新的AAV变体的制作方法

技术特征：
1.一种包含一个或多个氨基酸替换的变体aav衣壳蛋白，所述衣壳蛋白包含对应于天然aav 8或aav9衣壳蛋白的vr viii区的替换氨基酸序列。2.权利要求1所述的变体aav衣壳蛋白，其中所述衣壳蛋白在对应于seq id no：1的第585至597或585至598位氨基酸的氨基酸处包含替换氨基酸序列，或在对应于seq id no：43的第583至595或583至596位氨基酸的氨基酸处包含替换氨基酸序列。3.权利要求2所述的变体aav衣壳蛋白，其中所述在对应于seq id no：1的第585至598位氨基酸的氨基酸处的替换序列是：式i：x1x2x3x4x5x6x7x8x9x
10
x
11
x
12
x
13
x
14
，其中x1是asn或tyr，x2是leu或asn或gln或lys或his或phe，x3是gln或asn，x4是gln或asn或ser或ala或asp或gly，x5是gln或thr或ala或gly或ser或asn，x6是asn或ala或ser或asp或thr或gln，x7是thr或ser或ala或arg或glu或gly，x8是ala或gln或asp或gly或arg或thr，x9是pro或ala或thr，x
10
是gln或thr或ala或ile或ser或asp，x
11
是ile或ala或thr或val或thr或ser或tyr，x
12
是gly或gln或ser或ala或glu，x
13
是thr或ala或leu或asp或ser或asn或val或trp或met，x
14
是val或asp，所述序列不包含seq id no：2的氨基酸序列。4.权利要求2或3所述的变体aav衣壳蛋白，其中所述在对应于seq id no：1的第585至597位氨基酸的氨基酸处的替换序列是：式ii：x1x2x3x4x5x6x7x8x9x
10
x
11
x
12
x
13
，其中x1是asn，x2是leu或asn或phe，x3是gln，x4是gln或asn或ser或ala，x5是thr或ala或ser，x6是asn或ser或thr，x7是thr或ala或gly，x8是ala或gln或gly或arg，x9是pro或ala，x
10
是gln或ala或ile，x
11
是thr或val，x
12
是gly或gln，x
13
是thr或leu或asn或asp。
5.权利要求2
‑
4中的任一项所述的变体aav衣壳蛋白，其中所述序列包含选自seq id no：3
‑
43的氨基酸序列。6.权利要求2
‑
4中的任一项所述的变体aav衣壳蛋白，其中所述序列包含选自seq id no：21、seq id no：25、seq id no：9、seq id no：37的氨基酸序列。7.权利要求2所述的变体aav衣壳蛋白，其中所述在对应于seq id no：43的第583至596位氨基酸的氨基酸处的替换序列是：式i：x1x2x3x4x5x6x7x8x9x
10
x
11
x
12
x
13
x
14
，其中x1是asn或tyr，x2是leu或asn或gln或lys或his或phe，x3是gln或asn，x4是gln或asn或ser或ala或asp或gly，x5是gln或thr或ala或gly或ser或asn，x6是asn或ala或ser或asp或thr或gln，x7是thr或ser或ala或arg或glu或gly，x8是ala或gln或asp或gly或arg或thr，x9是pro或ala或thr，x
10
是gln或thr或ala或ile或ser或asp，x
11
是ile或ala或thr或val或thr或ser或tyrx
12
是gly或gln或ser或ala或glu，x
13
是thr或ala或leu或asp或ser或asn或val或trp或met，x
14
是val或asp，所述序列不包含seq id no：33的氨基酸序列。8.权利要求2或7所述的变体aav衣壳蛋白，其中所述在对应于seq id no：43的第583至595位氨基酸的氨基酸处的替换序列是：式iii：x1x2x3x4x5x6x7x8x9x
10
x
11
x
12
x
13
，其中x1是asn，x2是leu，x3是gln，x4是asn或ser，x5是ala或ser或gly，x6是asn，x7是thr，x8是ala或gln或gly，x9是pro或ala，x
10
是gln或thr或ala，x
11
是thr，x
12
是gly或gln或ala或glu，x
13
是thr或asn或asp。9.权利要求7或8所述的变体aav衣壳蛋白，其中所述序列包含选自seq id no：57
‑
63的
氨基酸序列。10.权利要求7或8所述的变体aav衣壳蛋白，其中所述序列包含选自seq id no：29、seq id no：14、seq id no：9和seq id no：11的氨基酸序列。11.一种分离的多核苷酸，其包含编码权利要求1
‑
10中的任一项所述的变体aav衣壳蛋白的核苷酸序列。12.一种载体，其包含权利要求11所述的分离的多核苷酸。13.一种分离的、遗传修饰的宿主细胞，其包含权利要求11所述的多核苷酸。14.一种重组aav病毒粒子，其包含权利要求1
‑
10所述的变体aav衣壳蛋白。15.一种药物组合物，其包含：a)权利要求14所述的重组腺相关病毒病毒粒子；和b)可药用赋形剂。16.一种重组aav载体，其包含编码权利要求1
‑
10中的任一项所述的变体aav衣壳蛋白的多核苷酸和aav 5’反向末端重复序列(itr)、编码功能性基因产物的工程化核酸序列、指导所述基因产物在靶细胞中的表达的调控序列和aav 3’itr。17.一种将编码功能性基因产物的核酸载体递送到细胞和/或组织的方法，所述方法使用权利要求14所述的重组aav病毒粒子或权利要求16所述的重组aav载体。18.一种治疗疾病的方法，所述方法包括向需要的对象给药有效量的权利要求14所述的重组aav病毒粒子，所述重组aav病毒粒子包含功能性基因产物。19.权利要求17
‑
18中的任一项所述的方法，其中所述基因产物是多肽。20.权利要求19所述的方法，其中所述多肽选自胱硫醚β
‑
合酶(cbs)、因子ix(fix)、因子viii(f8)、葡萄糖
‑6‑
磷酸酶催化亚基(g6pc)、葡萄糖
‑6‑
磷酸酶(g6pase)、β
‑
葡萄糖醛酸酶(gusb)、血色素沉着症蛋白(hfe)、艾杜糖醛酸2
‑
硫酸酯酶(ids)、α
‑1‑
艾杜糖醛酸酶(idua)、低密度脂蛋白受体(ldlr)、肌磷酸化酶(pygm)、α
‑
n
‑
乙酰葡糖胺糖苷酶(naglu)、n
‑
磺基葡萄糖胺磺基水解酶(sgsh)、鸟氨酸氨甲酰基转移酶(otc)、苯丙氨酸羟化酶(pah)、udp葡萄糖醛酸基转移酶1家族多肽a1(ugt1a1)。21.权利要求20所述的方法，其中所述重组aav病毒粒子包含含有选自seq id no：21、seq id no：25、seq id no：9、seq id no：37的氨基酸序列的变体aav8衣壳蛋白或含有seq id no：11的氨基酸序列的变体aav9衣壳蛋白。22.权利要求19所述的方法，其中所述多肽选自酸性α
‑
葡萄糖苷酶(gaa)、apali、芳香族l
‑
氨基酸脱羧酶(aadc)、天冬氨酸酰化酶(aspa)、battenin、蜡样脂褐质沉着症神经元蛋白2(cln2)、分化抗原簇86(cd86或b7
‑
2)、胱硫醚β
‑
合酶(cbs)、肌营养不良蛋白或微小肌营养不良蛋白、共济蛋白(fxn)、胶质细胞源性神经营养因子(gdnf)、谷氨酸脱羧酶1(gad1)、谷氨酸脱羧酶2(gad2)、也被称为β
‑
氨基己糖苷酶α的氨基己糖苷酶aα多肽(hexa)、也被称为β
‑
氨基己糖苷酶β的氨基己糖苷酶bβ多肽(hexb)、白介素12(il
‑
12)、甲基cpg结合蛋白2(mecp2)、肌微管素1(mtm1)、nadh泛醌氧化还原酶亚基4(nd4)、神经生长因子(ngf)、神经肽y(npy)、神经秩蛋白(nrtn)、棕榈酰基
‑
蛋白质硫酯酶1(ppt1)、肌聚糖α、β、γ、δ、ε或ζ(sgca、sgcb、sgcg、sgcd、sgce或sgcz)、与抗体fc融合的肿瘤坏死因子受体(tnfr:fc)、遍在蛋白
‑
蛋白质连接酶e3a(ube3a)、β
‑
半乳糖苷酶1(glb1)。23.权利要求22所述的方法，其中所述重组aav病毒粒子包含含有选自seq id no：9和
11的氨基酸序列的变体aav9衣壳蛋白。24.权利要求19所述的方法，其中所述多肽选自腺嘌呤核苷酸转运体(ant
‑
1)、α
‑1‑
抗胰蛋白酶(aat)、水通道蛋白1(aqp1)、atp酶铜转运蛋白α(atp7a)、心肌atp酶ca 转运慢抽搐蛋白2(serca2)、c1酯酶抑制剂(c1ei)、环化核苷酸门控通道α3(cnga3)、环化核苷酸门控通道β3(cngb3)、囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(cftr)、α
‑
半乳糖苷酶(aga)、葡萄糖脑苷脂酶(gc)、粒细胞
‑
巨噬细胞集落刺激因子(gm
‑
csf)、hiv
‑
1gag
‑
proδrt(tgaac09)、脂蛋白脂肪酶(lpl)、中链酰基辅酶a脱氢酶(mcad)、肌球蛋白7a(myo7a)、核多聚(a)结合蛋白1(pabpn1)、丙酰辅酶a羧化酶α多肽(pcca)、rab escort蛋白
‑
1(rep
‑
1)、视网膜色素上皮特异性蛋白65kda(rpe65)、视网膜劈裂蛋白1(rs1)、短链酰基辅酶a脱氢酶(scad)、极长链酰基辅酶a脱氢酶(vlcad)。25.权利要求24所述的方法，其中所述疾病选自肝病、中枢神经系统疾病和其他疾病。

技术总结
本发明提供了一种变体AAV衣壳蛋白，其包含对应于AAV8的第585至597或598位氨基酸或AAV9的第583至595或596位氨基酸的氨基酸序列，还涉及其多核苷酸、宿主细胞、载体、AAV病毒粒子或药物组合物。本发明还提供了一种治疗疾病的方法，所述方法包括向需要的对象给药有效量的所述重组AAV病毒粒子。量的所述重组AAV病毒粒子。


技术研发人员：冀群升 陆渊 林卿 陈意雄
受保护的技术使用者：上海药明康德新药开发有限公司
技术研发日：2020.10.15
技术公布日：2021/10/19