一种扩增CTLA4基因SNP位点用引物、检测试剂盒和应用的制作方法

一种扩增ctla4基因snp位点用引物、检测试剂盒和应用
技术领域
1.本发明属于基因分型检测技术领域，具体涉及一种扩增ctla4基因snp位点用引物、检测试剂盒和应用。


背景技术：

2.多发性骨髓瘤(mulitiple myeloma,mm)是血液系统第二大恶性肿瘤，通常表现为骨髓中浆细胞过度增生，肿瘤细胞产生大量单克隆免疫球蛋白并出现于患者血和(或)尿中，称为m蛋白，引起骨痛、病理性骨折、造血异常、单克隆球蛋白血症及肾功能受损等一系列临床变化。目前，mm仍不可治愈，依靠药物治疗仅提高患者5～7年的生存时间，联合硼替佐米、美法仑和泼尼松(称mp方案)是临床治疗的常见化疗方案。
3.snapshot基因分型技术是由美国abi公司开发的一种基于荧光标记单碱基延伸链终止反应原理的分型技术，具有检测速度快、检测准确、灵敏度高的特点，使用0.5ng dna即可进行检测。其原理是在一个含有测序酶、四种荧光标记ddntp、紧临snp位点5
’‑
端的不同长度延伸引物和模板dna的反应体系中，引物延伸一个碱基即终止，经测序仪检测后，根据峰的位置确定该延伸产物对应的snp位点，而根据峰的颜色可得知掺入的碱基种类，从而确定该样本的基因型。
4.然而，目前还未有关于采用snapshot基因分型技术对临床辅助检测多发性骨髓瘤患者的基因型的报道。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种扩增ctla4基因snp位点用引物、检测试剂盒和应用，基于snapshot基因分型技术对能够影响多发性骨髓瘤患者在接受mp方案治疗后的副作用的ctla4基因的rs4553808位点多态性进行检测，确定多发性骨髓瘤患者的基因型，为后续选择用药提供基础。
6.本发明提供了一种扩增ctla4基因snp位点用引物，包括上游引物和下游引物；
7.所述上游引物的核苷酸序列如seq id no:1所示；
8.所述下游引物的核苷酸序列如seq id no:2所示。
9.本发明提供了一种基于snapshot snp分型技术检测ctla4基因snp位点基因型的引物组，包括所述扩增ctla4基因snp位点用引物和单碱基延伸引物；
10.所述单碱基延伸引物的核苷酸序列如seq id no:3所示。
11.本发明提供了所述扩增ctla4基因snp位点用引物或所述引物组在辅助选择多发性骨髓瘤患者化疗用药中的应用。
12.本发明提供了所述扩增ctla4基因snp位点用引物或所述引物组在检测指导泼尼松用药的基因位点多态性中的应用。
13.本发明提供了一种基于snapshot snp分型技术检测ctla4基因snp位点基因型的试剂盒，包括所述扩增ctla4基因snp位点用引物或所述引物组。
14.本发明提供了所述基于snapshot snp分型技术检测ctla4基因snp位点基因型的试剂盒，还包括1
×
hotstartaq buffer、mg
2
、dntp、hotstartaq polymerase和snapshot multiplex kit。
15.本发明提供了所述基于snapshot snp分型技术检测ctla4基因snp位点基因型的试剂盒在检测指导泼尼松用药的基因位点多态性中的应用。
16.本发明提供了所述基于snapshot snp分型技术检测ctla4基因snp位点基因型的试剂盒在辅助选择多发性骨髓瘤患者化疗用药中的应用。
17.本发明提供了一种检测ctla4基因snp位点基因型的方法，包括以下步骤：
18.1)提取待检测样本的基因组dna；
19.2)以步骤1)中提取的基因组dna为模板，用所述扩增ctla4基因snp位点用引物进行pcr扩增，得到pcr扩增产物；
20.3)将所述pcr扩增产物在所述引物组中单碱基延伸引物的作用下进行单碱基延伸反应，得到延伸产物；
21.4)将所述延伸产物进行测序，得到待测样本的ctla4基因snp基因型。
22.优选的，步骤2)中所述pcr扩增的反应程序为95℃，5min；94℃20s，60℃，30s，75℃，1.5min，31循环；72℃，2min；
23.步骤2)中所述pcr扩增的反应体系为10μl，包括1
×
hotstartaq buffer1μl、25mm mg
2
0.6μl、10mm dntp0.2μl、1u hotstartaq polymerase0.15μl、1μl样本dna和1μm上游引物0.5μl和1μm下游引物0.5μl，ddh2o补充至10μl。
24.步骤3)中所述单碱基延伸反应的反应体系为10μl，包括5μl snapshot multiplex kit、2μl pcr扩增产物、1μl浓度为1μm延伸引物和2μl超纯水；
25.步骤3)中所述单碱基延伸反应的反应程序：96℃，1min；96℃10s，55
°
5s，60℃30s，28个循环。
26.本发明提供的扩增ctla4基因snp位点用引物，是针对ctla4基因rs4553808位点设计的特异性pcr扩增引物，所述引物能够准确地扩增出包含rs4553808位点的ctla4基因片段，具有特异性高、扩增准确的特点。
27.本发明提供的检测ctla4基因snp位点基因型的引物组，是基于snapshot snp分型技术进行设计得到。实验表明，采用本发明提供的引物组对ctla4基因snp位点基因型进行检测，20例体检样本检测结果与sanger测序法结果完全一致，显示本发明所述的引物组检测准确性为100％。本发明提供的引物组检测结果准确高的特点，相对于一代测序本身测序反应开始前期的噪音峰的干扰容易造成检测结果不准确的问题具有无法比拟的优势。同时根据测序峰图可知，引物峰消失，产物进行了充分扩增，每个基因型的结果峰高比例清晰，彼此分离，互相无相交，表明本发明的引物特异性和重复性良好，灵敏度高。此外，本发明提供的引物组还具有检测成本低的优点，避免taqman qpcr方法中使用的探针价格高，需要检测大量样本才能平摊探针的成本的缺陷。
28.本发明提供的检测ctla4基因snp位点基因型的方法，是以所述引物扩增和单碱基延伸引物进行的检测，能够准确检测待测样本ctla4基因rs4553808位点snp基因型为aa或ag。实验表明，20个样品中的出现的基因型的占比分别为aa(75.0％)、ag(25.0％)，与千人基因中的中国汉族的数据中aa(76.7％)、ag(23.3％)、gg(0.0％)基本一致，说明本发明提
供的检测方法具有较高的检测准确性。同时，该方法灵敏度高，仅需0.5ng dna即可实现，广泛适用于血卡、口腔试子等微量dna样本。另外，本发明提供的方法检测效率高，全部实验流程6小时内完成，克服了高通量测序对最低测序样本数量多、耗时长的弊端。
附图说明
29.图1为本发明检测样本分型统计结果图；
30.图2为本发明检测样本ag杂合基因型结果图；
31.图3为本发明检测样本aa纯合基因型结果图。
具体实施方式
32.本发明提供了一种扩增ctla4基因snp位点用引物，包括上游引物和下游引物；所述上游引物的核苷酸序列如seq id no:1(acgttggatgacaacctaatgggcacttcc)所示；所述下游引物的核苷酸序列如seq id no:2(acgttggatgctgtgtgttcctcttgaggg)所示。所述引物是针对ctla4基因rs4553808位点设计的扩增引物，能够准确扩增得到包含rs4553808位点snp分子标记的ctla4基因片段。本发明对所述引物的来源不做具体限定，采用本领域所熟知的基因合成方法即可。在本发明实施例中，所述引物委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
33.本发明提供了一种基于snapshot snp分型技术检测ctla4基因snp位点基因型的引物组，包括所述扩增ctla4基因snp位点用引物和单碱基延伸引物；所述单碱基延伸引物的核苷酸序列如seq id no:3(agaatgggcaacagaggttttt)所示。采用所述引物能够扩增得到包含rs4553808位点snp分子标记的ctla4基因片段；所述单碱基延伸引物以所述ctla4基因片段为模板进行延伸反应，得到不同基因型的ctla4基因片段。本发明对所述引物组的来源不做具体限定，采用本领域所熟知的基因合成方法即可。在本发明实施例中，所述引物委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
34.本发明提供了所述扩增ctla4基因snp位点用引物或所述引物组在辅助选择多发性骨髓瘤患者化疗用药中的应用。鉴于ctla4基因的rs4553808位点多态性能够影响多发性骨髓瘤患者在接受mp方案治疗后的副作用以及rs4553808位点基因型为gg的多发性骨髓瘤患者比基因型为aa或ag的多发性骨髓瘤患者更早的出现由硼替佐米诱导的周围神经病变，所述引物或所述引物组能够辅助指导是否选择泼尼松作为多发性骨髓瘤患者化疗用药。
35.鉴于ctla4基因的rs4553808位点多态性能够影响多发性骨髓瘤患者在接受mp方案治疗后的副作用，本发明提供了所述扩增ctla4基因snp位点用引物或所述引物组在检测指导泼尼松用药的基因位点多态性中的应用。
36.本发明提供了一种基于snapshot snp分型技术检测ctla4基因snp位点基因型的试剂盒，包括所述扩增ctla4基因snp位点用引物或所述引物组。所述试剂盒优选还包括1
×
hotstartaq buffer、mg
2
、dntp、hotstartaq polymerase和snapshot multiplex kit。本发明对上述试剂的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的试剂来源即可。
37.本发明提供了所述基于snapshot snp分型技术检测ctla4基因snp位点基因型的试剂盒在检测指导泼尼松用药的基因位点多态性中的应用。
38.本发明提供了所述基于snapshot snp分型技术检测ctla4基因snp位点基因型的
试剂盒在辅助选择多发性骨髓瘤患者化疗用药中的应用。
39.本发明提供了一种检测ctla4基因snp位点基因型的方法，包括以下步骤：
40.1)提取待检测样本的基因组dna；
41.2)以步骤1)中提取的基因组dna为模板，用所述扩增ctla4基因snp位点用引物进行pcr扩增，得到pcr扩增产物；
42.3)将所述pcr扩增产物在所述引物组中单碱基延伸引物的作用下进行单碱基延伸反应，得到延伸产物；
43.4)将所述延伸产物进行测序，得到待测样本的ctla4基因snp基因型。
44.本发明首先提取待检测样本的基因组dna。
45.本发明对提取基因组dna的方法不做特殊限制，采用本领域所熟知的提取样本基因组dna的方法即可，例如试剂盒法。
46.提取dna后，本发明以提取的基因组dna为模板，用所述扩增ctla4基因snp位点用引物进行pcr扩增，得到pcr扩增产物。
47.在本发明中，所述pcr扩增的反应程序优选为95℃，5min；94℃20s，60℃，30s，75℃，1.5min，31循环；72℃，2min。所述pcr扩增的反应体系为10μl，包括1
×
hotstartaq buffer 0.1μl、25mm mg
2
0.6μl、10mm dntp0.2μl、1u hotstartaq polymerase 0.15μl、1μl样本dna和1μm上游引物0.5μl和1μm下游引物0.5μl，ddh2o补充至10μl。
48.在本发明中，所述pcr扩增还优选包括纯化。本发明对所述纯化的方法没有特殊限制采用本领域所熟知的纯化方法即可，例如采用纯化试剂盒进行。
49.纯化后，本发明将纯化后的pcr扩增产物在所述引物组中单碱基延伸引物的作用下进行单碱基延伸反应，得到延伸产物。
50.在本发明中，所述单碱基延伸反应的反应体系为10μl，包括5μl snapshot multiplex kit、2μl pcr扩增产物、1μl浓度为1μm延伸引物和2μl超纯水。所述单碱基延伸反应的反应程序：96℃，1min；96℃10s，55
°
5s，60℃30s，28个循环。
51.在本发明中，所述延伸产物优选还进行纯化。所述纯化优选采用sap酶进行。所述纯化的方法优选在10μl延伸产物中加入1u sap酶，37℃温浴30min，然后75℃灭活15min。
52.纯化后，本发明将纯化后的延伸产物进行测序，得到待测样本的ctla4基因snp基因型。
53.在本发明中，所述测序的体系优选为1μl纯化后的延伸产物、0.3μl liz120 size standard和9μl hi
‑
di。所述测序用测序仪优选为abi3730xl测序仪。
54.在本发明中，优选用genemapper4.1(appliedbiosystems co.,ltd.,usa)分析测序得到的原始数据，得到具体基因型。实验结果表明，20个样品中的出现的基因型的占比分别为aa(75.0％)、ag(25.0％)，与千人基因中的中国汉族的数据中aa(76.7％)、ag(23.3％)、gg(0.0％)基本一致，说明本发明提供的引物组及检测方法具有较高的扩增准确性。
55.下面结合实施例对本发明提供的一种扩增ctla4基因snp位点用引物、检测试剂盒和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
56.实施例1
57.1.唾液/咽拭子等dna提取
58.将采集的20个唾液或在面颊内擦拭过的棉签转置于2ml离心管中，用剪刀将棉签部分从起杆上剪下，加入40μl缓冲液ga。加入20μl proteinase k溶液，涡旋30sec混匀，56℃放置60min，其间每15min涡旋混匀数次。加入400μl缓冲液gb，充分颠倒混匀，70℃放置10min，此时溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的液滴，然后挤压去除拭子，将尽可能多的裂解液转移至新的离心管中。加入200μl无水乙醇，充分颠倒混匀，简短离心以去除管盖内壁的液滴。将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱cr2中(吸附柱cr2放入收集管中)，12000rpm离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cr2放回收集管中。向吸附柱cr2中加入500μl缓冲液gd，12000rpm离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cr2放回收集管中。向吸附柱cr2中加入600μl漂洗液pw，12000rpm离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cr2放回收集管。重复上一步操作。12000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱cr2室温放置数min，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。将吸附柱cr2转入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加30μl洗脱缓冲液tb，室温放置3min，在12000rpm下离心2min，收集dna溶液，质检，4℃保存。(基因组dna提取方法视不同试剂盒而异)
59.2.多重pcr反应：
60.2.1pcr扩增反应
61.反应体系(10μl)包含1x hotstartaq buffer,3.0mm mg
2
、0.3mm dntp,1u hotstartaq polymerase(qiagen inc.)，1μl样本dna，上下游pcr扩增引物(上下游各1μm)各0.5μl。
62.2.2pcr扩增反应程序
[0063][0064][0065]
3.pcr产物纯化
[0066]
在10μl pcr产物中加入5u sap酶和2u exonuclease i酶，37℃温浴30min，然后75℃灭活15min。
[0067]
注：sap酶和exonuclease i酶购自neb(new england biolabs(beijing)ltd.)公司，sap浓度为1u/μl，exon i为20u/μl，添加量为sap 5μl，exonuclease i 0.1μl。
[0068]
4.snapshot多重单碱基延伸反应
[0069]
4.1延伸反应
[0070]
延伸反应体系(10μl)包括5μl snapshot multiplex kit(abi)，2μl纯化后多重pcr产物，1μl延伸引物(浓度为1μm)和2μl超纯水。
[0071]
4.2反应程序
[0072][0073]
5.延伸产物纯化
[0074]
在10μl延伸产物中加入1u sap酶，37℃温浴30min，然后75℃灭活15min.
[0075]
6.延伸产物上abi3730xl测序仪
[0076]
取1μl纯化后的延伸产物与0.3μl liz120 size standard和9μl hi
‑
di混匀，95℃变性5min后上abi3730xl测序仪。
[0077]
7.用genemapper 4.1(appliedbiosystems co.,ltd.,usa)分析abi3730xl测序仪上收集的原始数据。
[0078]
20个样本rs4553808位点基因型检测结果，并采用序列金标准的sanger测序法验证本方法的准确性，结合ensembl、千人基因中的中国汉族的数据，对受检样本进行分析。结果如表2所示。
[0079]
表2儿童用药相关基因snp分型结果
[0080]
样品本方法检测结果sanger测序结果1aaaa2agag3aaaa4aaaa5aaaa6aaaa7agag8aaaa9agag10aaaa11aaaa12agag13agag14aaaa15aaaa16aaaa17aaaa18aaaa19aaaa20aaaa
[0081]
结果显示，20例体检样本检测结果与sanger测序法结果完全一致，显示本发明所
述的试剂盒及检测体系结果准确性为100％。20个样品中的出现的基因型的占比分别为aa(75.0％)、ag(25.0％)，与千人基因中的中国汉族的数据中aa(76.7％)、ag(23.3％)、gg(0.0％)基本一致，说明本发明提供的引物组及检测方法具有较高的扩增准确性。
[0082]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。