一种分子、表达其的细胞及其制备方法和用途与流程

一种分子、表达其的细胞及其制备方法和用途
1.本技术是名称为：一种分子、表达其的细胞及其制备方法和用途，申请号为201780000466.3的发明专利的分案申请，母案申请日为2017年06月16日。
技术领域
2.本发明属于肿瘤的细胞免疫治疗技术领域，具体涉及一种分子、表达其的细胞及其制备方法和用途，尤其涉及一种嵌合的免疫抑制检查点受体分子、编码其的核酸、含有该核酸的构建体、表达载体和转化的细胞以及相关制药用途。


背景技术：

3.目前，免疫疗法已然成为人类对抗癌症新的希望，而car
‑
t治疗血液肿瘤特别是b
‑
all白血病的临床试验结果，使其成为了近年来最备受瞩目的肿瘤免疫疗法之一。然而，靶向实体瘤的car t免疫治疗研究仍然面对巨大的考验：如何突破实体瘤组织壁垒、如何抵抗肿瘤组织内的免疫抑制、免疫细胞如何在缺氧微环境中竞争生存等。
4.肿瘤微环境可下调肿瘤抗原特异性的辅助/毒性杀伤细胞的数量和炎症因子的释放，上调免疫抑制细胞数量和抑制功能，如调节性t细胞(regulatory t cells)和髓系来源的抑制细胞(myeloid
‑
derived suppressor cells)，将正常免疫系统颠覆为促进肿瘤自身生长的优势因素。
5.针对实体瘤免疫抑制的情况，科学家陆续研发出阻断抑制信号通路，下调肿瘤微环境中的抑制性细胞的方法，如特异性靶向pd
‑
l1(programmed death ligand 1)、ctla4(cytotoxic t
‑
lymphocyte
‑
associatedantigen
‑
4)抗体或抑制剂，免疫激活因子等。
6.在现有技术中，将免疫抑制相关抗原ctla
‑
4应用于肿瘤免疫治疗的手段通常是构建ctla
‑
4抗体(ipilimumab)，或者使用ctla
‑
4的抑制剂或信号通路阻断剂。然而，ctla
‑
4抗体存在一定的限制性，即，抗体需要渗入肿瘤组织中才可发挥疗效，所以抗体的临床应用具有不确定性。据报道，共表达靶向肿瘤相关抗原car t和抑制性car t(胞外抗原为正常细胞抗原，胞内段为ctla
‑
4的抑制信号域)，可防止car t脱靶现象的发生(脱靶现象：car t细胞识别杀伤正常细胞)。
7.另外，现有技术中还报道了共表达双抗体pd
‑
1(programmed death 1)和cd19/mesothelin/psca的car t，这虽然扩大了靶点范围(表达pd
‑
1或cd19/mesothelin/psca或同时表达两者的肿瘤细胞)，但是忽略了盲目增加细胞杀伤作用所引起的副作用：细胞因子风暴、脱靶现象(正常细胞也表达两个抗原或之一，导致car t杀伤正常细胞，引起正常细胞缺失的机体功能缺陷)。
8.因此，提供一种具有较强的肿瘤杀伤作用、还能够缓解非特异免疫效应和细胞因子风暴等副作用car t细胞，对于本领域而言具有重要意义。


技术实现要素：

9.针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种分子、表达其的细胞及其
制备方法和用途，具体包括嵌合的免疫抑制检查点受体分子、编码其的核酸，含有该核酸的构建体、表达载体和转化的细胞，以及它们的制药用途。本发明的表达所述嵌合的免疫抑制检查点受体分子的转化的细胞可营造一种肿瘤免疫抑制微环境，具有增强的肿瘤杀伤作用；并且，该转化的细胞有自调节功能，可缓解过度的非特异免疫效应和细胞因子风暴等副作用。
10.为达此目的，本发明采用以下技术方案：
11.第一方面，本发明提供一种嵌合的免疫抑制检查点受体分子，所述嵌合的免疫抑制检查点受体分子包含胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域；
12.所述胞外结构域和跨膜结构域为免疫抑制检查点受体分子的相应结构域或基于该结构域进行基因改造后的结构域；
13.所述胞内结构域包括至少一个免疫激活信号结构域和信号肽；
14.其中，所述免疫抑制检查点受体分子选自ctla
‑
4、lag3或tim3中的任意一种或者至少两种的组合。
15.作为本发明优选的技术方案，所述免疫激活信号结构域包括tlr1、tlr2、cd28、ox40、icos、4
‑
1bb、cd40、cd27、cd134、cds、icam
‑
1、lfa
‑
1、cd2或btla中的任意一种或至少两种的组合。
16.优选地，所述信号肽为免疫抑制检查点受体分子相对应的信号肽。
17.优选地，所述胞内结构域包括免疫共刺激信号组合和信号肽，所述免疫共刺激信号组合包括至少两种免疫激活信号结构域。
18.优选地，所述免疫共刺激信号组合选自tlr1、tlr2、cd28、ox40、icos、4
‑
1bb、cd40、cd27、cd134、cds、icam
‑
1、lfa
‑
1、cd2或btla中的任意两种或至少三种的组合。
19.优选地，所述免疫共刺激信号组合为tlr1和41bb的组合、tlr1和cd28的组合、tlr2和41bb的组合或tlr2和cd28的组合中的任意一种。
20.作为本发明优选的技术方案，所述胞内结构域还包括cd3ζ胞内结构域。
21.优选地，所述免疫激活信号结构域配置在cd3ζ胞内结构域的n末端侧。
22.第二方面，本发明提供了一种核苷酸序列，所述核苷酸序列编码如第一方面所述的嵌合的免疫抑制检查点受体分子。
23.第三方面，本发明提供了一种核酸构建体，包含如第二方面所述的核苷酸序列；
24.优选地，所述核酸构建体还包括：与所述核苷酸序列连接的序列和/或指导所述核苷酸序列在宿主细胞中表达的序列。
25.本发明中所述核酸构建体，其包含如第二方面所述的核酸，以及与之可操作连接、可指导所述嵌合的免疫抑制检查点受体分子在宿主细胞中表达的一个或多个控制序列。
26.第四方面，本发明提供了一种表达载体，包含如第三方面所述的核酸构建体。
27.优选地，所述表达载体为慢病毒表达载体。
28.第五方面，本发明提供了一种转化的细胞，包含如第二方面所述的核苷酸序列、如第三方面所述的核酸构建体或如第四方面所述的表达载体。
29.优选地，所述转化的细胞包括免疫细胞，优选为t细胞、b细胞或nk细胞。
30.在具体的实施方案中，所述转化的细胞为宙斯盾细胞毒性t淋巴细胞(s
‑
ctl,shielded cytotoxic t lymphocyte)，其为过表达免疫抑制向激活转型的检查点分子的淋
巴细胞，特别是t淋巴细胞。s
‑
ctl为免疫增强的细胞毒性t淋巴细胞，即表达嵌合的免疫抑制检查点分子，胞外段和跨膜段为人免疫抑制检查点受体分子的相应区段，而胞内段为免疫刺激信号域组合，可特异性识别和杀伤表达免疫抑制检查点配体的肿瘤细胞和免疫抑制细胞。
31.s
‑
ctl细胞通过在人体t细胞中转染嵌合的免疫抑制
‑
激动转型的检查点分子基因，获得可抵抗免疫抑制的淋巴细胞。s
‑
ctl细胞包括表达嵌合的ctla
‑
4受体分子的sc
‑
ctl细胞、表达嵌合的tim3受体分子的st
‑
ctl细胞和表达嵌合的lag3受体分子的sl
‑
ctl细胞等。
32.s
‑
ctl淋巴细胞具有以下特点：
33.1)对表达免疫抑制检查点分子的配体(如b7.1、b7.2、galectin
‑
9、mhc ii等)的肿瘤细胞具有强效细胞杀伤作用；
34.2)天然的免疫抑制检查点分子受体(如ctla
‑
4、tim3、lag3等)表达在淋巴细胞特别是t细胞、nk细胞等表面，与肿瘤细胞配体结合后，可抑制免疫细胞自身的激活、增殖、识别、杀伤等功能的发挥；
35.3)s
‑
ctl结构：胞外段和跨膜区域为完全的免疫抑制检查点分子结构，用于特异性识别肿瘤细胞表面配体；胞内区域为一个或多个免疫激活信号域，其中本发明发现含tlr1和/或tlr2信号激活域的胞内结构域，可进一步促进肿瘤杀伤效应；
36.4)自调节功能，由于正常淋巴细胞表达天然的免疫抑制检查点分子受体，转化的细胞表达嵌合的免疫抑制
‑
激动转型的检查点分子，而天然的免疫抑制检查点分子受体为传导抑制信号，嵌合的免疫抑制检查点分子受体为传导激活信号，由此可通过自身表达调节方式减缓s
‑
ctl细胞的副作用，如脱靶杀伤、细胞因子；
37.5)sp
‑
ctl细胞可促进自身的增殖。
38.本发明还提供了制备如第五方面所述的转化的细胞的方法，其包括：向细胞中引入如第二方面所述的核苷酸序列，或者转化如第三方面所述的核酸构建体或如第四方面所述的表达载体的步骤。
39.第六方面，本发明还提供一种药物，所述药物包括如第一方面所述的嵌合的免疫抑制检查点受体分子、如第二方面所述的核苷酸序列、如第三方面所述的核酸构建体、如第四方面所述的表达载体或如第五方面所述的转化的细胞。
40.优选地，所述药物包括嵌合的ctla
‑
4受体和嵌合的pd
‑
1受体。
41.第七方面，本发明提供了如第一方面所述的嵌合的免疫抑制检查点受体分子、如第二方面所述的核酸、如第三方面所述的核酸构建体、如第四方面所述的表达载体或如第五方面所述的转化的细胞在制备与免疫抑制检查点受体分子、优选与pd
‑
l1、b7.1、b7.2、galectin
‑
9、mhc ii的表达相关的疾病的药物中的用途；
42.优选地，所述疾病为表达免疫抑制检查点受体分子的配体的肿瘤，优选为表达b7.1、b7.2、galectin
‑
9或mhc ii中任意一种的肿瘤。
43.优选地，所述表达b7.1、b7.2、galectin
‑
9或mhc ii中任意一种的肿瘤选自肺癌、白血病、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、肝癌、黑色素瘤或非黑色素瘤皮肤癌。
44.在本发明的上下文中，“免疫检查点”(immune checkpoint)是免疫系统中可上调或下调免疫刺激信号的分子，分为免疫刺激检查点分子(stimulatory checkpoint)和免疫
抑制检查点分子(inhibitory checkpoint)。
[0045]“免疫抑制检查点”是免疫系统中可下调免疫刺激信号的分子，例如：pd
‑
1、ctla
‑
4、tim3、lag3、a2ar、b7
‑
h3、b7
‑
h4、btla、ido、kir、cd160、2b4(cd244)、vista(c10orf54)、tigit、lair1、2b4等。
[0046]“免疫激活信号”：淋巴细胞激活过程中，t细胞需要获取两个信号以充分激活；第一信号是抗原特异性的，即通过t细胞受体与抗原递呈细胞apc表面mhc分子结合产生的；第二信号，即共刺激信号，是抗原非特异性的，通过t细胞和apc细胞表面的共刺激信号分子结合产生的。
[0047]
本发明的嵌合的免疫抑制检查点受体分子的胞内结构域可以包括共刺激信号分子cd28、ox40、icos(cd278)、4
‑
1bb(cd137)、cd40、cd27、cd134、cds、icam
‑
1、lfa
‑
1(cd11a/cd18)、cd2、btla等的胞内段，或者它们的任意组合。
[0048]
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0049]
本发明提供的嵌合的免疫抑制检查点受体分子，其相应的免疫抑制检查点受体分子为ctla
‑
4、lag3或tim3中的任意一种；利用所述嵌合的免疫抑制检查点受体分子制备得到的细胞是一种新型的肿瘤杀伤细胞，其为营造肿瘤免疫抑制微环境而表达免疫抑制检查点受体分子，具有低脱靶率；并且，其胞内结构域的独特设计可进一步促进其肿瘤杀伤效应，同时可以有效消除肿瘤免疫抑制作用；而所转化的细胞(如t细胞)处于肿瘤微环境中会诱导表达一定量的天然免疫抑制检查点受体分子，其与肿瘤ctla4抗原结合产生一定的抑制信号，对转化的细胞产生的免疫效应有一定的调节作用。鉴于上述优势，本发明的表达所述嵌合受体分子的转化的细胞在抗肿瘤治疗中具有良好的临床应用前景。
[0050]
同时，本发明中，靶向pd
‑
1的s
‑
ctl和靶向ctla
‑
4的s
‑
ctl联合应用，可同时识别杀伤肿瘤细胞和cd80 /cd86 肿瘤辅助性细胞，阻断cd80 /cd86 肿瘤辅助性细胞对肿瘤细胞生长、迁移、耐药、免疫逃逸等的作用，达到更好的肿瘤清除效果。
附图说明
[0051]
图1为实施例1中的合成序列图谱。
[0052]
图2(a)为实施例1中构建的pwpxld
‑
s(ctla
‑
4)
‑
ctl
‑
2a
‑
egfp的质粒图谱。
[0053]
图2(b)为实施例1中构建的pwpxld
‑
s(tim3)
‑
ctl
‑
2a
‑
egfp的质粒图谱。
[0054]
图2(c)为实施例1中构建的pwpxld
‑
s(lag3)
‑
ctl
‑
2a
‑
egfp的质粒图谱。
[0055]
图3为实施例1中流式细胞仪检测正常t细胞、sc
‑
ctl细胞和非转染t细胞的病毒感染阳性率结果图。
[0056]
图4为实施例2中sc
‑
ctl细胞对人b
‑
all细胞系nalm6
‑
gl杀伤作用曲线图。
[0057]
图5为实施例3中sc
‑
ctl细胞体外特异性识别、杀伤非霍金森淋巴瘤rl细胞的结果图。
[0058]
图6(a)为实施例4中不同实验组体内特异性识别、杀伤非霍金森淋巴瘤rl细胞后，每个实验组两个重复的肿瘤组织块的图片。
[0059]
图6(b)为实施例4中不同实验组体内特异性识别、杀伤非霍金森淋巴瘤rl细胞后，所得每个实验组的肿瘤组织块的平均重量结果对比图。
[0060]
图7(a)为实施例5中不同实验组体内特异性识别、杀伤非霍金森淋巴瘤rl细胞后，
每个实验组两个重复的肿瘤组织块的图片。
[0061]
图7(b)为实施例5中不同实验组体内特异性识别、杀伤非霍金森淋巴瘤rl细胞后，所得每个实验组的肿瘤组织块的平均重量结果对比图。
[0062]
图8(a)为实施例6中sp
‑
ctl、msc
‑
ctl单独或联合应用在体内特异性识别、杀伤原代肺癌细胞后，各实验组肿瘤组织块的平均体积结果图。
[0063]
图8(b)为实施例6中sp
‑
ctl、msc
‑
ctl单独或联合应用在体内特异性识别、杀伤原代肺癌细胞后，各实验组肿瘤组织块的平均重量结果图。
[0064]
图9(a)为实施例6中sp
‑
ctl、msc
‑
ctl单独或联合应用后、体内肿瘤组织中的cd80 细胞的含量对比图。
[0065]
图9(b)为实施例6中sp
‑
ctl、msc
‑
ctl单独或联合应用后、体内肿瘤组织中的cd86 细胞的含量对比图。
[0066]
图9(c)为实施例6中sp
‑
ctl、msc
‑
ctl单独或联合应用后、体内肿瘤组织中的cd11b ly6g 细胞(mdsc)的含量对比图。
具体实施方式
[0067]
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但下述的实例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。
[0068]
以下实施例中，若无特殊说明，所用试剂及耗材均购自本领域常规试剂厂商；若无特殊说明，所用实验方法和技术手段均为本领域常规的方法和手段。
[0069]
实施例1s
‑
ctl细胞的制备
[0070]
1、质粒构建
[0071]
1)通过基因合成，得到“免疫抑制检查点分子(信号肽 胞外段 跨膜区)
‑
刺激信号1
‑
刺激信号2(一般为tlr1或者tlr2)
‑
cd3ε”的dna序列，dna序列的首尾分别包含pmei和spe1限制性酶切位点。
[0072]
合成序列图谱如图1所示，所合成的基因序列如seq id no.1(为制备靶向ctla
‑
4的s
‑
ctl，即sc
‑
ctl，而合成的dna序列)和seq id no.2(为制备靶向tim3的s
‑
ctl，即st
‑
ctl，而合成的dna序列)和seq id no.3(为制备靶向lag3的s
‑
ctl，即sl
‑
ctl，而合成的dna序列)。
[0073]
s
‑
ctl(shielded cytotoxic t lymphocyte)，为免疫增强的细胞毒性t淋巴细胞，即表达嵌合的免疫抑制检查点分子，胞外段和跨膜段为人免疫抑制检查点受体分子的相应区段，而胞内段为免疫刺激信号域组合，可特异性识别和杀伤表达免疫抑制检查点配体的肿瘤细胞和免疫抑制细胞。
[0074]
sc
‑
ctl，表达嵌合的ctla
‑
4受体的s
‑
ctl细胞，特异性识别杀伤表达b7.1和/或b7.2的肿瘤细胞和肿瘤相关基质细胞或免疫抑制细胞。
[0075]
st
‑
ctl，表达嵌合的tim3受体的s
‑
ctl细胞，特异性识别杀伤表达galectin
‑
9的肿瘤细胞和肿瘤相关基质细胞或免疫抑制细胞。
[0076]
sl
‑
ctl，表达嵌合的lag3受体的s
‑
ctl细胞，特异性识别杀伤表达mhcⅱ的肿瘤细胞和肿瘤相关基质细胞或免疫抑制细胞。
[0077]
2)使用thermo限制性内切酶pme1和spe1，分别通过双酶切获得合成的s
‑
ctl dna片段(seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3)和pwpxld
‑
egfp载体的线性化dna(含粘性末端)。
[0078]
3)通过琼脂凝胶电泳回收，获得带粘性末端的线性化合成的s
‑
ctl(seq id no.1、seq id no.2和seq id no.3)和pwpxld
‑
egfp载体dna片段。
[0079]
4)通过t4 dna连接酶(来自invitrogent公司)，分别连接线性化的序列和质粒pwpxld
‑
2a
‑
egfp，获得pwpxld
‑
s(ctla
‑
4/tim3/lag3)
‑
ctl
‑
2a
‑
egfp质粒，其质粒图谱参见图2(a)、图2(b)和图2(c)。
[0080]
2、s
‑
ctl慢病毒包装
[0081]
1)培养293t细胞至密度达80
‑
90％，将培养基更换为：dmem高糖培养基 1％fbs 1％双抗；
[0082]
2)2
‑
6小时后，用pei分别将pwpxld
‑
s(ctla
‑
4/tim3/lag3)
‑
ctl
‑
2a
‑
egfp质粒与慢病毒辅助质粒(pmd2.g、pspax2)共同转染入293t细胞，以空载体pwpxld
‑
egfp与辅助质粒共转染作为对照组；
[0083]
3)分别于转染后24、48和72小时，收集培养基上清，即s(ctla
‑
4/tim3/lag3)
‑
ctl病毒上清，冻存于
‑
80℃备用。
[0084]
3、t细胞激活和慢病毒感染
[0085]
1)分离出血液中的单核细胞，通过macs pan
‑
t磁珠分选出t细胞，用t细胞培养基(aim
‑
v加5％fbs、青霉素100u/ml和链霉素0.1mg/ml)稀释至浓度2.5
×
106个/ml待用；
[0086]
2)通过包被cd2、cd3、cd28抗体的磁珠(美天旎)刺激t细胞，于37℃、5％co2条件下的培养箱中培养刺激48h，去除t细胞中磁珠，离心去上清，重悬；
[0087]
3)加入s(ctla
‑
4/tim3/lag3)
‑
ctl慢病毒上清和8μg/ml的polybrene和300iu/ml il
‑
2，病毒加入量为moi＝10，于37℃，5％co2条件下的培养箱中培养；
[0088]
4)24h后，300g离心5min，去上清，用含300iu/ml il
‑
2的新鲜t细胞培养基重悬，于37℃、5％co2条件下的培养箱中培养，每2
‑
3天进行半量换液；
[0089]
5)通过流式细胞技术，检测gfp阳性t细胞sc
‑
ctl的比例，结果如图3所示。
[0090]
实施例2sc
‑
ctl细胞对人白血病细胞系nalm6的体外杀伤效应
[0091]
1、在白血病细胞系nalm6中转导表达荧光素酶(luciferace)，构建nalm6
‑
gl报告细胞系；
[0092]
2、分别将gfp阳性细胞数为3.5
×
104、1.75
×
104、8.6
×
103、4.4
×
103、2.2
×
103、1.1
×
103的sc
‑
ctl病毒感染混合细胞与1
×
104个nalm6
‑
gl细胞共培养(对照组为加gfp t细胞，空白组为不加t细胞，每组设置三个复孔)；
[0093]
3、18小时后，轻轻用移液器吸除一半体积的培养基上清，加入等体积的荧光素酶底物(浓度：300μg/ml)，混匀；
[0094]
4、通过多功能酶标仪测定rlu(relative light unit)，测定时间设为1秒。
[0095]
5、杀伤比例计算公式：100％
×
(空白孔读数
‑
实验孔读数)/空白孔读数；sc
‑
ctl细胞对人白血病细胞系nalm6的体外杀伤比例如图4所示。
[0096]
实施例3sc
‑
ctl细胞体外特异性识别杀伤非霍金森淋巴瘤rl细胞
[0097]
1、将sc
‑
ctl gfp阳性细胞与非霍金森淋巴瘤rl细胞(细胞系均用荧光素酶gl标
记)以细胞数2:1、1:1、0.5:1、0.25:1、1:16比例混合共培养(对照组为加gfp t细胞，每组设置三个复孔)；
[0098]
2、18小时后，轻轻用移液器吸除一半体积的培养基上清，加入等体积的荧光素酶底物(浓度：300μg/ml)，混匀；
[0099]
3、通过多功能酶标仪检测sc
‑
ctl细胞对rl
‑
gl细胞的体外杀伤比例，其结果如图5所示。由以上检测结果可知，sc
‑
ctl细胞可在体外特异性识别和杀伤非霍金森淋巴瘤细胞。
[0100]
实施例4sc
‑
ctl细胞体内特异性识别杀伤非霍金森淋巴瘤rl细胞
[0101]
1、将1
×
105个rl
‑
gl细胞皮下移植入免疫缺陷小鼠nod/scid il2rg
‑
/
‑
体内，构建rl
‑
gl荷瘤小鼠模型；
[0102]
2、2天后，在rl
‑
gl荷瘤小鼠中注射sc
‑
ctl gfp阳性细胞数为1
×
105的sc
‑
ctl病毒感染混合细胞，对照组为注射gfp t细胞的荷瘤小鼠，每个实验组设置三个重复；
[0103]
3、于肿瘤移植后第28天，从rl
‑
gl荷瘤小鼠小鼠模型中获取肿瘤组织块；每个实验组两个重复的肿瘤组织块的尺寸比对图片如图6(a)所示，每个实验组的肿瘤组织块的平均重量结果如图6(b)所示。
[0104]
通过以上检测结果可知，本发明的sc
‑
ctl细胞可在体内有效清除非霍金森淋巴瘤细胞。
[0105]
实施例5msc
‑
ctl细胞体内特异性识别杀伤原代骨肉瘤细胞
[0106]
通过分子克隆手段，用小鼠ctla4胞外段 跨膜区(核苷酸序列和氨基酸序列分别如seq id no.4和seq id no.5所示)替换(h)sc
‑
ctl的胞外段 跨膜区，获得msc
‑
ctl。
[0107]
本实施例目的在于评估msc
‑
ctl细胞在体内对原代骨肉瘤细胞的特异性识别杀伤作用。
[0108]
具体程序如下：
[0109]
1、用剪刀将原代骨肉瘤组织样本剪成直径为3mm的肿瘤组织小块，皮下移植入免疫缺陷小鼠nod/scid il2rg
‑
/
‑
体内(每只受体小鼠移植2小块)，构建骨肉瘤小鼠模型；
[0110]
2、20天后，在骨肉瘤小鼠模型中注射msc
‑
ctl gfp阳性细胞数为1
×
105的msc
‑
ctl病毒感染混合细胞，对照组为注射gfp t细胞的荷瘤小鼠，每个实验组设置三个重复；
[0111]
3、于肿瘤移植44天，从骨肉瘤小鼠模型中获取肿瘤组织块；每个实验组的肿瘤组织块的尺寸比对图片如图7(a)所示，每个实验组的肿瘤组织块的平均重量结果如图7(b)所示。
[0112]
通过以上检测结果可知，本发明的msc
‑
ctl细胞在原代肿瘤异质性、免疫抑制微环境等情况下，仍可在体内有效清除原代骨肉瘤细胞。
[0113]
实施例6msc
‑
ctl和sp
‑
ctl联合应用体内识别杀伤肿瘤细胞
[0114]
通过分子克隆手段，用小鼠ctla4胞外段 跨膜区(核苷酸序列和氨基酸序列分别如seq id no.4和seq id no.5所示)替换(h)sc
‑
ctl的胞外段 跨膜区，获得msc
‑
ctl。
[0115]
本实施例目的在于评估sp
‑
ctl和msc
‑
ctl的联合应用对肿瘤细胞的清除作用，评估sc
‑
ctl对小鼠cd80 /cd86 肿瘤辅助细胞(非肿瘤细胞)的识别杀伤作用，并评估该作用在肿瘤清除中的影响。其中，sp
‑
ctl靶向pd
‑
1的s
‑
ctl，合成其的基因序列如seq id no.6所示。具体程序如下：
[0116]
1、用剪刀将原代肺癌组织样本剪成直径为3mm的肿瘤组织小块，皮下移植入免疫
缺陷小鼠nod/scid il2rg
‑
/
‑
体内，构建肺癌小鼠模型；
[0117]
2、18天后，将肺癌小鼠模型分为四组，分别注射sp
‑
ctl gfp阳性细胞数为2
×
105的sp
‑
ctl病毒感染混合细胞(sp
‑
ctl组)，msc
‑
ctl gfp阳性细胞数为2
×
105的sp
‑
ctl病毒感染混合细胞(msc
‑
ctl组)，以及混合的2
×
105sp
‑
ctl gfp阳性细胞和2
×
105msc
‑
ctl gfp阳性细胞(sp
‑
ctl msc
‑
ctl联合应用组)，对照组为注射gfp t细胞的荷瘤小鼠，每个实验组设置三个重复；
[0118]
3、于肿瘤移植后第18、21、24、27、30、33、36天，量取肺癌皮下肿瘤块体积；在不同时间点，各实验组肿瘤组织块的平均体积结果如图8(a)所示。
[0119]
4、于肿瘤移植后第38天，从肺癌小鼠模型中获取肿瘤组织块，每个实验组的肿瘤组织块的平均重量结果如图8(b)所示；该结果显示：本发明的sp
‑
ctl联合msc
‑
ctl细胞可在体内有效且协同清除原代肺癌细胞，且效果比单独使用sp
‑
ctl或msc
‑
ctl细胞更为显著。
[0120]
5、取sp
‑
ctl、msc
‑
ctl、sp
‑
ctl msc
‑
ctl联合应用组的肿瘤组织块，研磨、消化为单细胞，通过流式细胞技术检测肿瘤组织块中小鼠的cd80、cd86、mdsc(cd11b

ly6g

)细胞的比例，其结果如图9(a)、图9(b)、图9(c)所示。
[0121]
由以上检测结果可得出如下结论：msc
‑
ctl不仅可识别杀伤肿瘤细胞，还可识别杀伤cd80 或/和cd86 细胞(除肿瘤细胞外的肿瘤辅助细胞)，而且msc
‑
ctl对cd80 /cd86 非肿瘤细胞的杀伤作用可有效抑制肿瘤生长。
[0122]
msc
‑
ctl联合sp
‑
ctl可同时识别杀伤肿瘤细胞和cd80 /cd86 肿瘤辅助性细胞，阻断cd80 /cd86 肿瘤辅助性细胞对肿瘤细胞生长、迁移、耐药、免疫逃逸等的作用，达到更好的肿瘤清除效果。
[0123]
申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。