抑制剂/CaMKII体系及作为生物标志物中的应用的制作方法

抑制剂/camkii体系及作为生物标志物中的应用
技术领域
1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及抑制剂/camkii体系及作为生物标志物中的应用。


背景技术：

2.血管性认知障碍(vascular cognitive impairment，vci)分为轻度和重度，其中重度vci为血管源性痴呆(vascular dementia，vad)。vad是继阿尔茨海默病之后的第二大痴呆类型，其特征是记忆力丧失、认知能力受损和大脑血管损伤。vad是由大脑部分血液供应受限而导致的氧和营养不足引起，引发缺血和随后的病变，最终导致认知能力的下降。vad发病率逐年升高，造成巨大的社会经济负担，亟需有效防治vad的治疗手段。但目前fda没有批准任何治疗vad的药物，早期诊断方法也很匮乏。
3.微小核糖核酸(microrna，mirna)作为一种非编码rna分子，在多种疾病的诊断和治疗中发挥了重要的作用。但在vad中缺乏具有疾病转归意义的mirna。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的目的在于提供抑制剂/camkii体系及作为生物标志物中的应用，抑制剂/camkii可以作为血管源性认知障碍新的治疗靶点。
5.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
6.本发明提供了一种靶向抑制camkii的抑制剂/camkii体系在作为血管源性认知障碍相关的生物标志物中的应用。
7.优选的，所述抑制剂包括mirna
‑
152、mirna
‑
152的同义序列或田蓟苷。
8.本发明还提供了一种靶向抑制camkii的抑制剂在制备预防和/或治疗血管源性认知障碍的药物中的应用。
9.优选的，所述抑制剂包括mirna
‑
152或mirna
‑
152的同义序列。
10.本发明还提供了mirna
‑
152在制备抑制血管源性认知障碍中细胞凋亡的药物中的应用。
11.本发明还提供了mirna
‑
152在制备抑制血管源性认知障碍中炎症反应的药物中的应用。
12.有益效果：本发明提供了一种靶向抑制camkii的抑制剂/camkii体系在作为血管源性认知障碍相关的生物标志物中的应用，并基于该生物标志物提供了靶向抑制camkii的抑制剂在制备预防和/或治疗血管源性认知障碍的药物中的应用，即将抑制剂/camkii作为预防和/或治疗血管源性认知障碍的靶点。在本发明实施例中，分别以mir
‑
152和田蓟苷作为抑制剂进行说明，通过血管源性认知障碍疾病模型，利用针对mir
‑
152和camkii的引物和/或探针，分别检测它们在疾病模型中的表达量，发现mir
‑
152与camkii在血管源性认知障碍疾病进程中表达呈负相关。并且，mir
‑
152通过靶向抑制camkii在血管源性认知障碍中抑制细胞凋亡、减少细胞的炎症反应，最终改善小鼠的学习记忆能力。因此mir
‑
152与
camkii之间的相互作用关系在防治血管源性认知障碍中具有应用价值。本发明还验证了活性化合物田蓟苷通过促进mir
‑
152的表达进而抑制camkii的水平，对2vo模型大鼠空间学习和记忆障碍表现出显著的改善作用。本发明对抑制剂/camkii在血管源性认知障碍中的调控机制研究深入系统，基于以上发现，抑制剂/camkii可以作为血管源性认知障碍新的治疗靶点，以抑制剂/camkii作为防治血管源性认知障碍的应用提供了新的思路。
附图说明
13.图1为本发明实施例1至实施例3中，mir
‑
152在vad模式细胞、vad模式动物和vad患者血清中的表达检测；
14.图2为本发明实施例4中，mir
‑
152对vad模式动物空间学习和记忆功能的影响；
15.图3为本发明实施例5至实施例7中，mir
‑
152对ogd模型细胞活力、凋亡和炎症反应的影响；
16.图4为本发明实施例8至实施例10中，mir
‑
152通过特异性靶向camkii mrna3’utr负向调控其表达；
17.图5为本发明实施例11中，mir
‑
152通过靶向抑制camkii对ogd模型细胞凋亡的影响；
18.图6为本发明实施例12中，mir
‑
152通过靶向抑制camkii对ogd模型细胞炎症反应的影响；
19.图7为本发明实施例13中，mir
‑
152通过靶向抑制camkii对vad模式动物空间学习和记忆的改善作用；
20.图8为活性化合物田蓟苷促进mir
‑
152的表达并抑制camkii的水平；
21.图9为田蓟苷通过提升mir
‑
152的表达发挥对2vo模型大鼠空间学习和记忆障碍的改善作用。
具体实施方式
22.本发明提供了一种靶向抑制camkii的抑制剂/camkii体系在作为血管源性认知障碍相关的生物标志物中的应用。
23.本发明所述抑制剂优选包括mirna
‑
152(seq id no.1：ucagugcaugacagaacuugg)、所述mirna
‑
152的同义序列或田蓟苷。在本发明中，所述mir
‑
152在vad病程中进行性表达下调，并在模拟vad的慢性脑灌注不足和进行性学习记忆下降的大鼠双侧颈总动脉结扎(2
‑
vessel occlusion，2vo)模型的皮层和海马组织中均显著性下调表达；而且mir
‑
152在vad患者血清中表达显著降低，证实mir
‑
152的表达变化与vad密切相关，同时mir
‑
152表达上调提高2vo模型大鼠的空间学习能力。本发明所述2vo模型的制备方法优选参考liu等的方法进行制备(liu,d.d.,yuan,x.,chu,s.f.,et al.,cz
‑
7,a new derivative of claulansine f,ameliorates 2vo
‑
induced vascular dementia in rats through a nrf2
‑
mediated antioxidant responses.acta pharmacol sin.2019,40(4):425
‑
440.)。
24.本发明实施例中，还在糖氧剥夺模型(oxygen and glucose deprivation，ogd，可模拟离体脑缺血模型)上，验证mir
‑
152对细胞活力、细胞凋亡水平和细胞中炎症反应的影响，证实mir
‑
152通过内源性凋亡途径抑制ogd模型细胞凋亡并发挥神经保护作用，且mir
‑
152通过p38 mapk/nf
‑
κb p65通路抑制ogd模型细胞的炎症反应。
25.在本发明中，mir
‑
152与camkii在2vo模型大鼠脑组织中的表达呈负相关，并且mir
‑
152与camkii mrna 3’utr特异性结合，mir
‑
152通过靶向camkii实现对细胞凋亡的调控进而发挥神经保护作用，同时mir
‑
152通过靶向camkii抑制ogd模型细胞的炎症反应，并且mir
‑
152通过靶向camkii实现对2vo模型大鼠的空间学习记忆障碍的改善作用。本发明还验证了田蓟苷通过提升mir
‑
152的表达，进而抑制camkii的表达，发挥拮抗vad的神经保护作用。综上，本发明将抑制剂/camkii作为血管源性认知障碍新的治疗靶点。
26.本发明还提供了一种靶向抑制camkii的抑制剂在制备预防和/或治疗血管源性认知障碍的药物中的应用。
27.本发明所述应用优选与上述内容相同，在此不再赘述。
28.本发明还提供了mirna
‑
152在制备抑制血管源性认知障碍中细胞凋亡的药物中的应用。
29.本发明所述应用优选与上述相同，在此不再赘述。
30.本发明还提供了mirna
‑
152在制备抑制血管源性认知障碍中炎症反应的药物中的应用。本发明所述应用优选与上述相同，在此不再赘述。
31.本发明还提供了一种治疗血管源性认知障碍的方法，包括以下步骤：抑制camkii的表达，或提高mirna
‑
152，或提高mirna
‑
152表达的同时抑制camkii的表达。
32.下面结合实施例对本发明提供的抑制剂/camkii体系及作为生物标志物中的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
33.实施例1
34.mir
‑
152在vad模式细胞中的表达变化
35.连二亚硫酸钠(na2s2o4)可通过与细胞周围的o2发生反应，清除氧气并诱导缺氧；另外低糖dmem培养基可以诱导缺糖损伤，共同诱导糖氧剥夺(oxygen
‑
glucose deprivation，ogd)损伤，模拟体外vad的病理变化。本发明使用5mm na2s2o4损伤sh
‑
sy5y细胞(购自美国atcc公司)建立vad细胞模型，并提取细胞中的rna检测mir
‑
152在vad病程中的表达变化。
36.表1逆转录引物序列
[0037][0038]
逆转录反应：25℃5min，50℃15min，85℃5min。
[0039]
表2测定表达变化qpcr所用引物序列
[0040][0041]
qpcr反应：95℃预变性5min；95℃变性10s，60℃退火30s，40循环；融解曲线95℃15s，60℃60s，95℃15s。
[0042]
结果如图1中a所示，5mm na2s2o4损伤细胞1h、2h、3h、4h后，与对照组相比，mir
‑
152的表达均显著降低(mean
±
sd，n＝3，
###
p<0.001)，说明mir
‑
152在vad病程中进行性表达下调。
[0043]
实施例2
[0044]
mir
‑
152在vad模式动物的海马和皮层中的表达变化
[0045]
2vo模型制备：首先应用异氟烷气体麻醉大鼠，剃除前颈部的毛。大鼠仰卧于手术台上，从前颈部的中间剪开，逐级分离筋膜、肌肉和迷走神经，最终将左右两侧颈总动脉分离出来，用7
‑
0号线结扎。假手术组(sham组)只分离颈总动脉、不结扎。手术过程中保持动物的肛温在37℃左右。
[0046]
利用与实施例1中相同的qpcr反应检测mir
‑
152在sham组和2vo组大鼠的皮层和海马组织中的表达，结果如图1中b和c所示，与sham组相比，mir
‑
152在2vo大鼠的皮层和海马组织中的表达均显著性下调(mean
±
sd，n＝4，
#
p<0.05)。
[0047]
实施例3
[0048]
mir
‑
152在vad患者的血清中表达下降
[0049]
通过提取5名vad患者和14名同龄对照健康者血清中的rna，利用与实施例1相同的qpcr检测血清中mir
‑
152的表达变化。实验结果如图1中d所示，mir
‑
152在vad患者血清中表达显著降低(mean
±
sd，n＝5～14，
##
p<0.01)，说明mir
‑
152的表达变化与vad密切相关。
[0050]
实施例4
[0051]
mir
‑
152对2vo模型大鼠的空间学习和记忆障碍的影响
[0052]
选取7周龄sd大鼠，在大鼠脑内注射腺相关病毒(aav9)包装的mir
‑
152(由上海生工生物工程公司合成，参考kaifer ka,villal
ó
n e,o'brien bs,sison sl,smith ce,simon me,marquez j,o'day s,hopkins ae,neff r,rindt h,ebert ad,lorson cl.aav9
‑
mediated delivery of mir
‑
23a reduces disease severity in smn2b/
‑
sma model mice.hum mol genet.2019,28(19):3199
‑
3210.)，采用morris水迷宫实验探究mir
‑
152对2vo模型大鼠空间学习和记忆障碍的作用。
[0053]
实验结果显示，上调mir
‑
152的表达显著改善2vo模型大鼠的空间学习和记忆障碍，具体表现为：
[0054]
在定位航行试验中，每组大鼠寻找平台的潜伏期随着训练次数的增加而缩短(图2中a，mean
±
sd，n＝7，p<0.001)，不同处理组大鼠的潜伏期出现了显著性差异(p<0.001)。对潜伏期随时间变化的趋势进行组间比较，与2vo nc(negative control，阴性对照)组大鼠
相比，mir
‑
152表达上调显著降低了大鼠的潜伏期(p<0.01)。然而，各组大鼠之间的游泳速度没有显著性差异(图2中b)，表明大鼠的运动功能没有受到不同处理因素的影响，mir
‑
152表达上调提高2vo模型大鼠的空间学习能力。
[0055]
在空间探索试验中，与2vo nc组大鼠相比，mir
‑
152表达上调显著增加了2vo模型大鼠穿越平台原始位置的次数和在目标象限内持续的时间(图2中c和d，
*
p<0.05)。上述结果表明，mir
‑
152显著提高2vo模型大鼠的空间记忆能力。此外，过表达mir
‑
152对sham组大鼠的学习和记忆能力本身没有影响(图2中a
‑
d)。
[0056]
实施例5
[0057]
mir
‑
152对ogd模型细胞的细胞活力的影响
[0058]
本发明在ogd细胞内分别转染了100nm mir
‑
152mimics或inhibitor(由上海生工生物工程公司合成)后，选用ccl检测细胞活力的变化。
[0059]
实验结果如图3中a所示，mir
‑
152表达上调显著提高ogd模型细胞的存活率(mean
±
sd，n＝4，
**
p<0.01)，而mir
‑
152表达下调则显著降低了ogd模型细胞的活力(
##
p<0.01)。说明mir
‑
152在vad细胞上具有神经保护作用。
[0060]
表3 mir
‑
152mimics和inhibitor序列
[0061][0062]
实施例6
[0063]
mir
‑
152对ogd模型细胞凋亡水平的影响
[0064]
通过流式细胞术检测细胞的凋亡水平(darzynkiewicz,z.,bedner,e.,smolewski,p.flow cytometry in analysis of cell cycle and apoptosis.semin hematol.2001,38(2):179
‑
93.)，确定mir
‑
152保护神经细胞的作用方式。
[0065]
实验结果如图3中b和c所示，上调mir
‑
152的表达显著抑制了ogd模型细胞的凋亡比例，包括早期凋亡、晚期凋亡和总凋亡比例(mean
±
sd，n＝4，
*
p<0.05，
**
p<0.01)，而下调mir
‑
152的表达则显著提高了ogd模型细胞的凋亡水平(
#
p<0.05，
##
p<0.01)。这些结果表明，mir
‑
152通过抑制细胞凋亡进而发挥神经保护作用。
[0066]
基于mir
‑
152对细胞凋亡的抑制作用，本发明进一步利用western blot技术在细胞水平对凋亡相关蛋白进行了检测。实验结果如图3中d和e所示，上调mir
‑
152的表达显著提升了细胞内bcl
‑
2/bax的比例，同时抑制了parp和caspase
‑
3的活性(mean
±
sd，n＝4，
*
p<0.05，
**
p<0.01)；而下调mir
‑
152的表达则显著降低了细胞内bcl
‑
2/bax的比例，同时促进了parp和caspase
‑
3的活性(
#
p<0.05)。结果说明，mir
‑
152通过内源性凋亡途径抑制ogd模型细胞凋亡并发挥神经保护作用。
[0067]
实施例7
[0068]
mir
‑
152对ogd模型细胞中炎症反应的影响
[0069]
由于细胞凋亡途径也参与了mapk家族的激活和引发nf
‑
κb介导的炎症反应，因此本发明应用western blot和elisa技术检测了mir
‑
152对炎症反应的影响。
[0070]
实验结果如图3中f
‑
h所示，上调mir
‑
152的表达显著抑制了细胞内p
‑
p38和p
‑
p65的水平，以及tnf
‑
α和il
‑
6的分泌量(mean
±
sd，n＝4，
*
p<0.05，
**
p<0.01)；而下调mir
‑
152的表达则显著抬升了细胞内p
‑
p38和p
‑
p65的水平，以及tnf
‑
α和il
‑
6的分泌(
#
p<0.05)。结果说明，mir
‑
152通过p38mapk/nf
‑
κbp65通路抑制ogd模型细胞的炎症反应。
[0071]
实施例8
[0072]
mir
‑
152与camkii的表达相关性
[0073]
为了进一步探究mir
‑
152发挥神经保护作用的机制，本发明利用qpcr技术对2vo模型大鼠脑组织中mir
‑
152与camkii的相关性进行分析。(mir
‑
152的检测程序和引物同实施例1)camkii检测如下：
[0074]
表4测定camkii表达的qpcr引物
[0075][0076]
测定camkii表达的qpcr反应：95℃预变性30s；95℃10s，60℃退火30s，40循环；融解曲线95℃15s，60℃60s，95℃15s。
[0077]
实验结果如图4中a所示，mir
‑
152与camkii在2vo模型大鼠脑组织中的表达呈负相关(mean
±
sd，n＝7，r2＝0.573，p<0.05)，说明在vad中mir
‑
152/camkii之间可能具有相互作用关系。
[0078]
实施例9
[0079]
mir
‑
152与camkii的结合情况
[0080]
生物信息学软件(targetscan，http://www.targetscan.org/vert_7.2/)的预测结果显示，mir
‑
152与camkii可能存在靶向关系，而且mir
‑
152与camkii mrna3’utr的特异性结合位点如图4中b所示，结合位点在人和大鼠等物种具有保守性。
[0081]
根据结合位点分别构建了野生型荧光素酶报告基因表达质粒和突变型荧光素酶报告基因表达质粒(载体为pmirglo vector，在多克隆位点区saci xhoi位点插入，由苏州吉玛基因公司合成)(图4中c)，与mir
‑
152 mimics共转染进hek293细胞中，验证mir
‑
152与camkii mrna 3’utr序列结合的特异性。双荧光素酶报告基因检测实验结果如图4中d所示，mir
‑
152显著降低野生型质粒的荧光活性，但对突变型质粒的荧光活性没有影响(mean
±
sd，n＝5，
***
p<0.001)，证明mir
‑
152与camkii mrna 3’utr特异性结合。
[0082]
实施例10
[0083]
mir
‑
152对camkii的调控作用
[0084]
在建立了mir
‑
152和camkii之间的直接关系之后，进一步应用qpcr和western blot技术，验证mir
‑
152对camkii在基因和蛋白质水平表达的影响。
[0085]
实验结果如图4中e
‑
g所示，与对照组相比，mir
‑
152表达上调显著降低了camkii在mrna和蛋白质水平的表达(mean
±
sd，n＝5，
**
p<0.01，
***
p<0.001)，而mir
‑
152表达下调显著提升了camkii的表达(
#
p<0.05，
##
p<0.01)。因此，mir
‑
152负向调控camkii的表达。
[0086]
实施例11
[0087]
mir
‑
152通过靶向camkii抑制ogd模型细胞的内源性凋亡途径
[0088]
首先使用camkii sirna(由上海生工生物工程公司合成)作为mir
‑
152的阳性对照，检测细胞内源性凋亡通路的变化。
[0089]
表5 camkii sirna序列
[0090][0091]
western blot结果如图5中a
‑
c所示，mir
‑
152和camkii sirna均显著抑制内源性凋亡途径中c
‑
parp/parp和caspase
‑
3的水平、提升bcl
‑
2/bax的比例(mean
±
sd，n＝4，
*
p<0.05，
**
p<0.01，
***
p<0.001)。
[0092]
为了进一步阐明mir
‑
152通过靶向camkii实现对细胞凋亡的调控和发挥神经保护作用，本发明在ogd模型细胞中(共表达即同时转染100nm mir
‑
152 mimics和2μg camkii质粒)共表达mir
‑
152 mimics和camkii，实验结果如图5中d
‑
f所示，mir
‑
152与camkii共表达时，camkii显著逆转mir
‑
152的抗凋亡作用(mean
±
sd，n＝4，
#
p<0.05，
##
p<0.01)。由此证实，mir
‑
152通过靶向camkii实现对细胞凋亡的调控进而发挥神经保护作用。
[0093]
实施例12
[0094]
mir
‑
152通过依赖于camkii的表达抑制ogd模型细胞炎症反应
[0095]
在证实mir
‑
152通过p38 mapk/nf
‑
κb p65途径抑制炎症反应的基础上，进一步探究其发挥炎症抑制作用的调控机制。
[0096]
首先使用camkii sirna作为mir
‑
152的阳性对照，western blot结果如图6中a
‑
c所示，mir
‑
152和camkii sirna均显著抑制p
‑
p38和p
‑
p65的水平，减少tnf
‑
α和il
‑
6的分泌量(mean
±
sd，n＝4，
*
p<0.05，
**
p<0.01，
***
p<0.001)。
[0097]
为了进一步阐明mir
‑
152通过靶向camkii减少细胞的炎症反应，本发明在ogd模型细胞中共表达mir
‑
152 mimics和camkii，实验结果如图6中d
‑
f所示，mir
‑
152与camkii共表达时，camkii显著逆转mir
‑
152的抗炎作用(mean
±
sd，n＝4，
#
p<0.05，
##
p<0.01，
###
p<0.001)。由此证实，mir
‑
152通过靶向camkii抑制ogd模型细胞的炎症反应。
[0098]
实施例13
[0099]
mir
‑
152通过靶向camkii对2vo模型大鼠的空间学习记忆障碍的影响
[0100]
在动物水平，应用morris水迷宫实验确证mir
‑
152在vad中通过靶向抑制camkii对
2vo模型大鼠空间学习与记忆障碍的影响。
[0101]
在定位航行试验中，每组大鼠寻找平台的潜伏期随着训练次数的增加而显著缩短(图7中a，mean
±
sem，n＝8，p<0.001)，不同处理组大鼠的潜伏期也出现了显著性差异(p<0.001)。
[0102]
进一步组间分析比较表明，与2vo nc组大鼠相比，camkii sirna显著降低了大鼠的潜伏期(图7中a，p<0.01
‑
0.001)，而与2vo mir
‑
152组大鼠相比，camkii表达上调显著增加了大鼠的潜伏期(p<0.01)。然而，各组大鼠之间的游泳速度没有显著性差异(图7中b)，表明大鼠的运动功能没有受到不同处理因素的影响，camkii sirna显著提高2vo模型大鼠的空间学习能力，而camkii逆转mir
‑
152对2vo模型大鼠空间学习能力的改善作用。
[0103]
在空间探索试验中，与2vo nc组大鼠相比，2vo camkii sirna组大鼠穿越平台原始位置的次数显著增加，并且在目标象限内的持续时间显著延长(图7中c
‑
d，mean
±
sem，n＝8，
*
p<0.05)；与2vo mir
‑
152组大鼠相比，camkii表达上调显著减少了大鼠穿越平台原始位置的次数，缩短了在目标象限内游泳的时间(图7中c
‑
d，
@
p<0.05，
@@
p<0.01)。表明camkii sirna能够提高2vo模型大鼠的空间记忆能力，而camkii逆转mir
‑
152对2vo模型大鼠空间记忆能力的改善作用。此外，camkii sirna对sham大鼠的学习和记忆能力没有影响(图7中a
‑
d)。
[0104]
实施例14
[0105]
活性化合物田蓟苷通过促进mir
‑
152的表达进而抑制camkii的水平
[0106]
引入拮抗vad的活性化合物田蓟苷，首先在2vo大鼠模型上应用qpcr和wb实验验证田蓟苷对mirna
‑
152和camkii表达的影响(mir
‑
152的检测程序和引物同实施例1，wb抗体购买自美国genetex公司和abcam公司)。实验结果发现，40mg/kg田蓟苷显著升高2vo模型大鼠海马和皮层中mir
‑
152的表达水平(图8中a
‑
b，mean
±
sem，n＝5，p<0.01
‑
0.001)，同时20mg/kg和40mg/kg田蓟苷显著抑制ox
‑
camkii(met281/282位点的氧化)的表达(图8中c
‑
d，mean
±
sem，n＝5，p<0.05
‑
0.01)。进一步的morris水迷宫实验表明，40mg/kg田蓟苷显著改善2vo模型大鼠的空间学习和记忆障碍，具体表现为40mg/kg田蓟苷显著降低2vo模型大鼠寻找平台的潜伏期(图9中a，mean
±
sem，n＝8，p<0.01)，并且在空间探索试验中显著增加2vo大鼠穿越平台原始位置的次数和在目标象限内持续的时间(图9中c
‑
d，mean
±
sem，n＝8，p<0.01)。但侧脑室注射mir
‑
152 inhibitor aav9(由上海生工生物工程公司合成，参考方法同前)后显著逆转了田蓟苷对2vo模型大鼠空间学习和记忆障碍的改善作用(图9，p<0.01)。结合mir
‑
152对camkii的抑制关系，上述结果说明田蓟苷通过提升mir
‑
152的表达，进而抑制camkii的表达，发挥拮抗vad的神经保护作用。
[0107]
综上，mir
‑
152通过靶向camkii实现对2vo模型大鼠的空间学习记忆障碍的改善作用。
[0108]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。