一种沙地云杉体细胞胚胎萌发前的干化标记方法与流程

1.本发明涉及植物组织培养技术领域，尤其是一种沙地云杉体细胞胚胎萌发前的干化标记方法。


背景技术：

2.一个完整的体细胞胚胎发生过程包括胚性愈伤组织的诱导、增殖和成熟体细胞胚胎的分化、萌发四个阶段。其中，成熟的体细胞胚胎的萌发阶段作为整个技术体系的最后一步，体细胞胚萌发率的高低及萌发质量直接决定着最终体胚苗的收获量和整个体胚技术体系构建的成败。目前，在针叶树体细胞胚胎萌发阶段，为提高体细胞胚胎的萌发率和萌发质量，国内外常用的方法是将体细胞胚胎萌发之前进行干化预处理。通常，失水现象是体细胞胚胎由成熟阶段向萌发阶段转变的最直接响应，可以促使体细胞胚胎由形态成熟向生理成熟转变。但目前，对于沙地云杉这一树种而言，并无可参考的人工制备和萌发的手段。


技术实现要素：

3.本发明的目的是根据上述现有技术的不足，提供了一种沙地云杉体细胞胚胎萌发前的干化标记方法，通过对体细胞胚胎给予适当的干化失水处理，不仅能够抑制分化培养基中体细胞胚胎的提早萌发，还能够提高萌发阶段中的萌发数量和质量。
4.本发明目的实现由以下技术方案完成：一种沙地云杉体细胞胚胎萌发前的干化标记方法，其特征在于：所述干化标记方法包括以下步骤：将消毒灭菌处理后的沙地云杉的成熟种子进行剥离出胚，得到沙地云杉的成熟胚胎；将剥离出的沙地云杉成熟胚胎接种至培养基中培养，得到愈伤组织；将得到的沙地云杉的愈伤组织接种到分化培养基中，诱导形成体细胞胚胎；采用“滤纸容器法”对沙地云杉的体细胞胚胎进行干化标记处理。
5.所述“滤纸容器法”指的是利用培养皿和滤纸的组合进行干化处理，再将至少两种“滤纸容器法”的干化处理结果进行比较，确定最佳干化处理方法。
6.所述的至少两种“滤纸容器法”中一种，即“滤纸容器法1”是将发育完全的沙地云杉的体细胞胚胎放置在底垫有两层滤纸的塑料培养皿中，塑料培养皿的最下面垫一层湿滤纸，在湿滤纸上垫一层干滤纸，将沙地云杉的体细胞胚胎放置在干滤纸上，然后将塑料培养皿用封口膜封口。
7.所述的至少两种“滤纸容器法”中一种，即“滤纸容器法2”将发育完全的沙地云杉的体细胞胚胎放置在底垫有两层干滤纸的塑料培养皿中，随后将塑料培养皿放置在另一玻璃培养皿内，在玻璃培养皿中放置适量无菌水，使沙地云杉的体细胞胚胎处于一个相对干燥的环境中，将沙地云杉的体细胞胚胎放置在塑料培养皿的干滤纸上，然后将玻璃培养皿用封口膜封口。
8.每种干化处理方法设置至少三次重复，每种干化方法的培养皿内放20
‑
30个体细
胞胚胎，一个培养皿为一次重复，随后将至少两种干化处理的体细胞胚胎分别放置在暗培养下培养，观察培养皿内体细胞胚胎的形态变化。
9.采用“滤纸容器法1”干化处理方式，干化处理0d、3d、6d、9d、12d、15d、18d、21d、24d、27d和30d后，分别进行萌发对比实验；每个处理设置三次重复，每个塑料培养皿内放置20
‑
30个发育完整的沙地云杉的体细胞胚胎作为一次重复，确定最佳干化时间。
10.所述沙地云杉的体细胞胚胎的萌发培养基为1/2 ms 蔗糖30g/l 琼脂6g/l，培养基ph 5.8，培养温度（23
±
1）℃，黑暗培养1周后转到光照培养条件下，三周后统计正常萌发的体细胞胚胎数量。
11.以所述沙地云杉的愈伤组织分化的体细胞胚胎为材料，采用“滤纸容器法1”干化处理方式，干化处理12d后，根据干化处理后的颜色变化，将体细胞胚胎分为两种类型，分别为无颜色变化型以及绿色的子叶、胚轴和胚根型；分别将这两种类型的体细胞胚胎进行萌发比较，每个处理设置三次重复，每个塑料培养皿放置20
‑
30个发育完整的体细胞胚胎作为一次重复，进行体细胞胚胎的干化标记。
12.本发明的优点是：实现提高沙地云杉体细胞胚胎的萌发率，提高沙地云杉组培苗的生根成苗率，沙地云杉体细胞胚胎干化标记处理后的萌发率是84.2%，生根成苗率是78%，未经干化标记处理的沙地云杉体细胞胚胎的萌发率是57.6%，生根成苗率30.5%，为沙地云杉人工种子的制备与萌发提供了技术保障；可以借鉴到其它植物体细胞胚胎发生的组培育苗途径中，具有重要的推广价值。
具体实施方式
13.以下通过实施例对本发明特征及其它相关特征作进一步详细说明，以便于同行业技术人员的理解：实施例：本实施例中的沙地云杉体细胞胚胎萌发前的干化标记的方法，包括以下步骤：（1）沙地云杉外植体的消毒方法采集的沙地云杉成熟种子进行处理，按照以下步骤进行消毒灭菌处理：将成熟的沙地云杉种子用自来水浸泡12小时；在超净工作台上，将浸泡后的成熟种子使用75%的酒精消毒30秒；用75%的酒精消毒完成后用无菌水冲洗种子3
‑
5次；再使用2%的次氯酸钠消毒8分钟；次氯酸钠消毒完成后，用无菌水冲洗3
‑
5次。
14.（2）沙地云杉诱导愈伤组织的方法沙地云杉诱导愈伤组织的基本培养基为添加有凝胶、肌醇、酸水解酪蛋白、谷氨酰胺与蔗糖的1/2 lm培养基，培养基成分为1/2 lm 0.6
‑
1.8mg/l 6
‑
ba 1.0
‑
2.7 mg/l 2,4
‑
d。培养条件为暗培养，培养温度均为23
±
1℃。
15.（3）沙地云杉体细胞胚胎的培养沙地云杉愈伤组织分化培养基为添加有凝胶、肌醇、酸水解酪蛋白、谷氨酰胺、peg4000与蔗糖的1/2 lm培养基，培养基成分为1/2 lm 18
‑
26mg/l aba。培养条件为暗培养，培养温度均为23
±
1℃。
16.（4）干化方法以沙地云杉愈伤组织分化的体细胞胚胎为材料，采用两种“滤纸容器法”进行干化
方法的比较。
17.1）“滤纸容器法1”将发育完全的体细胞胚胎放置在垫有两层滤纸的塑料培养皿（80
×
24mm）中，塑料培养皿最下面垫一层湿滤纸，上面垫一层干滤纸，将体细胞胚胎放置在干滤纸上，然后将培养皿用封口膜封口。
18.2）“滤纸容器法2”将发育完全的体细胞胚胎放置在底垫有两层干滤纸的塑料培养皿（60
×
12mm）中，随后将塑料培养皿放置在更大的玻璃培养皿（87
×
15mm）内，玻璃皿中放置10ml无菌水，这样使得体细胞胚胎处于一个相对干燥的环境中，将体细胞胚胎放置在塑料培养皿的干滤纸上，然后将玻璃皿用封口膜封口。每种干化处理方法设置三次重复，每种干化方法的培养皿内放置20
‑
30个体细胞胚胎，一个培养皿为一次重复，随后将至少两种干化处理的体细胞胚胎分别放置在暗培养下培养，观察培养皿内体细胞胚胎的形态变化。根据观察结果，确定最佳干化处理方法。
19.（5）干化时间的比较以沙地云杉愈伤组织分化的体细胞胚胎为材料，采用“滤纸容器法1”干化方式，干化处理0d、3d、6d、9d、12d、15d、18d、21d、24d、27d和30d后，分别进行萌发对比实验。每个处理设置三次重复，每个塑料培养皿内放置20
‑
30个发育完整的体细胞胚胎作为一次重复。萌发培养基为1/2 ms 蔗糖30 g/l 琼脂6 g/l，培养基ph 5.8，培养温度（23
±
1）℃，黑暗培养1周后转到光照培养条件下，3周后统计正常萌发的体细胞胚胎数量，确定最佳干化时间。
20.（6）体细胞胚的干化标记以沙地云杉愈伤组织分化的体细胞胚胎为材料，采用“滤纸容器法1”干化方式，干化处理12d后，根据干化处理后的颜色变化，将体细胞胚胎分为两种类型，分别为无颜色变化型以及绿色的子叶、胚轴和胚根型。分别将这两种类型的体细胞胚胎进行萌发比较，每个处理设置三次重复，每个塑料培养皿放置20
‑
30个发育完整的体细胞胚胎作为一次重复。萌发培养基和培养条件按步骤（5）进行。
21.本实施例中的一种沙地云杉体细胞胚胎萌发前的干化标记方法，其“滤纸容器法1”干化方式最佳，干化最佳时间段为15
‑
21d。沙地云杉体细胞胚胎干化后可以实现体细胞胚胎萌发率的提高，经干化标记处理后的沙地云杉体细胞胚胎的萌发率是84.2%，生根成苗率是78%，而未经干化标记处理沙地云杉体细胞胚胎的萌发率是57.6%，生根成苗率30.5%。因此，本实施例可大大提高沙地云杉体细胞胚胎的萌发率和生根成苗率，满足沙地云杉组培苗的市场需求，具有重要的推广价值。
22.虽然以上实施例已经对本发明目的的构思和实施例做了详细说明，但本领域普通技术人员可以认识到，在没有脱离权利要求限定范围的前提条件下，仍然可以对本发明作出各种改进和变换，故在此不一一赘述。