通过超表达香菇TLP基因提高香菇对深绿木霉抗性的方法及应用与流程

技术特征：
1.一种通过超表达香菇tlp基因提高香菇对深绿木霉抗性的方法，其特征在于，包括以下步骤：利用香菇dna和载体pcambia1300
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g构建letlp1过表达载体pcambia1300
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oe
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letlp1；将pcambia1300
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oe
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letlp1转化入农杆菌中，挑取单个阳性克隆备用；转化：香菇菌株菌丝在培养基上活化后，浸入活化好的含pcambia1300
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oe
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letlp1农杆菌菌液；将香菇菌株菌丝接种至含有as的共培养固体培养基co
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im上，共培养；之后，将菌丝块从共培养培养基挑取下来，用灭菌的蒸馏水清洗菌块，浸泡在含头孢噻肟霉素的无菌水中；之后将菌丝块吸干表面水分，转移至含有潮霉素和头孢噻肟霉素的myg固体培养基上，25℃培养7
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12d；鉴定和筛选：挑取有潮霉素抗性的菌株进行鉴定，筛选出的阳性菌株为能超表达香菇letlp1基因的菌株，该菌株对深绿木霉的抗性提高。2.根据权利要求1所述的通过超表达香菇tlp基因提高香菇对深绿木霉抗性的方法，其特征在于，构建letlp1过表达载体具体包括如下步骤：第一步：以香菇的dna为模板，以o
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letlp1
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f和o
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letlp1
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r为引物，对letlp1基因全长片段进行扩增；以香菇的dna为模板，以o
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legpd promotor
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f和o
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legpd promotor
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r为引物，对香菇legpd启动子片段进行扩增；o
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letlp1
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f核苷酸序列如下：ccacctcaaacttcggaattctcaggggcaaaatgtaacagcata；o
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letlp1
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r核苷酸序列如下：ccattgactgcttgaatatgatgaagaattctatcattatctctgc；o
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legpd promotor
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f核苷酸序列如下：catattcaagcagtcaatggattgga；o
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legpd promotor
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r核苷酸序列如下：tctagaggatccccgggtacccgaagtttgaggtggttgcg；第二步：电泳检测并回收legpd启动子片段和letlp1基因全长片段；第三步：用限制性内切酶kpn
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i和ecor
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i对载体pcambia1300
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g进行双酶切，并将线性化载体的pcambia1300
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g、legpd启动子片段和letlp1基因全长片段通过重组酶连接。3.根据权利要求2所述的通过超表达香菇tlp基因提高香菇对深绿木霉抗性的方法，其特征在于，第一步中，扩增的反应体系如下：2
×
phanta max buffer 20μl，引物各1μl，dntp mix 1μl，phanta max super
‑
fidelity dna polymerase 1μl，模板量为200ng，补ddh2o至40μl体系；上述扩增的反应条件：95℃预变性3min，95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸1min，循环数34，72℃延伸5min。4.根据权利要求2所述的通过超表达香菇tlp基因提高香菇对深绿木霉抗性的方法，其特征在于，第三步中，重组酶连接体系为：酶切线性化片段pcambia1300
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g 160ng，legpd启动子20ng，letlp1全长基因片段30ng，2
×
basic assembly mix 5μl，补ddh2o至10μl。5.根据权利要求1所述的通过超表达香菇tlp基因提高香菇对深绿木霉抗性的方法，其特征在于，所述农杆菌菌株为eha105。
6.根据权利要求5所述的通过超表达香菇tlp基因提高香菇对深绿木霉抗性的方法，其特征在于，所述香菇菌株为武香一号、y55或y3334。7.根据权利要求6所述的通过超表达香菇tlp基因提高香菇对深绿木霉抗性的方法，其特征在于，所述转化的具体步骤为：香菇菌株在myg固体培养基上活化6
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8d后，取直径5mm的菌丝块，浸入活化好的含pcambia1300
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oe
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letlp1农杆菌菌液20
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30min；之后，将菌丝块接种至含有200μmol/l as的共培养固体培养基co
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im上，25
±
1℃共培养3
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4d；之后，将菌丝块从共培养培养基挑取下来，用灭菌的蒸馏水清洗，浸泡在含400μg/ml头孢噻肟霉素的无菌水中20
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30min；菌丝块吸干表面水分，转移至含有潮霉素和300μg/ml头孢噻肟霉素的myg固体培养基上，25
±
1℃培养7
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12d。8.根据权利要求7所述的通过超表达香菇tlp基因提高香菇对深绿木霉抗性的方法，其特征在于，对于y55菌株，潮霉素终浓度为70μg/ml；对于y3334菌株，潮霉素终浓度为9μg/ml。9.根据权利要求1所述的通过超表达香菇tlp基因提高香菇对深绿木霉抗性的方法，其特征在于，所述鉴定的方法包括pcr或者qrt
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pcr方法。10.权利要求1所述的通过超表达香菇tlp基因提高香菇对深绿木霉抗性的方法的应用，其特征在于，将letlp1过表达载体pcambia1300
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oe
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letlp1用于增强了香菇菌株对深绿木霉的抗性。

技术总结
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种通过超表达香菇TLP基因提高香菇对深绿木霉抗性的方法及应用。本发明以强抗菌株Y3334cDNA为模板扩增LeTLP1基因全长片，将线性化载体pCAMBIA1300


技术研发人员：马晓龙 边银丙 肖阳
受保护的技术使用者：华中农业大学
技术研发日：2021.07.12
技术公布日：2021/10/19