一种热稳定性提高的甘露糖异构酶突变体的制作方法

1.本发明涉及一种热稳定性提高的甘露糖异构酶突变体，属于酶工程及基因工程技术领域。


背景技术：

2.d
‑
甘露糖是d
‑
葡萄糖在c
‑
2位的差向异构体，也是d
‑
果糖的醛糖异构体。其甜度相当于蔗糖甜度的60％，并且甜度不会随浓度的增加而增加。此外，d
‑
甘露糖热值为3.75kcal/g，低于其他糖类。自然界中d
‑
甘露糖天然存在于甘露聚糖、半纤维素和纤维素中。d
‑
甘露糖具有的这些重要的生理功能，使其可作为膳食补充剂对人体健康做出贡献。d
‑
甘露糖已被证明是合成维生素、抗肿瘤药和免疫刺激剂的重要前体。此外，d
‑
甘露糖也被认为是工业生产功能性甜味剂d
‑
甘露糖醇的最佳原料。因此，d
‑
甘露糖在食品和医疗工业中得到广泛应用，近年来引起人们的广泛关注。
3.目前，d
‑
甘露糖的生产方法主要是天然提取法和化学合成法。例如，利用微波辅助结合硫酸处理法从脱蛋白的棕榈仁中提取d
‑
甘露糖，当底物与溶剂的质量体积比为1：49.6时，在148℃条件下连续处理约10min，d
‑
甘露糖的回收率达到92.11％。在98℃、ph 2.0条件下，55％浓度的d
‑
葡萄糖加入钼酸铵催化剂反应约150min后，可获得32.6％的d
‑
甘露糖。然而，天然提取法由于被提取植物细胞壁中较高的结晶度和聚合作用，使用酸水解和热水解从含甘露聚糖的材料中提取d
‑
甘露糖又需要高温等严格的条件，大大提高了提取成本。另外，d
‑
甘露糖的化学合成涉及复杂的反应，该反应通常在高温和强酸性环境下进行，并且需要用到一种或几种催化剂的参与，在制造过程中增加了副产物和有害污染物的产生。
4.生物转化法因其温和的反应条件和较少的有害副产物，越来越受到广泛的关注。目前，以d
‑
果糖或d
‑
葡萄糖为底物，可以使用4种类型的酶来生产d
‑
甘露糖：包括d
‑
来苏糖异构酶(d
‑
lyxose isomerase,d
‑
liase,ec 5.3.1.15)、d
‑
甘露糖异构酶(d
‑
mannose isomerase，d
‑
miase,ec 5.3.1.7)、纤维二糖2
‑
差向异构酶(cellobiose 2
‑
epimerase,cease,ec 5.1.3.11)和d
‑
甘露糖2
‑
差向异构酶(d
‑
mannose 2
‑
epimerase，d
‑
mease，ec 5.1.3)。其中，d
‑
来苏糖异构酶d
‑
liase和d
‑
甘露糖异构酶d
‑
miase可以催化d
‑
果糖异构化为d
‑
甘露糖。此外，尽管d
‑
甘露糖2
‑
差向异构酶d
‑
mease和纤维二糖2
‑
差向异构酶cease可以催化d
‑
葡萄糖向d
‑
甘露糖的差向异构化，但是该过程产生了较多的副产物d
‑
果糖。
5.虽然用来生产d
‑
甘露糖的酶很多，但甘露糖异构酶相对于其它生产甘露糖的酶比酶活是最高的，并且生产过程中没有出现其它的副产物。发明人课题组研究发现，来源于微生物deltaproteobacteria bacterium的甘露糖异构酶从d
‑
果糖转化为d
‑
甘露糖的比酶活为322.3
±
0.4u/mg；该甘露糖异构酶从d
‑
甘露糖转化为d
‑
果糖的比酶活为764.1
±
3.9u/mg；在同类甘露糖异构酶中，其比酶活处于较高的位置，但该甘露糖异构酶热稳定不好；并且，现有技术当中，甘露糖异构酶的热稳定性普遍不好；例如，公开于“pseudomonas geniculata d
‑
甘露糖异构酶的热稳定性改造及发酵优化”论文中的来源于pseudomonas geniculate的甘露糖异构酶在高于50℃的条件下，酶的活性降低的很快，很难满足工业生
产的需求，因此迫切需要提供一种热稳定性高的甘露糖异构酶。


技术实现要素：

6.为了解决现有技术当中甘露糖异构酶的热稳定性低的技术问题，本发明提供了一种甘露糖异构酶突变体，所述突变体是将氨基酸序列如seq id no.1所示的甘露糖异构酶的第37位的精氨酸和/或第164位的甘氨酸突变得到的。
7.在本发明的一种实施方式中，所述甘露糖异构酶来源于微生物deltaproteobacteria bacterium，其核苷酸序列如seq id no.2所示。
8.在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将氨基酸序列如seq id no.1所示的甘露糖异构酶的第37位的精氨酸突变为赖氨酸得到的，命名为r37k；其氨基酸序列如seq id no.3所示。
9.或所述突变体是将氨基酸序列如seq id no.1所示的甘露糖异构酶的第164位的甘氨酸突变为亮氨酸得到的，命名为g164l；其氨基酸序列如seq id no.4所示。
10.或所述突变体是将氨基酸序列如seq id no.1所示的甘露糖异构酶的第37位的精氨酸突变为赖氨酸，同时将第164位的甘氨酸突变为亮氨酸得到的，命名为r37k/g164l；其氨基酸序列如seq id no.5所示。
11.本发明还提供了一种编码上述甘露糖异构酶突变体的基因。
12.本发明还提供了携带上述基因的重组载体。
13.在本发明的一种实施方式中，所述重组载体以pet
‑
22b( )为表达载体。
14.本发明还提供了含有上述基因，或上述重组载体的细胞。
15.在本发明的一种实施方式中，所述细胞以细菌或真菌为宿主细胞。
16.本发明还提供上述突变体的制备方法，其具体步骤为：
17.(1)利用来源于deltaproteobacteria bacterium的deba
‑
wt酶的蛋白质序列同源建模确定突变位点；
18.(2)设计突变体的定点突变引物，以携带deba
‑
wt酶基因的载体pet
‑
22b( )
‑
wt为模板进行定点突变构建突变质粒；
19.(3)将突变质粒
‑
转化大肠杆菌bl21(de3)细胞，挑选验证后的阳性单克隆进行发酵培养；
20.(4)离心菌体，重悬后超声破碎，镍离子亲和层析纯化得到突变体酶。
21.本发明还提供了一种重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌表达了上述甘露糖异构酶突变体。
22.在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌以e.coli bl21(de3)为表达宿主。
23.在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌以pet
‑
22b( )为表达载体。
24.本发明还提供了一提高甘露糖异构酶热稳定性的方法，所述方法为，将氨基酸序列如seq id no.1所示的甘露糖异构酶的第37位的精氨酸和/或第164位的甘氨酸突变。
25.在本发明的一种实施方式中，所述方法为，将氨基酸序列如seq id no.1所示的甘露糖异构酶的第37位的精氨酸突变为赖氨酸；
26.或将氨基酸序列如seq id no.1所示的甘露糖异构酶的第164位的甘氨酸突变为
亮氨酸；
27.或将氨基酸序列如seq id no.1所示的甘露糖异构酶的第37位的精氨酸突变为赖氨酸，同时将第164位的甘氨酸突变为亮氨酸。
28.本发明还提供了一种制备d
‑
甘露糖的方法，所述方法为，将上述甘露糖异构酶突变体，或将上述重组大肠杆菌或其发酵上清液添加至含有d
‑
果糖的反应体系中，进行反应。
29.在本发明的一种实施方式中，所述甘露糖异构酶突变体的添加量为10u/ml。
30.在本发明的一种实施方式中，所述底物d
‑
果糖的终浓度为50mg/ml。
31.在本发明的一种实施方式中，所述反应体系中的反应条件为：温度为55℃，ph为7.0，甘露糖异构酶浓度为10u/ml，缓冲溶液为50mm pipes,反应时间为15min，反应体系为1ml，底物d
‑
果糖终浓度为50mg/ml。
32.本发明还提供了上述突变体，或上述基因，或上述质粒或细胞，或上述重组大肠杆菌在制备d
‑
甘露糖或含有d
‑
甘露糖的产品中的应用。
33.已报道的来源于pseudomonas geniculate的甘露糖异构酶在50℃下测得其半衰期为4h，但是当温度高于50℃时，其酶活数据迅速下降，不利于工业应用；而本专利中来源于deltaproteobacteria bacterium的甘露糖异构酶deba
‑
wt在60℃条件下半衰期为46.27min，其两点突变r37k/g164l在60℃条件下半衰期可达到185.83min,即突变体的半衰期提高了4倍，并且在半衰期提高4倍的基础上，两点突变体r37k/g164l的比酶活(为327.29u/mg)和deba
‑
wt的比酶活(331.19u/mg)相比没有发生较大的改变，可见，本发明的突变体r37k/g164l更加有利于大规模的工业生产。
34.有益效果
35.(1)本发明提供一种甘露糖异构酶deba突变体r37k、g164l、r37k/g164l，其中突变体r37k/g164l的热稳定性提高最多，与野生酶deba
‑
wt相比，突变体酶r37k/g164l的最适催化条件没有发生改变，但酶在60℃保温40min后残余酶活提高了42.3％；保温80min后的残余酶活提高了107.3％；保温120min后残余酶活提高了234.4％。并且，突变体酶r37k/g164l在65℃保温20min后残余酶活与原始酶相比提高了87.9％，保温40min后的残余酶活于原始酶相比提高了274.4％。
36.(2)本发明的突变体的半衰期与野生型相比，得到了很大的提高：在温度为60℃时，测得野生酶deba
‑
wt的半衰期为46.27min，突变体酶r37k/g164l的半衰期为185.83min，突变体r37k/g164l在60℃的半衰期为野生酶deba
‑
wt半衰期的4倍，突变体酶相对于野生酶热稳定性明显的提高，这一发现对于甘露糖异构酶的工业化应用具有重要的价值。
附图说明
37.图1：在60℃保温下野生酶deba
‑
wt和突变体酶r37k/g164l热稳定性比较。
38.图2：在65℃保温下野生酶deba
‑
wt和突变体酶r37k/g164l热稳定性比较。
39.图3：在60℃保温下野生酶deba
‑
wt和突变体酶r37k/g164l半衰期比较。
40.图4：甘露糖异构酶纯酶液的琼脂糖
‑
凝胶电泳图；其中，a：marker；b：wt的纯酶液；c：含有r37k的纯酶液；d：含有a76v的纯酶液；e：含有n89m的纯酶液；f：含有n109f的纯酶液；g：含有s125y的纯酶液；h：含有g164l的纯酶液；i：含有s178m的纯酶液；j：含有n230d的纯酶液；k：含有e234d的纯酶液；l：含有i239l的纯酶液。
具体实施方式
41.下述实施例中所涉及的培养基如下：
42.lb固体培养基：酵母提取物5g/l；胰蛋白胨10g/l；氯化钠10g/l，琼脂糖15g/l，培养基的ph为7.0。
43.lb液体培养基：酵母提取物5g/l；胰蛋白胨10g/l；氯化钠10g/l，培养基的ph为7.0。
44.下述实施例中所涉及的检测方法如下：
45.甘露糖异构酶酶活测定方法：
46.反应体系为1ml，包括800μl d
‑
果糖pipes溶液(62.5mg/ml)，100μl酶液(0.1mg/ml)和100μl最适金属镁离子(10mm/l)，在55℃条件下反应15min，加入100μl盐酸(1.5mol/l)终止反应。
47.1u总酶活定义为在ph 7.0，55℃条件下反应，每分钟消耗1μg底物所需要的酶量。使用hplc检测甘露糖的合成量，计算酶活。
48.比酶活：为每毫克蛋白质所具有的酶活力单位数，一般用u/mg蛋白质表示。
49.比酶活计算公式：[底物浓度(mol/l)
×
相对酶活(％)
×
0.01
×
反应体系(l)]/[反应时间(min)
×
加酶量(mg)]
×
1000000。
[0050]
实施例1：甘露糖异构酶突变体的制备方法
[0051]
具体步骤如下：
[0052]
(1)重组质粒pet
‑
22b( )
‑
wt构建：
[0053]
根据deltaproteobacteria bacterium(ncbi登录号：vbkq01000206.1)，合成甘露糖异构酶的基因片段deba
‑
wt(核苷酸序列如seq id no.2所示)，并连接至pet
‑
22b( )的酶切位点ndei和xhoi之间，获得重组质粒pet
‑
22b( )
‑
wt。
[0054]
(2)含有甘露糖异构酶突变体的重组质粒的构建：
[0055]
以pet
‑
22b( )
‑
wt质粒为模板，分别设计并合成突变体a76v、s125y、n89m、g164l、n109f、s178m、i239l、e230d、n234d、r37k、r37k/g164l的突变引物序列，对甘露糖异构酶进行定点突变，分别测序确认甘露糖异构酶突变体的编码基因是否正确；将携带突变体基因的载体导入大肠杆菌中进行表达，制备得到得到单突变甘露糖异构酶合成酶。其中阳性的点为r37k和g164l，其他突变均为负突变。再将两个阳性单点突变叠加形成两点突变r37k/g164l。
[0056]
其中双突变r37k/g164l是以pet
‑
22b( )
‑
r37k重组载体为模板，以表1的引物为突变引物进行定点突变制备得到的。所涉及的引物序列如表1所示：
[0057]
表1突变引物序列
[0058][0059][0060]
pcr反应体系的组成如表2所示，以带有甘露糖异构酶目的基因的克隆载体pet
‑
22b( )
‑
wt为模版。
[0061]
表2：pcr反应体系
[0062]
10
×
pcr buffer5μldntp(2mmol/l)4μl正向突变引物(10μm)1μl反向突变引物(10μm)1μlpet
‑
22b( )
‑
deba
‑
wt0.5μltaq plus dna polymerase(5u/μl)0.5μlddh2o将体系补足50μl
[0063]
pcr扩增条件为：95℃预变性3min；随后95℃变性0.5min，56℃退火0.5min，72℃延伸3.5min，进行26个循环；最后72℃保温5min。pcr扩增产物经琼脂糖电泳检测，割胶回收纯化。
[0064]
经琼脂糖电泳胶回收纯化后的pcr扩增产物经限制性内切酶ndei和xhoi酶切后连接至载体pet
‑
22b( )，并转化至大肠杆菌dh5α感受态细胞中，在含有50μg/ml氨苄青霉素的lb固体培养基培养过夜后，挑单克隆于50μg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基培养，后提取突变质粒，将突变质转化至宿主大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞中，突变质粒经测序鉴定为正
确的突变。制备得到能够表达突变体r37k、g164l、r37k/g164l、a76v、s125y、n89m、g164l、n109f、s178m、i239l、e230d、n234d的重组菌株：
[0065]
e.coli bl21(de3)/pet
‑
22b( )
‑
r37k、e.coli bl21(de3)/pet
‑
22b( )
‑
g164l、e.coli bl21(de3)/pet
‑
22b( )
‑
r37k/g164l、e.coli bl21(de3)/pet
‑
22b( )
‑
a76v、e.coli bl21(de3)/pet
‑
22b( )
‑
s125y、e.coli bl21(de3)/pet
‑
22b( )
‑
n89m、e.coli bl21(de3)/pet
‑
22b( )
‑
n109f、e.coli bl21(de3)/pet
‑
22b( )
‑
s178m、e.coli bl21(de3)/pet
‑
22b( )
‑
i239l、e.coli bl21(de3)/pet
‑
22b( )
‑
e230d、e.coli bl21(de3)/pet
‑
22b( )
‑
n234d。
[0066]
对照菌株：将步骤(1)制备得到的pet
‑
22b( )
‑
wt重组载体转化大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞中，制备得到e.coli bl21(de3)/pet
‑
22b( )
‑
wt。
[0067]
实施例2：甘露糖异构酶突变体的表达纯化方法及酶活检测
[0068]
具体步骤如下：
[0069]
(1)分别将实施例1中制备得到的重组菌株，挑取阳性转化子在lb液体培养基中37℃、200rpm摇瓶培养12h，分别制备得到种子液，分别将制备得到的种子液按照2％(v/v)的接种量接入lb液体培养基中，在37℃，200rpm条件下，培养3～4h至od值为0.6～0.8，降温至28℃，加入iptg终浓度为0.6mm，诱导6h，分别制备得到发酵液。
[0070]
(2)分别将制备得到的发酵液于4℃、l0000 rpm离心20min，取菌体。分别将菌体置于离心管中，并向离心管中加入20ml缓冲液(50mm tris，200mm nacl，hcl调节ph至7)充分重悬菌体，然后将离心管置于冰浴中，放入超声波细胞破碎仪中，超声破碎的条件为：工作时间l s，停止时间2s，共计20min。将获得的破碎液进行低温高速离心，4℃、10000rpm离心30min，上清液即为粗酶液，用0.45μm微孔滤膜过滤备用；即分别得到：含有wt的粗酶液、含有r37k的粗酶液、含有g164l的粗酶液、含有r37k/g164l的粗酶液、含有a76v的粗酶液、含有s125y的粗酶液、含有n89m的粗酶液、含有n109f的粗酶液、含有s178m的粗酶液、含有i239l的粗酶液、含有e230d的粗酶液、含有n234d的粗酶液。
[0071]
(3)准备镍离子亲和层析柱，首先，在室温下利用恒流泵，向柱子里泵入去离子水冲洗柱子(约6～12倍柱体积)，然后用缓冲液a(500mmol/l nacl，50mm pipes，ph 7.0)平衡柱子环境。待柱子下端的流出液与泵入柱子的缓冲液a的ph值一致时(约需5倍柱体积缓冲液)，将得到的过膜粗酶液加入到柱子中。先用缓冲液b(500mmol/l nacl，50mmol/l咪唑，50mm pipes，ph 7.0)冲洗杂蛋白至基线平衡，再用含有高浓度咪唑的洗脱液(500mmol/l nacl，500mmol/l咪唑，50mm pipes，ph 7.0)洗脱。
[0072]
收集吸收峰的洗脱液，分别得到含有wt的纯酶液、含有r37k的纯酶液、含有g164l的纯酶液、含有r37k/g164l的纯酶液、含有a76v的纯酶液、含有s125y的纯酶液、含有n89m的纯酶液、含有n109f的纯酶液、含有s178m的纯酶液、含有i239l的纯酶液、含有e230d的纯酶液、含有n234d的纯酶液，获得目的蛋白；对上述纯酶液进行琼脂糖
‑
凝胶电泳分析，结果如图4所示，结果显示，甘露糖异构酶均得到了表达。
[0073]
分别测定制备得到的纯酶液的比酶活，结果如表3所示：
[0074]
表3不同突变体及野生酶的比酶活
[0075][0076][0077]
由表3可知，与野生酶相比单点突变体的比酶活不同程度的下降，其中，e234d完全没有了比酶活；突变体r37k、n89m、s125y、s178m、n234d有小幅度的下降，而两点突变r37k/g164l的比酶活与野生型相比差异不大。
[0078]
在工业生产中酶活的下降不利于生产，故而在选择热稳定改变的突变体的同时也需要考虑酶本身的酶活。以上的实验数据与已经报道的文献描述相匹配，一般情况下热稳定性改造会不同程度造成比酶活的损失。
[0079]
实施例3：甘露糖异构酶突变体热稳定性的检测
[0080]
具体步骤如下：
[0081]
(1)55℃条件下的残余酶活的检测
[0082]
分别将实施列2制备得到的含有wt的纯酶液、含有r37k的纯酶液、含有g164l的纯酶液、含有r37k/g164l的纯酶液、含有a76v的纯酶液、含有s125y的纯酶液、含有n89m的纯酶液、含有n109f的纯酶液、含有s178m的纯酶液、含有i239l的纯酶液、含有e230d的纯酶液、含有n234d的纯酶液在55℃条件下保温2h后测定残余酶活，将55℃下保温0时的初始酶活定为100％，结果如表4所示：
[0083]
表4甘露糖异构酶野生型及突变体在55℃条件下的残余酶活
[0084][0085]
结果显示：将野生酶和突变体酶在55℃的条件下保温2h后，测得野生酶和突变体酶的残余酶活如上表所述，其中单点突变r37k和g164l的残余酶活是高于野生型，即阳性的突变点，而其它单点突变残余酶活均小于野生型，均为负突变。将筛选到的两个阳性单点突变体r37k和g164l进行叠加，得到两点突变r37k/g164l，在55℃条件下，r37k/g164l的比酶活可达287.27u/mg，残余酶活为91.93％；因此后续实验采用双突变，检测在60℃和65℃条件下的残余酶活。
[0086]
(2)60℃和65℃条件下的残余酶活检测
[0087]
将实施例2制备得到的含有wt的纯酶液、含有r37k/g164l的纯酶液在60℃和65℃下分别保温一段时间后，分别在不同的时间测定其剩余酶活，将60℃和65℃下保温0时的初始酶活定为100％；结果如表5～6及图1～3所示；并且计算出甘露糖异构酶野生型及突变体在60℃条件下的半衰期，如表7所示。
[0088]
表5：甘露糖异构酶野生型及突变体在60℃条件下的残余酶活
[0089][0090]
结果显示：在60℃的条件下，与野生酶wt相比两点突变体r37k/g164l保温40min后残余酶活提高了42.3％，保温80min后残余酶活提高了107.3％，保温120min后残余酶活提高了234.4％，说明两点突变体r37k/g164l的热稳定性好于野生酶wt。
[0091]
表6：甘露糖异构酶野生型及突变体在65℃条件下的残余酶活
[0092][0093]
结果显示：在65℃的条件下，与野生酶wt相比两点突变体r37k/g164l保温20min后残余酶活提高了87.9％，保温40min后残余酶活提高了274.4％，保温60min后残余酶活提高了360.7％，说明在65℃的条件下，两点突变体r37k/g164l的热稳定性高于野生酶wt。
[0094]
表7：甘露糖异构酶野生型及突变体在60℃条件下的半衰期
[0095][0096]
结果显示：在温度为60℃时，测得野生酶deba
‑
wt的半衰期为46.27min，突变体酶r37k/g164l的半衰期为185.83min，两点突变体r37k/g164l在60℃的半衰期为野生酶deba
‑
wt半衰期的4倍，突变体酶相对于野生酶热稳定性明显的提高，有望为进一步的工业化生产奠定了基础。
[0097]
结果显示，与野生酶deba
‑
wt相比，所述deba
‑
wt的突变体酶r37k/g164l的最适催化条件没有发生改变，而酶在60℃保温40min后残余酶活提高了42.3％；保温80min后的残余酶活分别提高了107.3％；保温120min后残余酶活提高了234.4％。
[0098]
与野生酶deba
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wt相比，所述deba
‑
wt的突变体酶r37k/g164l在65℃保温20min后残余酶活提高了87.9％，保温40min后的残余酶活提高了274.4％。
[0099]
在温度为60℃时，测得野生酶deba
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wt的半衰期为46.27min,突变体酶r37k/g164l的半衰期为185.83min，两点突变体r37k/g164l在60℃的半衰期为野生酶deba
‑
wt半衰期的4倍，突变体酶相对于野生酶热稳定性明显的提高。
[0100]
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。