植物花色苷代谢相关基因Rd3GTs及其编码蛋白和应用的制作方法

植物花色苷代谢相关基因rd3gts及其编码蛋白和应用
技术领域
1.本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种植物花色苷代谢相关基因rd3gts及其编码蛋白和应用。


背景技术：

2.花色苷是影响植物颜色呈现的最主要色素物质之一，它可以赋予植物从红色到紫色等一系列不同颜色。研究显示花色苷除可以赋予花、果实等组织颜色外，其还有很多重要的功能。它可以保护植物细胞免受紫外线的伤害，抵抗病原体与食草动物，作为信号分子促进植物与微生物之间的相互作用，影响花粉的生长与发育、植物体内激素的转运等。另外大量实验已经证明花色苷与人体健康之间也有密切的关系，它具有抗氧化、抗病毒、抗细胞增殖等生物活性，已经被用于治疗动脉硬化及心脑血管等疾病，是现阶段研究者们重点关注的次生代谢产物之一。
3.花色苷是由编码其合成的结构基因控制合成的，本发明涉及的类黄酮3
‑
o
‑
糖基转移酶3gt是花色苷合成途径中最后一个关键酶，是植物多种花色苷生物合成所必需的酶。经3gt催化发生的糖基化，是将糖基供体中的活化糖分子转移至花色素的c
‑
3位置形成花色苷，能够增强花色苷的稳定性和水溶性。研究显示，3gt基因的突变或该酶的失活可以影响并改变目标植物的颜色或是花色苷含量。例如，牵牛花ip3gt基因突变后，其花色由深色变为浅色或斑点花色；rna干扰下调蝴蝶兰3gt基因的表达后，转基因蝴蝶兰的花瓣颜色均有不同程度的变浅。由此表明，3gt是影响植物花色苷合成的重要关键酶，同时其也是改良植物颜色表型及有益保健成分(花色苷)的靶点酶。
4.3gt基因最早是于1977年，从玉米中分离得到的，现已从矮牵牛、紫薯、苜蓿、梨、蝴蝶兰、葡萄、草莓、荔枝等植物中克隆到了3gt基因。随着cdna克隆技术的不断完善，国内也有研究人员从众多植物中陆续克隆到了3gt基因的cdna或基因组dna序列，但是目前关于马缨杜鹃3gt基因的克隆与功能研究未见任何报道，这极大地限制了人们对3gt的进化研究，同时也限制了人们对杜鹃属植物3gt的利用及对其花色苷生物合成的调控与改良。


技术实现要素：

5.为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种植物花色苷代谢相关基因rd3gts，可用于花色苷改良的转基因植物。
6.本发明提供了一种植物花色苷代谢相关基因rd3gts，所述基因的cdna核苷酸序列如seq id no:1或seq id no:2所示。
7.优选的，所述植物为马缨杜鹃。
8.本发明还提供了上述基因表达的rd3gts蛋白质，所述seq id no:1核苷酸序列编码的蛋白氨基酸序列如seq id no:3所示；所述seq id no:2核苷酸序列编码的蛋白氨基酸序列如seq id no:4所示。
9.本发明还提供了含有上述基因的重组表达载体。
10.优选的，所述载体质粒为pet32。
11.本发明还提供了含有上述基因的双元表达载体。
12.优选的，所述载体质粒为pbi121。
13.本发明还提供了含有上述表达载体的重组宿主细胞。
14.本发明还提供了上述基因或蛋白质或表达载体在花色苷改良的转基因植物中的应用。
15.优选的，所述植物为拟南芥或烟草。
16.与现有技术相比，本发明的技术方案的有益效果如下：
17.本发明以马缨杜鹃总rna为模板克隆得到与马缨杜鹃花色苷代谢相关基因rd3gts，可用于表达载体的构建，能在重组细胞中表达重组的rd3gts蛋白，该蛋白具有类黄酮3
‑
o
‑
糖基转移酶的功能，在体外酶活反应中，能催化矢车菊素反应生成矢车菊素3
‑
o
‑
葡萄糖苷。
18.本发明将rd3gts基因转入拟南芥突变体中，获得的转基因植株可成功恢复拟南芥突变体花色苷表型，可以使拟南芥突变子叶和下胚轴中的花色苷的合成得到恢复。本发明将rd3gts基因转入烟草植株中，获得的转基因植株可加深烟草花瓣的颜色。
19.本发明以马缨杜鹃总rna为模板克隆得到与马缨杜鹃花色苷代谢相关基因rd3gts，可用于获得转基因植物，对转基因植物的花色苷生物合成进行调控与改良，达到转基因植物花卉花色修饰及转基因药用植物药用成分改良的作用。
附图说明
20.图1：rd3gts的多序列比对分析图；
21.图2：rd3gts的系统进化分析图；
22.图3：rd3gt1与rd3gt6扩增及验证结果图；
23.图4：大肠杆菌生长曲线图，a：pet32a( )
‑
rd3gt1
‑
bl21的生长曲线，b：pet32a( )
‑
rd3gt6
‑
bl21的生长曲线；
24.图5：马缨杜鹃3gt蛋白电泳图，a：rd3gt1蛋白，b：rd3gt6蛋白；
25.图6：rd3gt1体外酶活产物检测，a：矢车菊素标准品，b：矢车菊素3
‑
o
‑
葡萄糖苷标准品，c：pet32a( )
‑
bl21空载体蛋白阴性对照，d：rd3gt1酶活反应；
26.图7：rd3gt6体外酶活产物检测，a：矢车菊素标准品，b：矢车菊素3
‑
o
‑
葡萄糖苷标准品，c：pet32a( )
‑
bl21空载体蛋白阴性对照，d：rd3gt6酶活反应；
27.图8：rd3gts转基因拟南芥植株的表型变化及rt
‑
pcr检测，a：不同拟南芥植株的表型对比，b：不同拟南芥植株的rt
‑
pcr结果对比；
28.图9：转基因拟南芥代谢产物分析；
29.图10：转基因拟南芥花色苷含量分析；
30.图11：rd3gts转基因烟草植株的表型变化及rt
‑
pcr检测，a：不同烟草植株的表型对比，b：不同烟草植株的rt
‑
pcr结果对比；
31.图12：转基因烟草花瓣花色苷成分分析；
32.图13：转基因烟草花色苷含量分析。
具体实施方式
33.本发明提供了一种植物花色苷代谢相关基因rd3gts，包括基因rd3gt1和rd3gt6，基因rd3gt1的cdna核苷酸序列如seq id no:1所示；基因rd3gt6的cdna核苷酸序列如seq id no:2所示。
34.本发明中rd3gts基因是以马缨杜鹃花中总rna为模板，设计相关引物，通过pcr扩增得到的。本发明中通过引物对3gt
‑
1f1和3gt
‑
1f2克隆得到基因rd3gt1；通过引物对3gt
‑
6f1和3gt
‑
6f2克隆得到基因rd3gt6。本发明中引物3gt
‑
1f1的核苷酸序列如seq id no:5所示；引物3gt
‑
1f2的核苷酸序列如seq id no:6所示；引物3gt
‑
6f1的核苷酸序列如seq id no:7所示；引物3gt
‑
6f2的核苷酸序列如seq id no:8所示。
35.本发明得到的基因rd3gt1和rd3gt6可分别编码得到rd3gts蛋白质，所述基因rd3gt1编码得到蛋白质rd3gt1，其氨基酸序列如seq id no:3所示；所述基因rd3gt6编码得到蛋白质rd3gt6，其氨基酸序列如seq id no:4所示。
36.本发明利用dnaman对上述得到的蛋白rd3gt1、rd3gt6与拟南芥已知功能的糖基转移酶(ugt78d2)和苜蓿已知功能的糖基转移酶(ugt78g1)进行多序列比对分析，对比结果见图1。由图可知，rd3gt1、rd3gt6均与ugt78d2和ugt78g1的保守区高度相似，表明本发明得到的rd3gt1、rd3gt6均具有类黄酮3
‑
o
‑
糖基转移酶普遍存在的活性位点及糖基转移酶特有的pspgbox。
37.本发明从ncbi中下载不同植物来源的糖基转移酶氨基酸序列，利用clustalw完成多序列比对，然后利用mega6.0进行系统进化树的构建，对得到的rd3gt1、rd3gt6进行系统进化分析，分析结果见图2。由图可知，rd3gt1与rd3gt6均属类黄酮3
‑
o
‑
糖基转移酶，表明马缨杜鹃的rd3gts基因编码得到的rd3gts蛋白可能具有类黄酮3
‑
o
‑
糖基转移酶类似的功能。
38.本发明针对rd3gts基因构建原核表达载体。作为一种可选的实施方式，本发明将扩增得到的rd3gt1或rd3gt6基因片段克隆到pet32上，得到重组质粒pet32
‑
rd3gt1或pet32
‑
rd3gt6，并将重组质粒导入大肠杆菌bl21细胞中，得到的重组菌可经诱导产生目的蛋白rd3gt1或rd3gt6。本发明对具体的原核表达载体不作限定。
39.本发明对得到的目的蛋白rd3gt1或rd3gt6进行体外酶活实验，rd3gt1和rd3gt6均能够催化矢车菊素反应生成矢车菊素3
‑
o
‑
葡萄糖苷，表明本发明得到的马缨杜鹃rd3gt1和rd3gt6具有类黄酮3
‑
o
‑
糖基转移酶活性。
40.本发明针对rd3gts基因构建双元表达载体。作为一种可选的实施方式，本发明将扩增得到的rd3gt1或rd3gt6基因片段克隆到pmd18
‑
t上，转化至大肠杆菌jm109感受态细胞，对菌种培养、筛选，并提取得阳性质粒；将得到的重组质粒t rd3gt1(x b)或t rd3gt6(x b)与真核表达载体质粒pbi121连接，转化至大肠杆菌jm109感受态细胞中，对菌种培养、筛选，并提取得到重组质粒pbi121
‑
rd3gt1或pbi121
‑
rd3gt6；将重组质粒导入农杆菌gv3101细胞中，可用于植物遗传转化。本发明对具体的双元表达载体不作限定，对具体的转化方法不作限定。
41.本发明中的rd3gts基因，或其编码得到的蛋白质，或含有rd3gts基因的表达载体可应用于转基因植物的花色苷改良。在本发明中，被转化的植物宿主可以为任意一种含花色苷的植物。
42.本发明分别以含基因rd3gt1、rd3gt6的农杆菌gv3101侵染拟南芥，发现与突变体
植株相比，拟南芥转基因植株子叶与下胚轴中的花色苷得到成功恢复。同时，分别提取野生型、突变体和转基因植株的总rna，通过rt
‑
pcr验证发现，在转基因植株中成功检测到rd3gt1和rd3gt6，而野生型与突变体中没有检测到，结果见图8
‑
b。表明rd3gts基因在拟南芥中可调控、改良花色苷的合成。
43.本发明分别以含基因rd3gt1、rd3gt6的农杆菌gv3101侵染烟草，通过注射法与组织培养获得转基因烟草植株，待烟草成功生根后，移栽到土壤中继续培养，待开花后观察花瓣表型，发现转基因植株与野生型植株相比，烟草花瓣颜色加深。同时，分别提取野生型和转基因植株的总rna，通过rt
‑
pcr验证发现，在转基因植株中成功检测到rd3gt1和rd3gt6，而野生型中没有检测到，结果见图11
‑
b。表明rd3gts基因在烟草中可调控、改良花色苷的合成。
44.下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
45.实施例1
46.本实施例对马缨杜鹃rd3gts基因进行了克隆。
47.提取马缨杜鹃花的总rna，然后送转录组测序，根据转录组测序结果设计得到两组引物，引物序列见表1。
48.表1马缨杜鹃rd3gts基因克隆引物序列
[0049][0050]
表1中引物3gt
‑
1f1的核苷酸序列如seq id no:5所示；引物3gt
‑
1f2的核苷酸序列如seq id no:6所示；引物3gt
‑
6f1的核苷酸序列如seq id no:7所示；引物3gt
‑
6f2的核苷酸序列如seq id no:8所示。
[0051]
以马缨杜鹃花的总rna为模板进行pcr扩增，利用引物对3gt
‑
1f1和3gt
‑
1f2可克隆得到1425bp的扩增片段，通过orffinder软件得到马缨杜鹃rd3gt1的编码基因rd3gt1，该基因的cdna核苷酸序列如seq id no:1所示；利用引物对3gt
‑
6f1和3gt
‑
6f2可克隆得到1465bp的扩增片段，通过orffinder软件得到马缨杜鹃rd3gt6的编码基因rd3gt6，该基因的cdna核苷酸序列如seq id no:2所示。
[0052]
pcr程序为：94℃8min；94℃30s，53℃1.5min，72℃8min，30cycles。
[0053]
本实施例中rd3gt1与rd3gt6扩增步骤与验证方式采用本领域常规步骤，扩增及验证结果见图3。本实施例扩增得到的rd3gt1片段可编码得到rd3gt1，氨基酸序列如seq id no:3所示；得到的rd3gt6片段可编码得到rd3gt6，氨基酸序列如seq id no:4所示。
[0054]
实施例2
[0055]
本实施例对马缨杜鹃rd3gts的酶活进行了检测。
[0056]
1、原核表达载体的构建
[0057]
(1)利用克隆得到的rd3gt1和rd3gt6基因作为模板，分别采用带有ecori酶切位点
的引物对dj
‑
3gt1
‑
32/28f、dj
‑
3gt1
‑
32/28r，与带有bamh i与hindiii酶切位点的引物对dj
‑
3gt6
‑
32/28f、dj
‑
3gt6
‑
32/28r进行pcr扩增，引物序列见表2。
[0058]
表2马缨杜鹃rd3gts基因扩增引物序列
[0059][0060][0061]
表2中引物dj
‑
3gt1
‑
32/28f的核苷酸序列如seq id no:9所示；引物dj
‑
3gt1
‑
32/28r的核苷酸序列如seq id no:10所示；引物dj
‑
3gt6
‑
32/28f的核苷酸序列如seq id no:11所示；引物dj
‑
3gt6
‑
32/28r的核苷酸序列如seq id no:12所示。
[0062]
pcr程序为94℃8min；94℃30s，54℃1.5min，72℃8min，30cycles。
[0063]
(2)通过pcr扩增，分别得到5’和3’均端带有ecori酶切位点的rd3gt1产物和5’和3’带有bamhi、hindiii酶切位点的rd3gt6产物，将产物分别进行胶回收、连t载、转化jm109感受态细胞，菌液pcr及酶切的鉴定。然后将相应质粒送测序，测序结果显示，成功在rd3gt1和rd3gt6两端引入酶切位点。
[0064]
(3)将上述测序正确的菌液接菌，并大量提取质粒、酶切，对酶切产物验证大小及亮度。验证无误后与pet32a( )载体连接，转入jm109感受态细胞，次日在转化板上随机挑取克隆，进行菌液pcr、酶切验证，发现条带大小符合预期。将验证为阳性的克隆进行测序，测序结果与原始序列相一致，原核表达载体构建成功。
[0065]
(4)将构建得到的重组质粒分别命名为pet32
‑
rd3gt1和pet32
‑
rd3gt6，并导入大肠杆菌bl21细胞中，准备可溶性重组蛋白的大量制备。
[0066]
2、可溶性重组蛋白的诱导和表达
[0067]
(1)将上述大肠杆菌划线接种于含amp(100μg/ml)的lb固体培养基中，37℃恒温培养箱倒置培养12
‑
16h。挑取克隆，过夜培养。
[0068]
次日按1％的接菌量将菌液接种于5ml含有lb液体培养基的试管中，200rpm，37℃，震荡培养，每半小时拿出来一支，4℃暂时保存。其中一只试管不接菌，作空白对照。将各个时间段的菌液取出2ml，测定od
600
值，每个时间点重复测三次，绘制生长曲线，结果见图4，由图4可知，在2h后大肠杆菌进入生长对数期，在2.5h时生长速度最快，菌的状态最佳。
[0069]
(2)选择2.5h后对分别转pet32
‑
rd3gt1和pet32
‑
rd3gt6菌进行iptg诱导。经不同iptg浓度及不同诱导时间的摸索，最终确定rd3gt1蛋白的最佳诱导条件为：15℃，200rpm震荡培养2.5h后，加入iptg使终浓度为0.2mm，在恒温摇床中继续诱导培养24h；rd3gt6蛋白的最佳诱导条件为15℃，200rpm震荡培养2.5h后，加入iptg使终浓度为1mm，在恒温摇床中继续诱导培养60h。
[0070]
经上述诱导表达，可大量制备rd3gt1和rd3gt6蛋白。
[0071]
3、重组蛋白的分离纯化
[0072]
(1)分离纯化：
[0073]
a.装柱：在ni
‑
nta预装柱中缓慢加入填充液，期间不断用20％乙醇压实，当填充物到2ml左右时，用10ml20％乙醇进一步压实，最后用20mm pbs缓冲液平衡柱子，4℃保存备
用。
[0074]
b.rd3gts重组蛋白的大量制备
[0075]
在最佳诱导条件下按1％的接菌量接菌扩摇后，大量制备大肠杆菌培养物；将大肠杆菌培养物分装至50ml离心管中，置于高速离心机中进行离心，温度设置为：4℃，转速：5000rmp，离心10min，倒掉上清，收集菌体；每50ml菌液加入5ml20mmpbs悬浮菌体，插入冰中，冰浴30min；超声：超声功率设置为45％，超5s停5s，设定10min，超声破碎细胞，待菌液冷却后重复超声一次；破壁后的菌液置于高速离心机中离心，设置温度为：4℃，转速6000rpm离心15min，上清即为蛋白粗提取液。
[0076]
c.上样：将收集的上清液重复上ni柱3次，并用3倍体积的pbs平衡。
[0077]
d.咪唑洗脱：平衡后，用咪唑浓度依次为10mm、20mm、50mm、100mm、200mm、500mm的洗脱缓冲液进行洗脱，每个浓度梯度收集5管洗脱液，2ml/管。
[0078]
e.洗柱：用20mmpbs缓冲液洗柱，洗净后用20％乙醇浸泡，4℃保存。
[0079]
f.sds
‑
page电泳验证：将过柱后收集的各管洗脱液进行sds
‑
page电泳，分析重组蛋白的洗脱及纯化情况。
[0080]
(2)透析与浓缩：
[0081]
a.透析袋的处理：将透析袋裁剪至15～20cm，在2％(w/v)na2hco3溶液(含1mmedtana2，ph为8.0)中煮沸10min，去离子水清洗干净后置于1mmedtana2(ph为8.0)中煮沸10min，用去离子水将透析袋清洗干净后，浸泡在去离子水中，4℃保存备用。旧的透析袋经检查不漏液后，用蒸馏水加热煮沸30min后可重复使用。
[0082]
b.根据sds
‑
page电泳的结果，收集条带单一且浓度较好的蛋白洗脱液，装到处理好的透析袋中，依次用2l的透析液ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ中在4℃冷冻层析柜中进行透析，每种透析液透析10小时左右。
[0083]
透析液ⅰ：20mmpbs，500mmnacl(ph7.4)；透析液ⅱ：20mmpbs，300mmnacl(ph7.4)；透析液ⅲ：20mm pbs，100mm nacl(ph7.4)；透析液ⅳ：20mm pbs(ph7.4)。
[0084]
c.将装入透析袋中的蛋白包埋于预冷的变色硅胶中，置于4℃冰箱中进行浓缩，浓缩至1～2ml左右，取少许样品进行sds
‑
page电泳验证浓缩情况，电泳结果见图5(泳道1：空载体菌；泳道2：未加iptg诱导；泳道3：未纯化蛋白；泳道4：纯化后蛋白)。剩余样品于
‑
80℃保存备用。
[0085]
4、rd3gts的活性鉴定
[0086]
以矢车菊素为底物，udp
‑
葡萄糖为糖基供体，分别对蛋白rd3gt1和rd3gt6的体外酶活进行检测，参照表3进行酶活反应体系的配置。
[0087]
表3重组蛋白酶活反应体系
[0088][0089]
反应体系混合完毕后，置于30℃水浴锅中反应5min，待反应结束后，用50μl5％盐酸终止反应，12000rpm离心5min，上清转移至棕色上样瓶，利用hplc检测反应产物，结果见
图6
‑
7。如图6
‑
7所示，rd3gt1和rd3gt6均能够催化矢车菊素反应生成矢车菊素3
‑
o
‑
葡萄糖苷，证明马缨杜鹃rd3gt1和rd3gt6蛋白具有类黄酮3
‑
o
‑
糖基转移酶活性。
[0090]
实施例3
[0091]
本实施例研究了rd3gts对拟南芥和烟草花色苷合成的影响。
[0092]
1、双元表达载体的构建
[0093]
(1)利用克隆得到的rd3gt1和rd3gt6基因作为模板，分别采用带有bamhi和xbai酶切位点的引物进行pcr扩增，引物序列见表4。
[0094]
表4马缨杜鹃rd3gts基因扩增引物序列
[0095][0096]
表4中引物dj
‑
3gt1
‑
121f的核苷酸序列如seq id no:13所示；引物dj
‑
3gt1
‑
121r的核苷酸序列如seq id no:14所示；引物dj
‑
3gt6
‑
121f的核苷酸序列如seq id no:15所示；引物dj
‑
3gt6
‑
121r的核苷酸序列如seq id no:16所示。
[0097]
pcr程序为94℃8min；94℃30s，54℃1.5min，72℃8min，30cycles。
[0098]
(2)通过pcr扩增，得到大量基因片段，经0.8％琼脂糖凝胶电泳检测后，回收具有xbai和bamhi酶切位点的rd3gt1产物和rd3gt6产物，并进行验证。
[0099]
(3)将验证正确的胶回收产物与pmd18
‑
t克隆载体16℃过夜连接，次日转化至大肠杆菌jm109感受态细胞，待转化板长出克隆后，随机挑取单克隆进行菌液pcr。将筛选获得的阳性克隆接菌、提取质粒并进行xbai和bamhi双酶切验证，验证为阳性的质粒送测序。
[0100]
(4)将步骤(3)得到的重组质粒t rd3gt1(x b)/t rd3gt6(x b)和真核表达载体质粒pbi121同时用xbai和bamhi限制性内切酶进行双酶切。酶切产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳验证，切下大小正确的目的片段和载体片段，进行回收并验证。验证无误，将载体片段与目的片段按摩尔比1：10混合，16℃过夜连接。
[0101]
(5)将全部连接产物转化至大肠杆菌jm109感受态细胞中，涂布于kan

抗性的lb固体培养基表面；次日挑取单克隆进行菌液pcr鉴定，将阳性克隆进行接菌、提取重组质粒、xbai和bamhi双酶切鉴定成功后送测序，测序结果正确的重组质粒命名为pbi121
‑
rd3gt1/pbi121
‑
rd3gt6，并导入农杆菌gv3101细胞中，准备拟南芥与烟草的遗传转化。
[0102]
2、转基因拟南芥植株获得与结果分析
[0103]
(1)将适量拟南芥3gt突变体、野生型种子分别均匀撒在盛有湿润土壤的花盆中，并盖保鲜膜，保鲜膜用牙签插孔透气，置于25℃恒温光照培养室中，每隔2～3天浇一次水；待发芽后揭膜间苗，约5～8株/盆；待植物生长至盛花期时去荚留花，用于农杆菌侵染材料。
[0104]
(2)将pbi
‑
rd3gt1(gv3101)/pbi
‑
rd3gt6(gv3101)分别接种于5ml含rif(终浓度为50mg/l)和kan

(终浓度为50mg/l)的lb液体培养基中，30℃，200rpm，震荡培养48h。
[0105]
(3)将上述菌液全部接种于250ml含rif(终浓度为50mg/l)和kan

(终浓度为50mg/l)的lb液体培养基中扩摇至菌液od
600
值为1.0以上。
[0106]
(4)将培养好的新鲜菌液分别转入50ml离心管中进行离心，温度设置为：4℃，转速：5000rpm，离心15min后倒掉废液，保留沉淀。
[0107]
(5)取少量5％蔗糖溶液重悬菌体后，加入相应体积的5％蔗糖溶液，并且每100ml悬浮液需加入60μlsilwet
‑
77(表面活性剂)，置于磁力搅拌器上搅拌均匀。
[0108]
(6)停止搅拌后，取一盆拟南芥倒扣在菌液中，使花朵完全浸泡在菌液中，保持5min。重新将菌液搅拌均匀后再继续侵染下一盆拟南芥。取出后的拟南芥横放于托盘中，并加少量蒸馏水扣盖，在黑暗环境中室温过夜处理，次日将拟南芥转移至光照培养架上正常培养，定期浇水和喷洒营养液。
[0109]
(7)转基因拟南芥生长至成熟期后收取t1代种子，分别命名为pbi
‑
rd3gt1
‑
t1、pbi
‑
rd3gt6
‑
t1，并对转基因t1代种子进行筛选：
[0110]
取适量转基因t1代种子于1.5mlep管中，按照1：8(巴氏消毒液：水)的比例加入巴氏消毒液，上下摇晃15min洗涤种子；洗涤完毕后12000rpm，室温离心1min；在超净工作台子用无菌水清洗三次后播种于含1％蔗糖的1/2ms筛选培养基上(kan

终浓度为50mg/l，carben终浓度为100mg/l)；4℃春化2d后置于光照培养架上培养；种子发芽后将筛选出的绿色抗性苗移栽至土壤中。
[0111]
(8)此时部分转基因拟南芥植株叶柄基部恢复为紫色，将颜色恢复的植株培养至成熟，并单株收取t2代种子。
[0112]
取适量野生型、3gt突变体及t2代rd3gt1和rd3gt6转基因种子在超净工作台中播种于含3％蔗糖的1/2ms培养基(花色苷诱导培养基)中，春化后培养5天左右在体式显微镜下观察幼苗颜色差异，结果见图8
‑
a。由图8
‑
a可知，与突变体植株相比，转基因植株子叶与下胚轴中的花色苷得到成功恢复，表明rd3gts可调控、改良拟南芥中花色苷的合成。
[0113]
分别提取野生型、3gt突变体及表型恢复的rd3gts转基因拟南芥幼苗的总rna，利用rt
‑
pcr方法验证重组载体是否成功转入拟南芥突变体中，结果见图8
‑
b。由图8
‑
b可知，在转基因植株中成功检测到rd3gts，而野生型与突变体中没有检测到，表明拟南芥中转入rd3gts基因后，可调控、改良花色苷的合成。
[0114]
收集野生型、3gt突变体及表型恢复的rd3gts转基因拟南芥幼苗提取花色苷，进行定性与定量分析，结果见图9
‑
10。由图9可知，野生型幼苗中可检测到多种花色苷(峰1～4)，3gt突变体幼苗中仅检测到一种花色苷(峰2)，3gt突变体幼苗中花色苷种类数显著降低。而rd3gts转基因拟南芥幼苗中均可检测到多种花色苷峰(峰1～4)，表明rd3gts转基因拟南芥幼苗中花色苷种类得到恢复。同时由图10可知，rd3gts转基因拟南芥中花色苷含量显著高于野生型和3gt突变体，拟南芥中转入rd3gt1基因，花色苷含量最高可达50.89μg/g；转入rd3gt6基因，花色苷含量最高可达73.91μg/g。表明拟南芥中转入rd3gts基因后，可调控、改良花色苷的合成，提高花色苷含量。
[0115]
3、转基因烟草植株获得与结果分析
[0116]
(1)取适量烟草k326种子均匀撒在盛有湿润土壤的花盆中，并盖保鲜膜，用牙签在保鲜膜上插孔透气，置于25℃恒温光照培养室中，每隔2～3天浇一次水；待发芽后揭膜间苗，2株/盆；待植物生长至七叶期，作为农杆菌侵染材料。
[0117]
a.将培养好的菌液用瞬转烟草重悬液悬浮后，利用紫外分光光度计检测菌液od600值，使其终浓度达到0.06～0.08。
[0118]
b.用注射针头在合适的叶片背面轻划一点伤口，用一次性注射器吸取稀释后的菌液，对准伤口向烟草叶片中注射，注射不同的菌液需更换新的注射器。
[0119]
c.叶片正面做好标记，温室培养4天左右，可进行脱毒。
[0120]
d.剪下注过菌液的叶片，使其完全浸入脱毒液(150ml无菌水 150ml次氯酸钠 0.1％tween20)中，计时3min，在3min内观察叶片背面，当出现小黑点时即可，取出叶片依次放进无菌水里漂洗。
[0121]
e.将漂洗后的烟草叶片切成5
×
5mm2大小，接种于ms分化培养基上培养，每隔一个月换一次培养基，期间每天观察是否出现染菌，并及时进行换瓶。
[0122]
f.培养至外植体分化出愈伤组织并长出2～3cm的不定芽后，将不定芽切下并转入ms生根培养基，每隔一个月换一次培养基，当不定芽分化出生根后，停止更换生根培养基。
[0123]
g.根系生长发到后将幼苗移栽至土壤，25℃恒温光照培养。
[0124]
h.待烟草开花后，观察花朵表型，并收集变色花朵花瓣，提取总rna，利用rt
‑
pcr方法验证重组载体是否成功转入烟草。
[0125]
烟草成功生根后，移栽到土壤中继续培养，待开花后观察花瓣表型变化，结果见图11
‑
a。由图11
‑
a可知，与野生型植株相比，转基因烟草花瓣颜色加深，表明rd3gts可调控、改良烟草中花色苷的合成。
[0126]
分别提取野生型和rd3gts转基因烟草的总rna，利用rt
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pcr方法验证重组载体是否成功转入烟草植株中，结果见图11
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b。由图11
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b可知，在转基因植株中成功检测到rd3gts，而野生型中没有检测到，表明烟草植株中转入rd3gts基因后，可调控、改良花色苷的合成。
[0127]
分别提取野生型和rd3gts转基因烟草植株中的花色苷，进行定性与定量分析，结果见图12
‑
13。由图12可知，rd3gts转基因烟草植株中可检测到多种花色苷(峰1～5)，较野生型烟草植株中花色苷种类有所增加。并且由图13可知，rd3gts转基因烟草植株中花色苷含量显著高于野生型，烟草植株中转入rd3gt1基因，花色苷含量最高可达56.35μg/g；转入rd3gt6基因，花色苷含量最高可达77.05μg/g。表明烟草中转入rd3gts基因后，可调控、改良花色苷的合成，提高花色苷含量。
[0128]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。