人源化广谱高中和活性抗新型冠状病毒单克隆抗体及应用的制作方法

1.本发明公开了一种多肽，更具体地，本发明公开一种抗体。


背景技术：

2.sars cov
‑
2(也称为2019
‑
ncov)属于正链rna病毒的一种，属 于冠状病毒家族的β属，其编码四种结构蛋白：spike(s),envelope(e), membrane(m),和nucleocapsid(n)、16种非结构蛋白，及5
‑
8种辅助蛋 白质。sars cov
‑
2利用病毒表面的s蛋白与宿主细胞受体
‑
血管紧张素 转换酶ii(ace2)进入细胞。s蛋白根据蛋白结构功能又被分为两个功 能单位，即s1和s2蛋白亚基。s1可分为ntd(n
‑
terminal domain) 和rbd(receptor binding site)，rbd区域长约240个氨基酸，主要与 宿主细胞受体结合，s2在病毒和细胞膜融合起作用。根据已有的报导， 中和抗体主要作用于rbd区域，抗体结合于rbd，阻碍rbd与ace2 的结合，从而阻止病毒感染细胞。
3.目前国内外均有新冠中和抗体的分离研究报道，采用单细胞分选和 抗体基因组深度测序方法，一批针对rbd的人源化单克隆抗体被分离 出来，如1f11、2f6、ca1、cb6、bd
‑
368
‑
2等，这些抗体展现出了较 强的体外中和活性(ic50<1μg/ml)，在表达ace2的转基因小鼠动物 体内也展现出了较好的治疗效果，可以显著降低小鼠肺部的病毒载量。 但sars
‑
cov
‑
2处于不断变异中，一旦感染了中和表位发生变异的病毒， 则已有的中和抗体将不再具有中和作用。事实上，已经有新冠突变株 b.1.1.7(n501y、d614g)、新冠突变株p.1(n501y、e484k、k417t、 d614g)、新冠突变株b.1.351(k417n、e484k、n501y、d614g)，新冠 突变株b.1.617(l452r、e484q、d614g)相继出现，该三毒株对部分 中和抗体或疫苗诱导出的抗体不敏感，且由于其较强的传播能力被世界 卫生组织列为voc(variants of concern,受关注的变异病毒)。因此，有 必要分离出更多的强效中和抗体作为备选，将这些针对不同表位的中和 抗体进行各种配伍，探索鸡尾酒疗法，可以更有效地避免病毒发生免疫 逃逸，目前科学界尚无已报道的类似广谱抗体以及抗体组合物。本发明 的目的就是提供一组具有高中和活性抗新型冠状病毒单克隆抗体，在此 基础上并提供所述高中和活性抗新型冠状病毒单克隆抗体在制备新冠病 毒病治疗药物中的应用。


技术实现要素：

4.基于上述发明目的，本发明首先提供了一种人源化广谱高中和活性抗 新型冠状病毒单克隆抗体，所述抗体的重链可变区的cdr1、cdr2和 cdr3以及轻链可变区的cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列分别如下 所示：
5.(1)seq id no.1的第26
‑
33、51
‑
58和97
‑
112位氨基酸以及seq id no.3的第27
‑
33、51
‑
53、90
‑
99位氨基酸；或者
6.(2)seq id no.5的第26
‑
33、51
‑
58和97
‑
114位氨基酸以及seq id no.7的第27
‑
38、56
‑
58和95
‑
103位氨基酸；或者
7.(3)seq id no.9的第26
‑
33、51
‑
58和97
‑
114位氨基酸以及seq idno.11的第27
‑
33、51
‑
53、90
‑
98位氨基酸。
8.在一个优选的实施方案中，所述抗体重链的可变区以及轻链的可变 区的氨基酸序列分别如下所示：
9.(1)seq id no.1以及seq id no.3，具有该技术方案的抗体在本发 明中被命名为“sw
‑
a9”；或者
10.(2)seq id no.5以及seq id no.7，具有该技术方案的抗体在本发 明中被命名为“sw
‑
b1”；或者
11.(3)seq id no.9以及seq id no.11；在本发明中，具有该重链的 可变区以及轻链的可变区氨基酸序列的一个具体技术方案的抗体被命名 为“cz
‑
d7”。
12.在一个更为优选的实施方案中，上述抗体的重链恒定区的氨基酸序列 如seq id no.13所示，轻链恒定区的氨基酸序列如seq id no.15所示 (kappa链)。
13.其次，本发明还提供了一种编码权利要求2或3所述人源化广谱高 中和活性抗新型冠状病毒单克隆抗体的多核苷酸，编码所述抗体重链的 可变区的多核苷酸以及编码所述抗体轻链的可变区的多核苷酸组合的序 列分别如下所示：
14.(1)seq id no.2以及seq id no.4，具有该技术方案的抗体在本发 明中被命名为“sw
‑
a9”；或者
15.(2)seq id no.6以及seq id no.8，具有该技术方案的抗体在本发 明中被命名为“sw
‑
b1”；或者
16.(3)seq id no.10以及seq id no.12，具有该技术方案的抗体在本 发明中被命名为“cz
‑
d7”。
17.在一个优选的实施方案中，编码抗体重链恒定区的多核苷酸的序列 如seq id no.14所示，所述轻链恒定区的多核苷酸的序列如seq idno.16所示(kappa链)。
18.第三，本发明还提供了一种表达上述人源化广谱高中和活性抗新型 冠状病毒单克隆抗体的载体，所述载体含有上述编码所述抗体重链的可 变区的多核苷酸以及编码所述抗体轻链的可变区的多核苷酸，所述载体 可以是基因工程中常规使用的真核表达载体，在本发明的一个具体实施 方案中，所述载体为igh(重链表达载体)、igκ(κ轻链表达载体)(具 体参见tiller et al.efficient generation of monoclonal antibodies from singlehuman b cells by single cell rt
‑
pcr and expression vector cloning,j immunol methods.2008january 1；329(1
‑
2):112
–
124.，本发明通过引用将 该现有技术文件并入到本发明的说明书中)。
19.第四，本发明提供了一种表达上述人源化广谱高中和活性抗新型冠 状病毒单克隆抗体的宿主细胞，所述宿主细胞含有上述的载体。
20.所述宿主细胞可以为基因工程中常规使用的真核宿主细胞，在本发 明的一个具体实施方案中，所述宿主细胞为293f细胞。
21.第五，本发明提供了一种抗体组合物，所述组合物含有第一抗体和 第二抗体，所述第一抗体重链的可变区以及轻链的可变区的氨基酸序列 分别如seq id no.1以及seq id no.3所示，所述第二抗体重链的可变 区以及轻链的可变区的氨基酸序列分别如：
22.(1)seq id no.5以及seq id no.7；或者
23.(2)seq id no.9以及seq id no.11。
24.在另一个可选的的技术方案中，所述组合物的第一抗体重链的可变 区以及轻链的可变区的氨基酸序列分别如seq id no.5以及seq idno.7所示，所述第二抗体重链的可变区以及轻链的可变区的氨基酸序列 分别如seq id no.9以及seq id no.11所示。
25.第六，本发明提供了上述人源化广谱高中和活性抗新型冠状病毒单 克隆抗体在制备新型冠状病毒病治疗和/或预防药物中的应用，所述抗体 或者抗体组合物可以开发临床治疗药物，靶向药物、sars
‑
cov
‑
2重组 蛋白及亚单位疫苗。
26.最后，本发明提供了上述人源化广谱高中和活性抗新型冠状病毒单 克隆抗体在制备新型冠状病毒检测试剂中的应用。
27.本发明提供的人源化广谱高中和活性抗新型冠状病毒单克隆抗体通 过单个b细胞流式分选
‑
抗体基因扩增配对表达技术筛选获得，具有独特 的cdr区域，能与sars
‑
cov
‑
2特异性结合并且可以有效中和目前多株 国际流行病毒(新冠突变株a株(nc_045512)，新冠突变株b.1.1.7，新 冠突变株b.1.351，新冠突变株p.1，新冠突变株b.1.617.1和b.1.617.2)， 其ic50均在0.1μg/ml左右，对世界范围内多个不同的新型冠状病毒代 表株具有显著的广谱中和能力。本发明提供的抗体在两两联合使用时具 有协同中和病毒的作用，因此本发明提供的抗体以及含有两种抗体的组 合物可以用于制备covid
‑
19紧急预防和/或治疗药物，具有全人源化， 高表达，稳定性好的特点，适合产业化。此外，该抗体还可用于制备 sars
‑
cov
‑
2病毒检测试剂，用于检测病毒抗原以及用于发现有效中和 抗原表位。
附图说明
28.图1.生物素化rbd蛋白的效价检测结果图，其中a.磁珠法检测rbd 生物素化效率；b.elisa法检测生物素化效率；
29.图2.流式分选rbd特异性b细胞示意图；
30.图3.抗体针对rbd结合能力的elisa结果图；
31.图4.采用bli技术检测sw
‑
a9抗体的抗体
‑
抗原亲和力结果图；
32.图5.采用bli技术检测sw
‑
b1抗体的抗体
‑
抗原亲和力结果图；
33.图6.采用bli技术检测cz
‑
d7抗体的抗体
‑
抗原亲和力结果图。
具体实施方式
34.下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将 会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的 权利要求所限定的保护范围构成任何限制。
35.实施例1：新冠病毒rbd探针的合成、表达和生物素化及染色
36.1.1依据genbank公布的数据(nc_045512)，合成携带6
×
his
‑
avi (his
‑
his
‑
his
‑
his
‑
his
‑
his
‑
glu
‑
lys
‑
asn
‑
glu
‑
gln
‑
glu
‑
leu
‑
leu
‑
glu
‑
leu
‑
as p
‑
lys
‑
trp
‑
ala
‑
ser
‑
leu
‑
trp
‑
asn
‑
trp
‑
phe
‑
asp
‑
ile
‑
thr
‑
asn
‑
trp
‑
leu
‑
trp
‑
tyr
‑
i le
‑
lys
‑
lys
‑
lys)标签的rbd全长基因序列。
37.1.2经ecori和ecorv双酶切后重新连接入真核表达载体pdrvi1.0 (发明人构建并保存)，挑选克隆后经测序无误。
38.1.3将两探针质粒分别转染293f细胞进行表达，5
‑
6天后离心培养 液收取细胞上清，过镍柱纯化抗原蛋白。
39.1.4使用bira 500生物素蛋白连接酶试剂盒(bira500，avidity)对 探针蛋白进行生物素化。
40.将1mg分子探针蛋白溶解于0.7ml pbs缓冲液中，分别加入0.1ml 10
×
缓冲液a、0.1ml 10
×
缓冲液b，再加入4μl bira 500酶，混匀，30℃ 孵育30分钟；将混合物转移至10k浓缩管中，加10ml pbs，离心4000g 15min至剩余体积0.5ml，重复这一操作5次；收集浓缩后的蛋白并测定 浓度，存放至
‑
80℃冰箱。
41.1.5检测分子探针生物素化活性
42.采用60微升链霉素标记的琼脂糖 10微克蛋白 500微升pbs置室 温振荡器中摇30min，短暂离心，用1ml的pbs洗3次，最后一次尽量 将液体吸弃干净，最后剩下大概30微升的琼脂糖，同时准备30微升的 sds凝胶加样缓冲液(100mm ph6.8 tris
‑
hcl、4％sds、0.2％溴酚兰、20％甘油、200mmβ
‑
巯基乙醇)，将琼脂糖和混合缓冲液混在一起，吸取 20微升置于100℃,5
‑
10min然后进行sds
‑
page电泳；电泳结束后加适量 考马斯亮蓝染色1小时后置于振荡器中脱色后观察电泳条带的深浅，判 定生物素标记的效率，至少在50％以上可考虑进行荧光标记。
43.采用酶联免疫吸附试验(enzyme
‑
linked immunosorbent assay， elisa)检测两探针的生物素化活性。用pbs将新冠抗原稀释至2μg/ml， 加入96孔elisa板中，每孔100μl，置于4℃过夜，次日用pbst(含0.05％ 吐温20的pbs)洗3次；每孔加入370μl封闭液(含2％牛奶和5％fbs 的pbs)室温封闭1小时，用pbst(含0.05％吐温20的pbs)洗3次； 向每孔加入100μl封闭液，第一行每孔再加入25μl稀释好的生物素标记 的探针蛋白(生物素化的探针蛋白贮存浓度为50μg/ml，使用前5倍稀 释于封闭液中)，混匀后从第一行每孔吸出25μl加入到第二行中，混匀 后吸出25μl加入到第三行中，依次直至最后一行吸出25μl丢掉(每行 之间形成五倍稀释梯度)，37℃孵育1小时，用pbst(含0.05％吐温20 的pbs)洗5次；将辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(sigma kplhrp
‑
sa)1000倍稀释于含有0.05％吐温20的封闭液中，每孔加100μl， 37℃孵育1小时，用pbst洗5次板；每孔加入100μl底物，室温孵育 20分钟后每孔加入50μl硫酸终止液立即终止反应，在酶标仪上读数保 存。图1为生物素化rbd蛋白的效价检测结果，其中a为磁珠法检测 rbd生物素化效率，泳道1
‑
2为链霉亲和素磁珠从10μg生物素后的rbd 蛋白中捕获生物素化成功的rbd，泳道3为10μg生物素化rbd，泳道 4为分子量标志；由图1a可以看出，rbd生物素化效率超过50％；b为 elisa法检测生物素化效率，探针的终末浓度(end titer)为0.0032μg/ml。 由结果可以看出，rbd的生物素化成功。
44.1.6生物素化的探针蛋白进行荧光标记
45.rbd
‑
avi探针蛋白用pe(藻红蛋白)进行荧光标记，以备单细胞流 式分选时使用。
46.实施例2:抗sars
‑
cov
‑
2人源化单克隆抗体的筛选和鉴定
47.2.1配制细胞裂解液：每孔20μl细胞裂解液，包含0.5μl去rna酶，5μl 5
×
first strand缓冲液，1.25μl 0.1m dtt，0.0625μl igepal，13.25μl 水，盖好封板膜，4℃冰箱放置待用。
48.2.2样本准备：
49.(1)新冠感染后康复者pbmcs细胞复苏：将冻存细胞管从液氮拿 出后，迅速置于37
℃水浴中，待融化至有冰芯时拿出，在生物安全柜中打开，缓慢滴入r10 benzonase培养基(1支细胞使用5mlr10 benzonase培养基)。1500rpm离心10分钟，弃去上清，用残液悬起细胞，加入10mlr10，混匀，取50μl进行细胞计数，1500rpm离心10分钟；调整细胞浓度：弃去上清，用残液悬起细胞，使用r10培养基调整浓度，向96孔u型板中2.5
×
106个/孔；
50.(2)配制2mm的edta/pbs溶液，下文用e
‑
pbs表示；
51.(3)将96孔细胞板置于离心机内，4℃，2000rpm离心3分钟，弃去上清(生物安全柜内操作，纸巾高压放台内)；
52.(4)每孔加入50μlvivid工作液(配制vivid(uv)工作液：1:1000用pbs稀释，混匀)，混匀，避光冰上孵育20分钟；
53.(5)每孔加入150μle
‑
pbs，4℃，2000rpm离心3分钟；
54.(6)弃去上清，加入50μl胞外抗体混合液(2μlanti
‑
cd3
‑
pacificblue，1.5μlanti
‑
cd8
‑
pacificblue，1.5μlanti
‑
cd14
‑
pacificblue，1μlanti
‑
cd19
‑
bv510，2μlanti
‑
cd20
‑
ecd，2.5μlanti
‑
cd27
‑
apccy7，5μlanti
‑
igg
‑
fitc，2.5μlanti
‑
igm
‑
percpcy5.5，2.5μlanti
‑
pd
‑1‑
pecy7,1μlanti
‑
cxcr5
‑
apc
‑
r700,5μlcxcr3
‑
pecy5,1μlanti
‑
cd45ra
‑
bv650,1μlanti
‑
cd4
‑
bv605,5μlanti
‑
rbd
‑
pe，不足用e
‑
pbs补齐)，混匀，避光冰上孵育60分钟；
55.(7)每孔加入150μle
‑
pbs，4℃，2000rpm离心3分钟，弃去上清；
56.(8)每孔加入200μle
‑
pbs，4℃，2000rpm离心3分钟，弃去上清；
57.(9)每孔加入200μle
‑
pbs，混匀，同一样本细胞悬液过滤到同一支流式管内，4℃避光保存供分选。
58.(10)单染管对照：设置1个未染色管对照(加入1滴补偿微球，200μle
‑
pbs)和15个单独染色管(每管加入补偿微球1滴，分别加入μlanti
‑
cd3
‑
pacificblue，1.5μlanti
‑
cd8
‑
pacificblue，1.5μlanti
‑
cd14
‑
pacificblue，1μlanti
‑
cd19
‑
bv510，2μlanti
‑
cd20
‑
ecd，2.5μlanti
‑
cd27
‑
apccy7，5μlanti
‑
igg
‑
fitc，2.5μlanti
‑
igm
‑
percpcy5.5，2.5μlanti
‑
pd
‑1‑
pecy7,1μlanti
‑
cxcr5
‑
apc
‑
r700,5μlcxcr3
‑
pecy5,1μlanti
‑
cd45ra
‑
bv650,1μlanti
‑
cd4
‑
bv605,5μlanti
‑
cd4
‑
pe，50μluv工作液)，混匀，避光冰上孵育20分钟后每孔加入150μle
‑
pbs，4℃，2000rpm离心3分钟，弃上清，200μle
‑
pbs重悬。
59.2.3单个b细胞流式分选：选择cd3
‑
cd8
‑
cd14
‑
cd19

cd20

cd27

igg

igm
‑
rbd

的细胞进行分选，合计分选到56个细胞。首选圈定出单淋巴细胞群，再圈定出cd3
‑
cd8
‑
cd14
‑
的活细胞以排除t细胞和巨噬细胞，再圈出cd19

cd20

的b细胞，再圈定出cd27

的记忆b细胞，再圈出igg

igm
‑
的b细胞，最后圈出与探针rbd结合的记忆性b细胞。将这些b细胞每孔1个分选入含有以下裂解液体系的96孔板中(表1)。分选结束后，立刻用封口膜封好96孔板，在干冰上凝固，再转移入
‑
80℃冰箱，过夜，第二天进行pcr操作。结果：流式分选的结果如图2所示。
60.表1.b细胞裂解液体系
[0061][0062]
2.4利用rt
‑
pcr技术扩增全人源抗体可变区基因
[0063]
配置如表2所示rt
‑
pcr反应体系，每孔加入6μl，进行rt
‑
pcr反 应
[0064]
表2.rt
‑
pcr反应体系
[0065][0066]
rt
‑
pcr反应程序设定：42℃反应10min，25℃反应10min，50℃反 应50min，94℃反应5min，4度保存。
[0067]
(1)进行两轮pcr反应，反应体系如下
[0068]
第一轮pcr反应体系(表3)补充引物序列(表4)
[0069]
表3.第一轮pcr反应体系
[0070][0071]
表4.第一轮pcr扩增用引物序列如下
[0072][0073]
[0074]
第一轮pcr扩增用引物的扩增目的片段如表5所示。
[0075]
表5.第一轮pcr扩增用引物的扩增目的片段
[0076][0077][0078]
第一轮pcr反应程序如表6所示。
[0079]
表6.第一轮pcr程序
[0080][0081]
第一轮pcr反应结束后进行第二轮pcr反应，第二轮pcr反应体系 如表7所示。
[0082]
表7.第二轮pcr反应体系
[0083][0084][0085]
第二轮pcr引物序列如表8所示。
[0086]
表8.第二轮pcr引物序列
[0087][0088]
第二轮pcr扩增用引物的扩增目的片段如表9所示。
[0089]
表9.第二轮pcr扩增用引物的扩增目的片段
[0090][0091][0092]
第二轮pcr反应程序如表10所示。
[0093]
表10.第二轮pcr程序
[0094][0095]
(2)电泳、测序、家系分析
[0096]
电泳检测二轮pcr产物，将重链和轻链产物直接测序；使用抗体家 系基因数据库(http://www.imgt.org/imgt_vquest/vquest)对测序结果进 行分析，设计并合成带有酶切位点的抗体可变区序列(重链：5
‘‑
age i， 3
’‑
sal i；kappa链：5
‘‑
age i，3
‘‑
bsiw i；lambda链：5
‘‑
age i，3
’‑
xho i)， 共计获得36对重链和轻链配对克隆。
[0097]
2.5单克隆抗体表达载体构建和质粒转化
[0098]
将合成的基因用相应的酶进行酶切后再次凝胶电泳回收，使用t4 dna连接酶将可变区基因与相应载体igh(重链表达载体)、igκ(κ轻 链表达载体)、igλ(λ轻链表达载体)(具体参见tiller et al.efficientgeneration of monoclonal antibodies from single human b cells by single cellrt
‑
pcr and expression vector cloning,j immunol methods.2008january 1； 329(1
‑
2):112
–
124.，本发明通过引用将该现有技术文件并入到
本发明的 说明书中)在16℃连接仪上连接过夜16℃水浴过夜，转化。将10μl连 接产物加入50μl dh5α感受态细胞中，振动摇匀，冰浴30分钟，42℃ 水浴热激45秒。离心管放入冰浴2分钟后，加入1ml无抗性的lb培养 基，37℃，200rpm振荡培养1小时，4000rpm离心4分钟，将残留菌液 涂布在抗性的lb平板上。37℃倒置培养14
‑
16小时。挑取单克隆菌落 接种到抗性的lb液体培养基中，37℃，200rpm振荡培养14
‑
16小时后 进行质粒提取(omega公司的plasmid midi kit)。
[0099]
2.6抗体表达和纯化
[0100]
将293f细胞浓度调整为1.2
×
106个/ml，培养2小时。配置a液：25ml 的opti
‑
mem加入500μg抗体重链dna和500μg抗体轻链dna，b液： 25ml的opti
‑
mem中加入5ml的pei转染试剂，静置5分钟。将a和b 液混合，静置20分钟，逐滴加入1l的293f细胞中，边滴边摇匀，置于 8％co2，37℃下，摇动培养5天。
[0101]
利用protein a亲和柱(ge health公司产品)纯化得到抗体。利用 nanodrop2000超微量分光光度计(thermo公司产品)测定抗体浓度，4℃ 放置待检测。本步骤从36个抗体轻/重链配对中表达出27个抗体(抗体 量>10μg,抗体浓度>10μg/ml)。
[0102]
实施例3抗体对sars
‑
cov
‑
2假病毒的中和活性测定
[0103]
3.1假病毒的包装：人工合成sars
‑
cov
‑
2(genbank:mn908947)的s 蛋白基因全长插入pcdna3.1表达质粒，构建pcdna
‑
sars
‑
cov2
‑
s。带 有突变的假病毒突变位点如表11所示，在s基因上引入。
[0104]
表11.假病毒突变位点
[0105]
[0106][0107]
将3
×
106(300万)个293t/17细胞接种于t75细胞培养瓶，5％co
2 37℃培养20
‑
24小时。使用fugene 6transfection reagent(promega, cat#e2691)进行转染：将30ug质粒pcdna
‑
sars
‑
cov2
‑
s转染t75培 养瓶中的293t细胞，同时加入1.05
×
106tcid50的g*δg
‑
vsv病毒感 染293t，8小时后更换培养基。转染24小时后，收集培养上清并过滤获 得sars
‑
cov2 s蛋白的假病毒，
‑
80℃冷冻保存。
[0108]
3.2中和实验：
[0109]
在一块96孔板中每孔加入100μl梯度稀释的抗体稀释液随后，用 dmem完全培养基将假病毒稀释至1.3
×
104tcid50/ml，于第3
‑
11列每 孔加50μl，使假病毒的加入量为650tcid50/孔。将上述96孔板置于细 胞培养箱中(37℃、5％co2)孵育1小时。当孵育时间至半小时，取出准备 好的vero细胞，吸弃培养基，加入pbs缓冲液清洗细胞，弃去pbs，加 入胰酶
‑
edta消化离心后，加入完全培养基重悬细胞，细胞计数。将细 胞悬液稀释至2
×
105个/ml。孵育至1小时，向96孔板中每孔加100μl 细胞，使每孔细胞为2
×
104个。将96孔板前后左右轻轻晃动，使细胞在 孔中分散均匀，将96孔板放入细胞培养箱中，37℃、5％co2培养28小 时。从细胞培养箱中取出96孔板，用多道移液器从每个上样孔中吸弃150 μl上清，然后加入100μl荧光素酶检测试剂，室温避光反应2分钟。反 应结束后，于平板振荡器震荡混匀，放入多功能读板机中读取发光值。
[0110]
计算中和抑制率：根据中和抑制率结果，计算抗体的ic50。
[0111][0112]
从27个测试抗体中，我们筛选出3株针对新冠突变株b.1.351、新冠突 变株p.1、新冠突变株b.1.1.7、新冠突变株b.1.617.1、新冠突变株b.1.617.2、 新冠突变株a假病毒均具备较强中和活性的广谱中和抗体。结果见表12。
[0113]
表12.抗体针对不同变异株假病毒的中和能力(ic50，μg/ml)
[0114][0115]
实施例4：抗体对活病毒的中和实验
[0116]
提前1天将vero
‑
e6细胞按照25000/孔的细胞数接种于48孔板，用 含10％fbs和双抗的mem培养基培养。
[0117]
抗体配置：用含5％fbs和双抗的mem培养基稀释抗体。按照48 孔板最终体积500μl/孔、每个浓度3个复孔计算，每个浓度的抗体配置 750μl(250μl/孔)，按照实际作用浓度的2倍配置抗体。从最高浓度开 始，按照一定倍数(如3倍)进行倍比稀释。同时，设置相应的阳性和 阴性对照。将配置好的抗体加入48孔板，带入p3实验室。
[0118]
将新冠病毒储存液按照moi＝100比例用含5％fbs的mem培养基 稀释，按照1：1的体积比将病毒液(250μl/孔)加入配置好的抗体，37℃ 孵育3小时。将对数生长期的vero
‑
e6细胞板上清吸净，加入孵育好的抗 体病毒混合液(500μl/孔)，37℃培养7天。后续检测：观察细胞病变， 推算中和百分比为50％的中和抗体的浓度，计为ic
50
。结果见表14。3种 单抗均能有效中和新冠突变株a活病毒，sw
‑
b1中和新冠突变株a能力 最强，ic50可达到0.0027μg/ml。sw
‑
a9、sw
‑
b1和cz
‑
d7均能有效中 和新冠突变株b.1.351活毒株、新冠突变株p.1活毒和新冠突变株 b.1.617.2活毒，其中sw
‑
a9中和新冠突变株b.1.351活毒、新冠突变株 p.1活毒和新冠突变株b.1.617.2活毒的能力非常强，ic50分别为 0.054μg/ml、0.12μg/ml和0.0016μg/ml。
[0119]
表13.抗体针对变异株活病毒的中和能力(ic50,μg/ml)
[0120][0121]
实施例5抗体结合能力测定
[0122]
通过elisa方法测定这3种抗体的结合能力。将rbd蛋白 (nc_045512)用pbs稀释至2μg/ml，每孔100μl包被96孔elisa板 (corning costar公司)，4℃过夜。用pbs
‑
t溶液(0.05％吐温
‑
20)洗板 5次；每孔加入250μl封闭液(pbs，2％bsa 5％脱脂奶粉)室温封闭1 小时。pbs
‑
t洗板3次。将抗体以10μg/ml为起始浓度，用封闭液进行5 倍系列稀释，分别取100μl样本加入到elisa板中，37℃孵育1小时。 pbs
‑
t洗板5次。每孔加入100μl用封闭液1：5000稀释后的辣根酶标记 的山羊抗人igg(h l)(北京中杉金桥生物技术有限公司)，37℃孵育1 小时。pbs
‑
t洗板5次。加入tmb显色溶液(北京金豪制药股份有限公 司)100μl，室温避光显色20分钟。每孔加入50μl终止液(北京金豪制 药股份有限公司)终止反应，酶标仪读取450nm波长的吸光度值(od) 结果如图3所示，图3中vrc01为抗hiv中和抗体，作为阴性对照。并 计算end
‑
titer值如下表15所示。
[0123]
表15.中和抗体的end
‑
titer值
[0124][0125]
实施例6抗原
‑
抗体亲和力动力学测定
[0126]
利用octet red 96系统(fortebio,usa)和链霉亲和素传感器，采 用bli技术对sw
‑
a9、sw
‑
b1、cz
‑
d7蛋白的亲和力进行检测，用pbst (含有0.02％吐温20和0.1％牛血清白蛋白的pbs)将sars
‑
cov
‑
2的生 物素化rbd(nc_045512)稀释至5μg/ml的浓度，然后固定到链霉亲 和素生物传感器(sartorius ag，germany)上60秒。在用pbst进行60 秒洗涤步骤后，将生物传感器探针浸入含有连续稀释抗体(500nm、250nm、 125nm、62.5nm、31.25nm、15.625nm和7.8125nm)的孔中并结合120 秒，然后进行300秒解离步骤。kd值采用数据分析软件9.0中的1:1结 合模型计算。得出sw
‑
b1的亲和力常数为(9.43
×
10
‑
11
±
5.29
×
10
‑
11
)m， sw
‑
a9、cz
‑
d7与rbd的亲和力常数kd均<10
‑
12
m(10
‑
12
m为bli技 术测定的亲和力下限)，结果如图4
‑
图6所示。显示这3个抗体针对rbd 具有极强的亲和力。
[0127]
本发明筛选到3株新型冠状病毒单克隆抗体，对其重链和轻链的基 因扩增产物进行测序，获得抗体的重链和轻链的基因编码序列和氨基酸 序列如下：
[0128]
sw
‑
a9抗体的重链可变区核苷酸序列如seq id no.2所示，氨基酸 序列如seq id no.1所示，重链可变区的cdr1、cdr2和cdr3氨基酸 序列如seq id no.1的第26
‑
33、51
‑
58和97
‑
112位氨基酸所示；轻链可 变区的核苷酸序列如seq id no.4所示，氨基酸序列如seq id no.3所 示，轻链可变区的cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列如seq id no.3 的第27
‑
33 51
‑
53 90
‑
99位氨基酸所示。
[0129]
sw
‑
b1抗体的重链可变区核苷酸序列如seq id no.6所示，氨基酸 序列如seq id no.5所示，重链可变区的cdr1、cdr2和cdr3氨基酸 序列如seq id no.5的第26
‑
33、51
‑
58和97
‑
114位氨基酸所示；轻链可 变区的核苷酸序列如seq id no.8所示，氨基酸序列如seq id no.7所 示，轻链可变区的cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列如seq id no.7 的第27
‑
38、56
‑
58、95
‑
103位氨基酸所示。
[0130]
抗体cz
‑
d7的重链可变区核苷酸序列如seq id no.10所示，重链 可变区的氨基酸
序列如seq id no.9所示，其中，重链可变区的cdr1、 cdr2和cdr3的氨基酸序列分别如seq id no.9的第26
‑
33、51
‑
58和 97
‑
114位氨基酸所示；轻链可变区核苷酸序列如seq id no.12所示，轻 链可变区的氨基酸序列如seq id no.11所示，其中，轻链可变区的cdr1、 cdr2和cdr3的氨基酸序列分别如seq id no.11的第27
‑
33、51
‑
53、 90
‑
98位氨基酸所示。
[0131]
上述抗体的重链恒定区的多核苷酸序列如seq id no.14所示，轻链 恒定区的多核苷酸序列如seq id no.16所示(kappa链)。抗体重链恒定 区的氨基酸序列如seq id no.13所示，所述轻链恒定区的氨基酸序列如 seq id no.15所示。