后血清效价最高的5号小鼠腹腔注射50μg实施例1所述的纯化后的n蛋白进行冲击免疫，3d后进行细胞融合。融合当天，将小鼠断颈处死，在75％(体积百分数)酒精中浸泡5min；无菌条件下分离小鼠脾脏，将脾脏充分研磨后过细胞筛，用少量无血清dmem冲洗后加入50ml离心管，1500r/min离心5min，弃上清，细胞沉淀用dmem重悬，反复清洗3次后用dmem调整脾细胞数目为108个/ml左右；将生长状态良好、处于对数生长期的骨髓瘤sp2/0细胞用dmem清洗2次，调整细胞数目为107个/ml左右(脾细胞:sp2/0细胞＝10:1)；将脾细胞和sp2/0细胞加入50ml离心管后混匀，1500r/min离心5min，小心弃上清，轻弹离心管底部使细胞松散；将离心管置于37℃温水中，1min内缓慢加入1ml聚乙二醇(peg)1500，边加边轻轻摇动，加完后静置90s；在1min内均匀加入1ml dmdm，然后在2min内均匀加入4ml dmdm，800r/min离心3min；小心弃上清，用20ml胎牛血清轻轻重悬细胞沉淀，加入准备好的胸腺细胞，混匀；同时准备30ml经高压灭菌的半固体培养基，倒入含胸腺细胞的离心管中，上下颠倒混匀；均匀倒入25个细胞培养皿中，转移至37℃、5％(体积百分数)co2培养箱中培养，得到融合的细胞。
37.阳性细胞株筛选与克隆化
38.所述融合的细胞用半固体培养基筛选培养2周后，挑取细胞培养皿上的单克隆接种到96孔细胞培养板(板中提前加入胸腺细胞，100μl/孔)，共挑取4块板，置于培养箱中培养；3d后，利用间接elisa法对杂交瘤细胞进行2轮阳性筛选。2轮筛选后得到的阳性杂交瘤细胞经扩大培养后进行3次克隆化，最后冻存稳定阳性细胞株。
39.68株阳性细胞经传代、扩大培养、克隆化筛选后，最终得到8株能稳定分泌抗体的阳性细胞株。
40.2周后镜检计算4块96孔细胞培养板细胞总融合率为100％。elisa筛选得到68株阳
性细胞株，阳性率为17.7％，如表1所示。
41.表1
[0042][0043]
效价测定：
[0044]
采用间接elisa法检测阳性杂交瘤细胞培养液上清效价：用底物包被缓冲液将实施例1所述的纯化后的n蛋白至终浓度为5μg/ml，100μl/孔加入96孔酶标板中，37℃包被2h；300μl/孔磷酸盐吐温缓冲液(pbst)洗涤1次；300μl/孔加入5％脱脂奶粉37℃封闭2h，pbst洗涤3次；用pbst将样品(阳性杂交瘤细胞培养液上清)进行梯度稀释，100μl/孔37℃孵育1h；pbst洗涤5次；1:10000倍(体积比)稀释的hrp标记山羊抗小鼠二抗100μl/孔37℃孵育1h；pbst洗涤5次；100μl/孔加入tmb显色液显色；50μl/孔加入2m h2so4终止反应，酶标仪读取od450吸光值。
[0045]
间接elisa检测结果显示，8株阳性杂交瘤细胞培养上清的效价如表2所示，效价从1:6400至1:204800，其中96孔酶标板中编号为3h12的杂交瘤细胞培养上清效价最高，达到20万倍以上。
[0046]
抗体亚型鉴定：
[0047]
根据抗体亚型鉴定试剂盒说明书对细胞亚型进行鉴定。
[0048]
采用亚型鉴定试剂盒对细胞亚型进行鉴定，结果显示有6株抗体重链为igg1型，2株为igm型；5株抗体轻链为κ型，3株为λ型(如表2所示)。因此选取其中细胞培养上清效价最高的3h12杂交瘤细胞进行后续抗体制备实验。
[0049]
表2
[0050][0051]
实施例4
[0052]
将3h12阳性杂交瘤细胞株扩大培养后低速离心收集细胞，按超纯rna提取试剂盒说明书提取细胞总rna并逆转录为cdna，pcr扩增抗体重链、轻链的可变区基因(简并引物如表3所示)。1％(质量百分数)琼脂糖凝胶电泳后切胶回收目的片段，连入t载体并转入dh5α感受态涂lb(amp
‑
iptg
‑
x
‑
gal)平板，挑白斑至lb(amp)培养基中培养后送测序；目的序列经igblast软件比对及分析。
[0053]
表3
[0054][0055]
目的序列测序结果如下：
[0056]
编码所述重链的核苷酸序列如下seq no.1：
[0057]
caggtcaaactgcaggagtcaggagctgagctggtgaggcctggggcttcagtgaagctgtcctgcaagacttctggatacatcttcaccagctactggattcactgggtgaaacagaggtctggacagggccttgagtggattgcaaggctttatcctagaactgataatacttactacagtgagaaattcaagggcaaggccactctgactgcagacaaatcctccagcactgcctacatgcaactcaacagcctgaaatctgaggactctgctgtctatttctgtgtaagaagggatgattactcgtttgcttactggggccaagggactctggtcactgtctccgcagccaaaacgacaccccca；
[0058]
编码所述轻链的核苷酸序列如下seq no.2：
[0059]
gacattgagctcacccagtctccatcctccttatctgcctctctgggagaaagagtcagtctcacttgtcgggcaagtcaggaaattagtggttacttaagctggcttcagcagaaaccagatggaactattaaacgcctgatctacgccgcatccactttagattctggtgtcccaaaaaggttcagtggcagtaggtctgggtcagattattctctcaccatcagcagtcttgagtctgaagattttgcagactattactgtctacaatatggtagttatccgtggacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaacgg；
[0060]
由此可知，所述3h12抗体的重链氨基酸序列如下seq no.3：
[0061]
qvklqesgaelvrpgasvklscktsgyiftsywihwvkqrsgqglewiarlyprtdntyysekfkgkatltadkssstaymqlnslksedsavyfcvrrddysfaywgqgtlvtvsaakttpp；
[0062]
3h12抗体的轻链氨基酸序列如下seq no.4：
[0063]
dieltqspsslsaslgervsltcrasqeisgylswlqqkpdgtikrliyaastldsgvpkrfsgsrsgsdysltisslesedfadyyclqygsypwtfgggtkleikr；
[0064]
经igblast软件分析可知，所述重链中cdr1的数量为8，氨基酸序列为seq no.5：gyiftsyw，编码所述cdr1的核苷酸序列为seq no.6：ggatacatcttcaccagctactgg；
[0065]
经igblast软件分析可知，所述重链中cdr2的数量为8，氨基酸序列为seq no.7：lyprtdnt，编码所述cdr2的核苷酸序列为seq no.8：ctttatcctagaactgataatact；
[0066]
经igblast软件分析可知，所述重链中cdr3的数量为10，氨基酸序列为seq no.9：vrrddysfay，编码所述cdr3的核苷酸序列为seq no.10：agaagggatgattactcgtttgcttac；
[0067]
经igblast软件分析可知，所述轻链中cdr1的数量为6，氨基酸序列为seq no.11：qeisgy，编码所述cdr1的核苷酸序列为seq no.12：caggaaattagtggttac；
[0068]
经igblast软件分析可知，所述轻链中cdr2的数量为3，氨基酸序列为seq no.13：aas，编码所述cdr2的核苷酸序列为seq no.14：gccgcatcc；
[0069]
经igblast软件分析可知，所述轻链中cdr3的数量为9，氨基酸序列为seq no.15：lqygsypwt，编码所述cdr3的核苷酸序列为seq no.16：ctacaatatggtagttatccgtggacg。
[0070]
经igblast软件分析可知，所述3h12抗体的轻链可变区与小鼠胚系基因igkv9
‑
124*01序列同源性为97.9％；所述3h12抗体的重链可变区与小鼠胚系基因ighv1
‑
76*01序列同源性为89.1％，结果如表4显示。
[0071]
表4
[0072][0073][0074]
实施例5
[0075]
腹水制备及抗体纯化：
[0076]
订购6
‑
8周龄雌性balb/c小鼠，每只小鼠腹腔注射0.5ml弗氏不完全佐剂进行小鼠预免疫。7d后取约1
×
106个实施例3所述3h12阳性杂交瘤细胞进行小鼠胞腔注射，同时注射同等数量的sp2/0骨髓瘤细胞作为阴性对照，同体积的dmem培养基作为阴性对照；5d后根据小鼠腹部大小进行腹水抽取，4℃、10000r/min离心15min，吸取中层腹水上清经0.45μm滤膜过滤，protein g柱亲和层析纯化，pd10柱脱盐。sds
‑
page检测抗体纯化效果，使用gel
‑
pro32软件分析抗体纯度，bca蛋白定量试剂盒对纯化抗体进行蛋白定量。
[0077]
间接elisa检测结果显示，3h12阳性杂交瘤细胞腹水上清的效价达到1:2
×
105。将生长状态良好的3h12阳性杂交瘤细胞扩大培养后，通过腹腔注射的方式注入小鼠腹腔内，7d后抽取其腹水。腹水经离心后，通过protein g柱对腹水蛋白进行纯化，pd10柱脱盐换液，sds
‑
page检测纯化蛋白表达情况。如图4所示，3h12纯化抗体在2.5kda和5kda处都有特异性蛋白条带，大小与抗体轻重链分子量相符；通过gelpro32软件分析，3h12抗体蛋白纯度>95％。
[0078]
实施例6
[0079]
抗体特异性鉴定：
[0080]
分别以本实验室从大肠杆菌中表达和纯化的n蛋白以及购买的昆虫细胞表达的n蛋白为抗原，采用间接elisa法鉴定抗体的特异性，将实施例3效价测定中的所述样品替换为纯化后的3h12抗体，其余同实施例3效价测定方法。
[0081]
如图5所示，3h12抗体与大肠杆菌中表达纯化的n蛋白结合效果(3h12
‑
n
‑
e.coli)、3h12抗体与昆虫细胞中表达纯化的n蛋白结合效果(3h12
‑
n
‑
insect)相当。
[0082]
实施例7
[0083]
抗体结合结构域鉴定：
[0084]
以n蛋白、n
‑
ntd、n
‑
ctd为抗原用包被缓冲液稀释至终浓度为5μg/ml后包板采用间接elisa法鉴定抗体结合结构域，将实施例3效价测定中的所述样品替换为所述3h12抗体，其余同实施例3效价测定方法。
[0085]
结果如图6所示，3h12抗体与n蛋白及ntd蛋白两组数据t检验p＝0.103，两者差异无统计学意义(p>0.05)；3h12抗体与n蛋白及ctd蛋白两组数据t检验p＝0.003，两者有非常显著性差异(p<0.01)，说明3h12抗体是与n蛋白的n端结构域(ntd)结合。
[0086]
实施例8
[0087]
抗体亲和力常数测定
[0088]
采用非竞争elisa法测定抗体的亲和力常数。测定4个浓度抗原n蛋白(4、2、1、0.5μg/ml)和15个浓度3h12抗体(10、5、2.5、1.25、0.625、0.313、0.156、0.078、0.039、0.020、0.010、0.005、0.0025、0.00125、0.000625μg/ml)的结合曲线。采用spss2.6软件计算抗体的亲和力常数，origin9.6软件进行曲线拟合，如图7所示。
[0089]
经spss软件计算得出3h12抗体与n蛋白抗原的亲和力常数为9.21
×
10
‑
10
mol/l，达到了pmol/l水平，显示抗体与抗原具有很高的亲和力。
[0090]
综上所述，发明包括但不限于以上实施例，凡是在本发明的精神和原则之下进行的任何等同替换或局部改进，都将视为在本发明的保护范围之内。