生长促进肽及其用途的制作方法

生长促进肽及其用途
1.分案申请
2.本技术为申请号201680053432.6、申请日2016年7月18日、题为“生长促进肽及其用途”的分案申请。


背景技术：

3.越来越多的人希望保持年轻的外表，这使得越来越多的人开始研究新的皮肤病学方法来治疗皮肤衰老，特别是当人们更长寿且更健康时。随着年龄的增长，人们在人类皮肤中观察到了结构和功能的变化(calleja
‑
agius j.等人，2013)，并且造成这种情况的因素很多，例如诸如来自阳光的紫外线辐射的环境因素或诸如更年期激素变化的内部因素(affinito p.等人，1999)。
4.真皮和表皮中结缔组织的改变，特别是细胞外基质的减少是皮肤起皱纹和下垂的重要原因，因为它们会引起其机械性能发生重要变化。此外，细胞外基质的代谢和合成受到通过酶活性控制的衰老过程的影响。
5.目前抗衰老过程主要有四种解决方案：
6.饮食和激素管理：通过使用补充剂管理我们的饮食来对抗衰老过程。目前这种方法还存在争议。一些研究表明，例如，抗氧化补充剂，如维生素c或硫辛酸，可能具有抗衰老性能。
7.激素治疗：有风险和有争议的抗衰老解决方案。人们必须非常小心与激素有关的任何事情，因为它可能有广泛的副作用。这个解决方案并没有被广泛使用，并且大多数研究仍处于动物阶段。
8.手术抗衰老解决方案：其在短期内非常有效，但昂贵并且需要很长时间来康复。就像每一次手术一样，有风险也有副作用。例如，在手术抗衰老解决方案中，如眼睑美容术和去皱整容手术中，在发际线处进行切口的情况下，可能出现瘀伤、肿胀、眼睑下垂和继发感染的一些风险。
9.最近，人们对设计成用于处理像皱纹、面部容量减少和其它皮肤损伤等问题的微创治疗和技术越来越感兴趣。最常见的局部抗衰老解决方案是涂抹面霜和精华素。它们的有效成分可分为几个系列：
10.保湿成分将保持皮肤水润。其主要是与水结合的大极性分子，如粘多糖(例如，透明质酸)。
11.胶原蛋白和其他细胞外基质相关成分如果能够触发正确的受体，则其将通过刺激生物合成而有助于维持良好的组织皮肤结构。
12.细胞增殖成分也很重要，因为它们有助于促进皮肤细胞再生，其将合成皮肤所需要的成分，如细胞外基质和生长因子。
13.本发明的目的是提供一种皮肤衰老的替代性微创治疗。


技术实现要素：

14.豌豆基因组编码了超过70,000种不同蛋白质。本技术人鉴定了其中的六种蛋白质，每种蛋白质均含有一种或多种能够促进细胞生长和/或增殖的肽(以下称为“生长促进肽(growth promoting peptide)”或“生长促进片段(growth promoting fragment)”)。同样地，在由水稻基因组编码的超过60,000种蛋白质中，本技术人鉴定了七种蛋白质，每种蛋白质均含有一种或多种具有生物活性的肽，通常能够促进细胞生长和/或增殖。已证实14种鉴定的蛋白质的细胞生长促进片段对弹性蛋白和胶原产生以及细胞增殖具有影响(图1至109)。从其衍生天然肽的特定植物蛋白质在sequence id no:1
‑
14和705至716中提供。从其衍生肽的特定豌豆蛋白质包括sequence id no:1
‑
2和7
‑
10，而从其衍生肽的特定大米蛋白质包括sequence id no:3
‑
6和11
‑
13。这些蛋白质的同源物在sequence id no:525至564中描述。最初在豌豆蛋白质中鉴定的特定肽在sequence id no:15
‑
215和283
‑
340中显示。最初在大米蛋白质中鉴定的特定肽在sequence id no:216
‑
282和341
‑
412中显示。本发明公开的在豌豆和大米蛋白质中鉴定的其它肽及其变体在sequence id no 418至515和546至704以及717
‑
775中提供。
15.在第一方面，本发明提供了一种长度通常为5至50个氨基酸的肽，并且包含(a)豌豆或大米蛋白质的片段，例如本文公开的豌豆和大米蛋白质，例如选自sequence id no:1至14和705至716以及717
‑
732的一种或其同源物，或(b)片段的变体，或(c)肽的片段(以下称为“本发明的肽”)。在一个实施方案中，肽是生物活性的。在一个实施方案中，肽具有细胞生长或增殖促进活性。
16.在一个实施方案中，本发明的肽包含选自sequence id no:15
‑
505和546
‑
704以及717
‑
775的序列。
17.在一个实施方案中，本发明的肽基本上由选自sequence id no:15
‑
505和546
‑
704以及717
‑
775的序列组成。
18.在一个实施方案中，本发明的肽由约3
‑
50个氨基酸组成。在一个实施方案中，本发明的肽由约4
‑
50个氨基酸组成。在一个实施方案中，本发明的肽由约5
‑
50个氨基酸组成。在一个实施方案中，本发明的肽由约6
‑
50个氨基酸组成。在一个实施方案中，本发明的肽由约7
‑
50个氨基酸组成。
19.在一个实施方案中，片段具有8至37个氨基酸。在一个实施方案中，片段具有
‑
10至 4的电荷。
20.优选地，c
‑
末端氨基酸不是半胱氨酸(c)或蛋氨酸(m)。
21.优选地，n
‑
末端氨基酸不是半胱氨酸(c)、组氨酸(h)或脯氨酸(p)。
22.优选地，片段的c
‑
末端结构域不含半胱氨酸(c)。
23.优选地，片段的n
‑
末端结构域不含半胱氨酸(c)。
24.优选地，片段不含半胱氨酸(c)。
25.优选地，肽不含半胱氨酸(c)。
26.在本发明的一个实施方案中，肽包含选自sequence id no:15至505的序列。
27.在本发明的一个实施方案中，肽基本上由选自sequence id no:15至505的序列组成。
28.优选地，片段选自sequence id no:15
‑
215和283
‑
340，或片段的生物活性变体。
29.优选地，片段选自sequence id no:216
‑
282和341
‑
412，或片段的生物活性变体。
30.优选地，肽由选自sequence id no:15至417的片段，或片段的生物活性变体组成。
31.优选地，肽由选自sequence id no:15至417的序列组成。
32.优选地，片段选自sequence id no:413
‑
417，或片段的生物活性变体。
33.在一个实施方案中，肽包含或由选自seq id no:246、283、284、245和42的片段或片段的生物活性变体组成。
34.在一个实施方案中，肽包含选自seq id no:247至268的片段。
35.在一个实施方案中，本发明的肽被修饰。在一个实施方案中，肽被保护基团修饰。在一个实施方案中，肽被修饰以增加它的亲脂性。在一个实施方案中，肽被修饰以增加它的半衰期。在一个实施方案中，肽的n
‑
末端或c
‑
末端氨基酸被修饰。在一个实施方案中，肽的n
‑
末端或c
‑
末端氨基酸被保护基团修饰。
36.[sequence id no:1(豌豆蛋白质1
‑
p13918)]
[0037]
优选地，肽包含sequence id no:1的蛋白质的生物活性片段，或其同源物，或片段的生物活性变体。
[0038]
优选地，肽包含选自sequence id no:15至90的生物活性片段，或片段的生物活性变体。
[0039]
本发明还提供了一种组合物，其包含至少1种，优选为至少2种，优选为至少3种，优选为至少4种，优选为至少5种，优选为至少6种，优选为至少7种，优选为至少8种，优选为至少9种，或优选为至少10种本发明的生物活性肽，其中的每一种通常包含sequence id no:1的不同生物活性片段或其同源物。优选地，组合物包含第一生物活性肽和第二生物活性肽，所述第一生物活性肽含有选自sequence id no:15至90的第一生物活性片段(或片段的生物活性变体)所述第二生物活性肽含有选自sequence id no:15至90的第二生物活性片段(或片段的生物活性变体)。
[0040]
在一个实施方案中，生物活性肽、变体或片段分别是细胞生长肽或增殖促进肽、变体或片段。
[0041]
豌豆蛋白质1(sequence id no:1)的同源物包括蚕豆(vicia fabia)、鹰嘴豆(cicer arietinum)和兵豆(lens culinaris)同源物(seq id no:525至527)。
[0042]
[sequence id no:2(豌豆蛋白质2
‑
q9m3x6)]
[0043]
优选地，肽包含sequence id no:2的蛋白质的生物活性片段，或其同源物，或片段的生物活性变体。
[0044]
优选地，肽包含选自sequence id no:91至215的生物活性片段，或片段的生物活性变体。
[0045]
本发明还提供了一种组合物，其包含至少1种，优选为至少2种，优选为至少3种，优选为至少4种，优选为至少5种，优选为至少6种，优选为至少7种，优选为至少8种，优选为至少9种，或优选为至少10种本发明的生物活性肽，其中的每一种包含sequence id no:2的不同生物活性片段或其同源物。优选地，组合物包含第一生物活性肽和第二生物活性肽，所述第一生物活性肽含有选自sequence id no 91
‑
215的生物活性片段，所述第二生物活性肽含有选自sequence id no 91
‑
215的生物活性片段。
[0046]
在一个实施方案中，生物活性肽、变体或片段分别是细胞生长肽或增殖促进肽、变
体或片段。
[0047]
豌豆蛋白质2(sequence id no:2)的同源物包括埃塞尔比亚豌豆(pisum abyssinicum)、山黧豆葵(lathyrus annuus)和长柔毛野豌豆(vicia villosa)(seq id 528至530)。
[0048]
[sequence id no:3(大米蛋白质1
‑
q0dev5)]
[0049]
优选地，肽包含sequence id no:3的蛋白质的生物活性片段，或其同源物，或片段的生物活性变体。
[0050]
优选地，肽包含选自sequence id no:216
‑
244的生物活性片段，或片段的生物活性变体。
[0051]
本发明还提供了一种组合物，其包含至少1种，优选为至少2种，优选为至少3种，优选为至少4种，优选为至少5种，优选为至少6种，优选为至少7种，优选为至少8种，优选为至少9种，或优选为至少10种本发明的生物活性肽，其中的每一种包含sequence id no:3的不同生物活性片段或其同源物。优选地，组合物包含第一生物活性肽和第二生物活性肽，所述第一生物活性肽含有选自sequence id no 216
‑
244的生物活性片段，所述第二生物活性肽含有选自sequence id no 216
‑
244的生物活性片段。
[0052]
在一个实施方案中，生物活性肽、变体或片段分别是细胞生长肽或增殖促进肽、变体或片段。
[0053]
大米蛋白质1(sequence id no:15)的同源物包括普通野生稻(oryza rufipogon)、药用野生稻(oryza officinalis)、青稞(hordeum vulgare subsp.vulgare)(seq id no:531至533)。
[0054]
[sequence id no:4(大米蛋白质2
‑
p14323)]
[0055]
优选地，肽包含sequence id no:4的蛋白质的生物活性片段，或其同源物，或片段的生物活性变体。
[0056]
优选地，肽包含选自sequence id no:245
‑
246的生物活性片段，或片段的生物活性变体。
[0057]
本发明还提供了一种包含本发明的至少一种或多种肽的组合物，其包含sequence id no:4的不同生物活性片段或其同源物。优选地，组合物包含第一肽和第二肽，所述第一肽含有生物活性片段seq id no:245，所述第二肽含有生物活性片段seq id no:246。
[0058]
在一个实施方案中，生物活性肽、变体或片段分别是细胞生长肽或增殖促进肽、变体或片段。
[0059]
大米蛋白质2(sequence id no:4)的同源物包括短花药野生稻(oryza brachyantha)和菰(zizania latifolia)(seq id no:534至536)。
[0060]
[sequence id no:5(大米蛋白质3
‑
p29835)]
[0061]
优选地，肽包含sequence id no:5的蛋白质的生物活性片段，或其同源物，或片段的生物活性变体。
[0062]
优选地，肽包含选自sequence id no:247
‑
268的生物活性片段，或片段的生物活性变体。
[0063]
本发明还提供了一种组合物，其包含至少1种，优选为至少2种，优选为至少3种，优选为至少4种，优选为至少5种，优选为至少6种，优选为至少7种，优选为至少8种，优选为至
少9种，或优选为至少10种本发明的生物活性肽，其中的每一种包含sequence id no:5的不同生物活性片段或其同源物。优选地，组合物包含第一生物活性肽和第二生物活性肽，所述第一生物活性肽含有选自sequence id no 247
‑
268的生物活性片段，所述第二生物活性肽含有选自sequence id no 247
‑
268的生物活性片段。
[0064]
在一个实施方案中，生物活性肽、变体或片段分别是细胞生长肽或增殖促进肽、变体或片段。
[0065]
大米蛋白质3(sequence id no:5)的同源物包括玉米(zea mays)、高梁(sorghum bicolor)和小米(setaria italica)(seq id 537至539)。
[0066]
[sequence id no:6(大米蛋白质4
‑
p14614)]
[0067]
优选地，肽包含sequence id no:6的蛋白质的生物活性片段，或其同源物，或片段的生物活性变体。
[0068]
优选地，肽包含选自sequence id no:269
‑
282的生物活性片段，或片段的生物活性变体。
[0069]
本发明还提供了一种组合物，其包含至少1种，优选为至少2种，优选为至少3种，优选为至少4种，优选为至少5种，优选为至少6种，优选为至少7种，优选为至少8种，优选为至少9种，或优选为至少10种本发明的生物活性肽，其中的每一种包含sequence id no:6的不同生物活性片段或其同源物。优选地，组合物包含第一生物活性肽和第二生物活性肽，所述第一生物活性肽含有选自sequence id no 269
‑
282的生物活性片段，所述第二生物活性肽含有选自sequence id no 269
‑
282的生物活性片段。
[0070]
在一个实施方案中，生物活性肽、变体或片段分别是细胞生长肽或增殖促进肽、变体或片段。
[0071]
大米蛋白质4(sequence id no:6)的同源物包括粳稻组水稻(oryza sativa japonica group)、二穗短柄草(brochypodium distachyon)(seq id no:540至542)。
[0072]
[sequence id no:7(豌豆蛋白质3
‑
p09918)]
[0073]
优选地，肽包含sequence id no:7的蛋白质的生物活性片段，或其同源物，或片段的生物活性变体。
[0074]
优选地，肽包含sequence id no:283的生物活性片段，或片段的生物活性变体。
[0075]
本发明还提供了一种组合物，其包含至少1种，优选为至少2种，优选为至少3种，优选为至少4种，优选为至少5种，优选为至少6种，优选为至少7种，优选为至少8种，优选为至少9种，或优选为至少10种本发明的生物活性肽，其中的每一种包含sequence id no:7的不同生物活性片段或其同源物。优选地，组合物包含sequence id no:283的生物活性片段，或片段的生物活性变体。
[0076]
在一个实施方案中，生物活性肽、变体或片段分别是细胞生长肽或增殖促进肽、变体或片段。
[0077]
豌豆蛋白质3(sequence id no:7)的同源物包括蒺藜苜蓿(medicago truncatula)、野大豆(glycine soja)和菜豆(phaseolus vulgaris)(seq id no:543至545)。
[0078]
[sequence id no:8(豌豆蛋白质4
‑
p02857)]
[0079]
优选地，肽包含sequence id no:8的蛋白质的生物活性片段，或其同源物，或片段
的生物活性变体。
[0080]
优选地，肽包含选自sequence id no:284
‑
307的生物活性片段，或片段的生物活性变体。
[0081]
本发明还提供了一种组合物，其包含至少1种，优选为至少2种，优选为至少3种，优选为至少4种，优选为至少5种，优选为至少6种，优选为至少7种，优选为至少8种，优选为至少9种，或优选为至少10种本发明的生物活性肽，其中的每一种包含sequence id no:8的不同生物活性片段或其同源物。优选地，组合物包含第一生物活性肽和第二生物活性肽，所述第一生物活性肽含有选自sequence id no 284
‑
307的生物活性片段，所述第二生物活性肽含有选自sequence id no 284
‑
307的生物活性片段。
[0082]
在一个实施方案中，生物活性肽、变体或片段分别是细胞生长肽或增殖促进肽、变体或片段。
[0083]
豌豆蛋白质4(sequence id no:8)的同源物包括箭筈豌豆(vicia sativa)、法国野豌豆(vicia narbonesis)和鹰嘴豆(cicer arietinum)(seq id no:546至548)。
[0084]
[sequence id no:9(豌豆蛋白质5
‑
p02855)]
[0085]
优选地，肽包含sequence id no:9的蛋白质的生物活性片段，或其同源物，或片段的生物活性变体。
[0086]
优选地，肽包含选自sequence id no:308
‑
339的生物活性片段，或片段的生物活性变体。
[0087]
本发明还提供了一种组合物，其包含至少1种，优选为至少2种，优选为至少3种，优选为至少4种，优选为至少5种，优选为至少6种，优选为至少7种，优选为至少8种，优选为至少9种，或优选为至少10种本发明的生物活性肽，其中的每一种包含sequence id no:9的不同生物活性片段或其同源物。优选地，组合物包含第一生物活性肽和第二生物活性肽，所述第一生物活性肽含有选自sequence id no 308
‑
339的生物活性片段，所述第二生物活性肽含有选自sequence id no 308
‑
339的生物活性片段。
[0088]
在一个实施方案中，生物活性肽、变体或片段分别是细胞生长肽或增殖促进肽、变体或片段。
[0089]
豌豆蛋白质5(sequence id no:9)的同源物包括硬毛山黧豆(lathyrus hirsutus)、扁荚山黧豆(lathyrus cicero)、家山黧豆(lathyrus sativus)(seq id no:549至551)。
[0090]
[sequence id no:10(豌豆蛋白质6
‑
d3vne1)]
[0091]
优选地，肽包含sequence id no:10的蛋白质的生物活性片段，或其同源物，或片段的生物活性变体。
[0092]
优选地，肽包含sequence id no:340的生物活性片段，或片段的生物活性变体。
[0093]
本发明还提供了一种组合物，其包含至少1种，优选为至少2种，优选为至少3种，优选为至少4种，优选为至少5种，优选为至少6种，优选为至少7种，优选为至少8种，优选为至少9种，或优选为至少10种本发明的生物活性肽，其中的每一种包含sequence id no:10的不同生物活性片段或其同源物。优选地，组合物包含含有生物活性片段sequence id no 340的第一生物活性肽。
[0094]
在一个实施方案中，生物活性肽、变体或片段分别是细胞生长肽或增殖促进肽、变
体或片段。
[0095]
豌豆蛋白质6(sequence id no:10)的同源物包括蒺藜苜蓿(medicago truncatula)、游隼野蚕豆(vicia peregrine)和黄花蚕豆(vicia lutea)(seq id no:552至554)。
[0096]
[sequence id no:11(大米蛋白质5
‑
p07728)]
[0097]
优选地，肽包含sequence id no:11的蛋白质的生物活性片段，或其同源物，或片段的生物活性变体。
[0098]
优选地，肽包含选自sequence id no:341
‑
358的生物活性片段，或片段的生物活性变体。
[0099]
本发明还提供了一种组合物，其包含至少1种，优选为至少2种，优选为至少3种，优选为至少4种，优选为至少5种，优选为至少6种，优选为至少7种，优选为至少8种，优选为至少9种，或优选为至少10种本发明的生物活性肽，其中的每一种包含sequence id no:11的不同生物活性片段或其同源物。优选地，组合物包含第一生物活性肽和第二生物活性肽，所述第一生物活性肽含有选自sequence id no 341
‑
358的生物活性片段，所述第二生物活性肽含有选自sequence id no 341
‑
358的生物活性片段。
[0100]
在一个实施方案中，生物活性肽、变体或片段分别是细胞生长肽或增殖促进肽、变体或片段。
[0101]
大米蛋白质5(sequence id no:11)的同源物包括籼稻组水稻(oryza sativa indica group)、菰(zizania latifolia)、燕麦(avena sativa)(seq id no:555至557)。
[0102]
[sequence id no:12(大米蛋白质6
‑
p07730)]
[0103]
优选地，肽包含sequence id no:12的蛋白质的生物活性片段，或其同源物，或片段的生物活性变体。
[0104]
优选地，肽包含选自sequence id no:359
‑
401的生物活性片段，或片段的生物活性变体。
[0105]
本发明还提供了一种组合物，其包含至少1种，优选为至少2种，优选为至少3种，优选为至少4种，优选为至少5种，优选为至少6种，优选为至少7种，优选为至少8种，优选为至少9种，或优选为至少10种本发明的生物活性肽，其中的每一种包含sequence id no:12的不同生物活性片段或其同源物。优选地，组合物包含第一生物活性肽和第二生物活性肽，所述第一生物活性肽含有选自sequence id no 359
‑
401的生物活性片段，所述第二生物活性肽含有选自sequence id no 359
‑
401的生物活性片段。
[0106]
在一个实施方案中，生物活性肽、变体或片段分别是细胞生长肽或增殖促进肽、变体或片段。
[0107]
大米蛋白质6(sequence id no:12)的同源物包括短花药野生稻(oryza brachyantha)、二穗短柄草(brochypodium distachyon)(seq id no:558至560)。
[0108]
[sequence id no:13(大米蛋白质7
‑
q0d7s0)]
[0109]
优选地，肽包含sequence id no:13的蛋白质的生物活性片段，或其同源物，或片段的生物活性变体。
[0110]
优选地，肽包含选自sequence id no:402
‑
412的生物活性片段，或片段的生物活性变体。
[0111]
本发明还提供了一种组合物，其包含至少1种，优选为至少2种，优选为至少3种，优选为至少4种，优选为至少5种，优选为至少6种，优选为至少7种，优选为至少8种，优选为至少9种，或优选为至少10种本发明的生物活性肽，其中的每一种包含sequence id no:13的不同生物活性片段或其同源物。优选地，组合物包含第一生物活性肽和第二生物活性肽，所述第一生物活性肽含有选自sequence id no 402
‑
412的生物活性片段，所述第二生物活性肽含有选自sequence id no 402
‑
412的生物活性片段。
[0112]
在一个实施方案中，生物活性肽、变体或片段分别是细胞生长肽或增殖促进肽、变体或片段。
[0113]
大米蛋白质7(sequence id no:13)的同源物包括籼稻组水稻(oryza sativa indica group)、菰(zizania latifolia)、燕麦(avena sativa)(seq id no:561至564)。
[0114]
[sequence id no:14(金黄色酿脓葡萄球菌蛋白质1
‑
p0c1u8)]
[0115]
优选地，肽包含sequence id no:14的蛋白质的片段，或其同源物。
[0116]
优选地，肽包含选自sequence id no:413
‑
417的生物活性片段，或片段的生物活性变体。
[0117]
本发明还提供了一种组合物，其包含至少1种，优选为至少2种，优选为至少3种，优选为至少4种，优选为至少5种，优选为至少6种，优选为至少7种，优选为至少8种，优选为至少9种，或优选为至少10种本发明的生物活性肽，其中的每一种包含sequence id no:14的不同生物活性片段或其同源物。优选地，组合物包含第一生物活性肽和第二生物活性肽，所述第一生物活性肽含有选自sequence id no 413
‑
417的生物活性片段，所述第二生物活性肽含有选自sequence id no 413
‑
417的生物活性片段。
[0118]
在一个实施方案中，生物活性肽、变体或片段分别是细胞生长肽或增殖促进肽、变体或片段。
[0119]
金黄色酿脓葡萄球菌_蛋白质1(sequence id no:14)的同源物包括：
[0120]
>gi|580560623|gb|evf84961.1|谷氨酰内肽酶[金黄色酿脓葡萄球菌coas6020]
[0121]
>gi|580687002|gb|evh10169.1|谷氨酰内肽酶[金黄色酿脓葡萄球菌ucim6080]
[0122]
>gi|751815683|gb|kin24957.l|谷氨酰内肽酶[金黄色酿脓葡萄球菌mrsa_cvm43477]
[0123]
>gi|781884797|dbj|bar08486.1|谷氨酰内肽酶前体[金黄色酿脓葡萄球菌亚种金黄色葡萄球菌]
[0124]
>gi|781887762|dbj|bar11210.1|谷氨酰内肽酶前体[金黄色酿脓葡萄球菌亚种金黄色葡萄球菌]
[0125]
本发明还提供了一种组合物，其包含至少一种且优选为多种本发明的肽，其中每种本发明的肽包含本文公开的蛋白质的生物活性片段，例如选自sequence id no:1至14或其同源物，或片段的生物活性变体。
[0126]
通常，本发明的所述肽或每种肽包含选自sequence id no:15
‑
505和546至704以及717
‑
775的生物活性片段，或片段的生物活性变体。
[0127]
通常，本发明的所述肽或每种肽选自选自sequence id no:15
‑
505和546至704以及717
‑
775的生物活性片段，或片段的生物活性变体。
[0128]
本发明还提供了包含至少一种且优选为多种的本发明的肽的组合物，其中本发明
的所述肽或每种肽包含本文公开的豌豆或大米蛋白质的生物活性片段，其通常选自sequence id no:1
‑
2和7
‑
10。通常，本发明的所述肽或每种肽选自或包含选自sequence id no:15
‑
215和283至340的生物活性片段，或片段的生物活性变体。
[0129]
本发明还提供了包含至少一种且优选为多种的本发明的肽的组合物，其中本发明的所述肽或每种肽包含本文公开的蛋白质的生物活性片段，其通常选自sequence id no:3
‑
6和11
‑
13。通常，本发明的所述肽或每种肽选自或包含选自sequence id no:216
‑
282和341
‑
412的生物活性片段，或片段的生物活性变体。
[0130]
优选地，组合物包含本发明的至少两种不同的生长促进肽。
[0131]
优选地，组合物包含本发明的至少三种不同的生长促进肽。
[0132]
优选地，组合物包含本发明的至少四种不同的生长促进肽。
[0133]
优选地，组合物包含本发明的至少五种不同的生长促进肽。
[0134]
优选地，组合物包含本发明的至少六种不同的生长促进肽。
[0135]
优选地，组合物包含本发明的至少七种不同的生长促进肽。
[0136]
优选地，组合物包含本发明的至少八种不同的生长促进肽。
[0137]
优选地，组合物包含本发明的至少九种不同的生长促进肽。
[0138]
优选地，组合物包含本发明的至少十种不同的生长促进肽。
[0139]
在一个实施方案中，组合物包含sequence id no 247至268中的一种或多种。
[0140]
在一个实施方案中，组合物包含sequence id no 248、249、252、253和257中的一种或多种。
[0141]
在一个实施方案中，本发明包括一种组合物，其包含基本上全部的片段sequence id no:15
‑
215和283
‑
340，或片段的生长促进变体，或生长促进片段和变体的混合物。
[0142]
在一个实施方案中，本发明包括一种组合物，其包含基本上全部的片段sequence id no:216
‑
282和341
‑
412，或片段的生长促进变体，或生长促进片段和变体的混合物。
[0143]
在一个实施方案中，组合物富含分子量小于10kd的肽。
[0144]
在一个实施方案中，组合物是粉末。
[0145]
本发明还涉及适用于涂敷到伤口并且包含本发明的肽或组合物的石膏、绷带或敷料(dressing)。
[0146]
本发明还涉及一种包含本发明的肽的人造细胞培养基。本发明还涉及一种包含本发明的组合物的人造细胞培养基。在一个实施方案中，配制细胞培养基用于培养真核细胞。在一个实施方案中，配制细胞培养基被用于培养原核细胞。
[0147]
本发明还涉及适用于涂敷到伤口并且包含本发明的肽或组合物的石膏、绷带或敷料。
[0148]
本发明还涉及一种包含本发明的生长促进肽的可食产品。优选地，可食产品是人造的。
[0149]
本发明还涉及一种包含本发明的肽的组合物的可食产品。优选地，可食产品是人造的。
[0150]
优选地，可食产品是用于人类或动物(哺乳动物)或细胞消费的食品。
[0151]
在一个实施方案中，人造可食产品是饮料。在一个实施方案中，人造可食产品是烘焙食品。在一个实施方案中，人造可食产品是乳制品。在一个实施方案中，人造可食产品是
零食产品。在一个实施方案中，人造可食产品是烘焙挤压食品。在一个实施方案中，人造可食产品是奶粉。在一个实施方案中，人造可食产品是婴儿配方奶粉产品。在一个实施方案中，人造可食产品是糖果产品。在一个实施方案中，人造可食产品是酸奶。在一个实施方案中，人造可食产品是酸奶饮料。在一个实施方案中，人造可食产品是冰淇淋产品。在一个实施方案中，人造可食产品是冷冻食品。在一个实施方案中，人造可食产品是早餐谷物。在一个实施方案中，人造可食产品是面包。在一个实施方案中，人造可食产品是风味乳饮料。在一个实施方案中，人造可食产品是糖果点心(confectionary bar)。在一个实施方案中，人造可食产品是茶或茶产品。在一个实施方案中，人造可食产品是基础挤压零食产品。在一个实施方案中，人造可食产品是油炸零食产品。在一个实施方案中，人造可食产品是营养补充剂。在一个实施方案中，人造可食产品是运动营养产品。在一个实施方案中，人造可食产品是婴儿食品。在一个实施方案中，人造可食产品是用于免疫功能低下个体的特制食品。在一个实施方案中，人造可食产品是用于老年病人的食品。
[0152]
本发明还涉及一种用于促进细胞生长的本发明的肽。
[0153]
本发明还涉及一种用于促进细胞培养生长的本发明的肽。
[0154]
本发明还涉及一种用于促进组织生长的本发明的肽。
[0155]
本发明还涉及一种用于促进真皮或上皮组织生长的本发明的肽。
[0156]
本发明还涉及一种用于促进皮肤生长的本发明的肽。
[0157]
本发明还涉及一种用于促进器官的生长的本发明的肽。
[0158]
本发明还涉及一种用于促进生物体生长的本发明的肽。
[0159]
本发明还涉及一种用于促进细胞生长的本发明的组合物。
[0160]
本发明还涉及一种用于促进细胞培养生长的本发明的组合物。
[0161]
本发明还涉及一种用于促进组织生长的本发明的组合物。
[0162]
本发明还涉及一种用于促进上皮组织生长的本发明的组合物。
[0163]
本发明还涉及一种用于促进皮肤生长的本发明的组合物。
[0164]
本发明还涉及一种用于促进器官生长的本发明的组合物。
[0165]
本发明还涉及一种用于促进生物体生长的本发明的组合物。
[0166]
在一个实施方案中，细胞、组织或生物体具有正常的病理(例如，衰老的皮肤)。在本发明的一个实施方案中，细胞、组织或皮肤具有异常的病理(例如，由于创伤、药物使用而损伤的组织，或由于炎性病症而损伤的肠胃道中的上皮组织)。
[0167]
生长促进用途可以是体内或体外用途。生长促进用途可以包括对哺乳动物外部(即，皮肤)或内部(即，胃肠道)给药。
[0168]
本发明还涉及一种用于减慢或抑制人类皮肤衰老的本发明的肽。
[0169]
本发明还涉及一种减缓或抑制人类皮肤衰老的方法，其包括将本发明的肽施用于人类皮肤的步骤。通常地，将本发明的肽局部施用于皮肤。可以通过石膏或贴剂或适合于局部施用的制剂施用。
[0170]
本发明还涉及一种用于减慢或抑制人类皮肤衰老的本发明的组合物。本发明还涉及一种用于预防或减慢人类皮肤衰老的本发明的肽。
[0171]
本发明还涉及一种减缓或抑制人类皮肤衰老的方法，其包括将本发明的组合物施用于人类皮肤的步骤。通常地，将本发明的组合物局部施用于皮肤。
[0172]
本发明还涉及一种用于治疗哺乳动物的伤口的本发明的肽。
[0173]
本发明还涉及一种用于治疗哺乳动物的伤口的本发明的肽的组合物。
[0174]
本发明还涉及一种用于治疗哺乳动物的伤口的本发明的伤口处理组合物或产品。
[0175]
本发明还涉及用于治疗或预防特征在于损伤的上皮细胞或组织的疾病或病况的本发明的肽。
[0176]
本发明还涉及用于治疗或预防特征在于损伤的真皮或上皮细胞或组织的疾病或病况的本发明的肽的组合物。
[0177]
在一个实施方案中，特征在于受损的真皮或上皮细胞或组织的疾病或病况选自癌症、创伤。
[0178]
本发明还涉及一种用于维持或恢复哺乳动物的肠道健康的本发明的肽。
[0179]
本发明还涉及一种用于维持或恢复哺乳动物的肠道健康的本发明的肽的组合物。
[0180]
本发明还涉及一种用于维持或恢复哺乳动物的肌肉健康(例如，瘦肉组织克数)的本发明的肽。
[0181]
本发明还涉及一种用于维持或恢复哺乳动物的肌肉健康(例如，瘦肉组织克数)的本发明的肽的组合物。
[0182]
本发明还涉及一种药物组合物，其包含本发明的肽与药学上可接受的载体结合。
[0183]
本发明还涉及一种药物组合物，其包含本发明的肽的组合物与药学上可接受的载体结合。
[0184]
本发明还涉及一种用于治疗或预防哺乳动物的炎性疾病的本发明的肽。
[0185]
本发明还涉及一种用于治疗或预防哺乳动物的炎性疾病的本发明的组合物。
[0186]
本发明还涉及一种可食产品，例如包含本发明的肽或组合物的食品，例如乳制品或非乳制品、固体食品或饮料、食品添加剂或补充剂。乳制品可以是牛奶、奶酪或酸奶。在一个实施方案中，食品是零食点心。食品可以包含任何量的本发明组合物，例如从0.1％至30％(w/w)。
[0187]
本发明的肽以美容或药学上有效的浓度用于本发明的局部用化妆品或药物组合物以达到期望的效果；在关于组合物的总重量的优选形式中，为0.00000001％(以重量计)至20％(以重量计)；优选为0.000001％(以重量计)至15％(以重量计)，更优选为0.0001％(以重量计)至10％(以重量计)，且甚至更优选为0.0001％(以重量计)至5％(以重量计)。理想地，优选为占组合物的约0.00001％w/w至约0.5％w/w[0.1至5000ppm]，且更优选为占组合物的0.00005w/w至约0.05w/w[0.5至500ppm]，且最优选为占组合物的约0.0001w/w至约0.01w/w[1至100ppm]使用本发明的肽。理想地，优选以占组合物的约0.0001％w/w至约0.004％w/w使用本发明的肽。
[0188]
对于本发明的肽的组合物，通常的每日剂量可以是0.2g至100g。然而，当作为特殊医疗用途的食品或医疗食品施用时，每日剂量可以是每天50
‑
500g。
[0189]
用于食品和食品补充剂(即，可食组合物)的本发明的组合物的剂量将广泛地在0.2
‑
100克/天的范围内。在一个实施方案中，每日剂量为1
‑
10克/天，理想地为约3
‑
8克/天。在一个实施方案中，每日剂量为10
‑
20克/天。在一个实施方案中，每日剂量为20
‑
30克/天。在一个实施方案中，每日剂量为30
‑
40克/天。在一个实施方案中，每日剂量为10
‑
100克/天。在一个实施方案中，每日剂量为约5克/天，理想地为约3
‑
8克/天。在一个实施方案中，剂量
为2
‑
1000毫克/天/千克体重。在一个实施方案中，剂量为10
‑
500毫克/天/千克体重。在一个实施方案中，剂量为10
‑
100毫克/天/千克体重。在一个实施方案中，剂量为30
‑
70毫克/天/千克体重。用于食品补充剂的本发明的肽的剂量可以是每天0.00001mg
‑
0.01mg或剂量。
[0190]
食品可以是用于特定医疗用途的食品(fsmp)，其被定义为特殊配制、加工并旨在对在医疗监督下接受治疗的个体的疾病、病症或医疗状况进行饮食管理的食品。这些食品旨在用于普通食品无法满足其营养需求的人群的全部或部分食物。
[0191]
本发明还涉及一种包含本发明的肽的人造个人护理组合物。
[0192]
本发明还涉及一种包含本发明的肽的组合物的人造个人护理组合物。
[0193]
在一个实施方案中，个人护理组合物是护肤产品。在一个实施方案中，个人护理组合物是配制用于局部应用于人类皮肤的产品。在一个实施方案中，个人护理组合物是抗衰老产品。在一个实施方案中，个人护理组合物是牙膏产品。在一个实施方案中，个人护理组合物是香料产品。在一个实施方案中，个人护理组合物是除臭产品。在一个实施方案中，个人护理组合物是止汗剂产品。在一个实施方案中，个人护理组合物是肥皂。在一个实施方案中，个人护理组合物是液体肥皂。在一个实施方案中，个人护理组合物是乳膏。在一个实施方案中，个人护理组合物是洗剂(lotion)。在一个实施方案中，个人护理组合物是凝胶。在一个实施方案中，个人护理组合物是粉末。
[0194]
本发明还涉及一种包含本发明的肽的人造伤口处理组合物。本发明还涉及一种包含本发明的组合物的人造伤口处理组合物。通常地，配制伤口处理组合物用于局部施用于伤口。在一个实施方案中，组合物包含乳膏剂、凝胶剂、洗剂、粉末剂。
[0195]
本发明还提供了包含本发明的肽的局部组合物。应该理解，局部组合物可以包含多种肽、片段和/或变体。在一个实施方案中，局部组合物基本上包含所有的肽。在一个实施方案中，局部组合物基本上包含所有的变体。本发明的局部组合物可以存在于制剂中，所述制剂选自包括乳膏、复合乳剂、无水组合物、水分散液、油、乳、香膏、泡沫、洗剂、凝胶、凝乳、水醇溶液、水乙醇酸溶液、化妆品、个人护理产品、水凝胶、搽剂、浆液(sera)、肥皂、扑粉、糊剂、半固体制剂、搽剂、清液、洗发水、护发素、软膏、任何冲洗剂、滑石、摩丝、粉末剂、喷雾剂、气雾剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂、酏剂(elixirs)、多糖膜、贴剂、凝胶贴剂、绷带、粘合剂体系、油包水乳剂、水包油乳剂和硅酮乳剂的组。
[0196]
在本发明的一个实施方案中，乳剂含有脂质或油。乳剂可以是但不限于水包油、油包水、水包油包水(water
‑
in
‑
oil
‑
in
‑
water)和硅酮包水包油乳液(oil
‑
in
‑
water
‑
in
‑
silcone)乳剂。乳剂可以含有保湿剂。乳剂可以含有消泡剂如硅酮。乳剂可以具有任何合适的粘度。乳剂还可含有乳化剂和/或消泡剂。制备乳剂的方法是本领域技术人员已知的。
[0197]
可将本发明的局部组合物掺入用于给药的医疗器械中。这种器械可以包括但不限于织物、贴片、绷带、计量器、袜子、紧身衣、内衣、敷料、手套、面罩、粘合贴剂、非粘合贴剂、闭塞贴剂和微电贴剂或合适的粘合体系。在这样的实施方案中，器械与角质层(如皮肤)直接接触，从而释放本发明的肽。应该理解，局部组合物可以以本文详述的任何合适的形式掺入。例如，本发明的局部组合物或肽可以掺入到装置中或存在于装置表面上或者可以是乳膏剂、凝胶剂或蜡制剂或本文定义的并且掺入到装置中或装置的表面上的任何合适的制剂。器械可以适合于粘附或附着到皮肤上。
[0198]
在一个实施方案中，器械适于释放恒定量的本发明的组合物或肽。应当理解，缓释
系统中所含的组合物的量取决于，例如组合物将在何处施用，本发明组合物的释放的动力学和持续时间，以及待治疗和/或待护理的病况、病症和/或疾病的性质。器械可以使得组合物由于身体水分、皮肤的ph或体温而通过器械的生物降解或者通过器械与身体之间的摩擦被释放。
[0199]
在本发明的一个实施方案中，局部组合物还可包含至少一种美容或药学上可接受的赋形剂。赋形剂可以与功能成分或添加剂互换使用。应该理解，虽然本发明的局部组合物可以单独施用，但它们通常与美容或药物赋形剂混合施用。美容或药学上可接受的赋形剂是本领域公知的，并且是可以使用的任何已知的赋形剂，只要其适合于局部施用并且是皮肤病学可接受的而没有异常毒性、不相容性和/或过敏反应。
[0200]
优选地，包含的任何赋形剂以痕量存在。包含的赋形剂的量将取决于许多因素，包括所用的赋形剂的类型、赋形剂的性质、局部组合物的成分、局部组合物中的活性成分或肽的量和/或局部组合物的预期用途。任何赋形剂的性质和量不应不可接受地改变本发明的肽的益处。
[0201]
在本发明的一个实施方案中，赋形剂可以是合适的稀释剂、载体、粘合剂、润滑剂、悬浮剂、包衣剂、防腐剂、稳定剂、染料、载体、增溶剂、碱、润肤剂、乳化剂、香料、保湿剂和/或表面活性剂。
[0202]
合适的稀释剂的实例包括但不限于us2014120131或us2004132667中公开的任何稀释剂。实例包括乙醇、甘油和水。
[0203]
合适的载体的实例包括但不限于乳糖、淀粉、葡萄糖、甲基纤维素、硬脂酸镁、甘露醇、山梨醇和us2014120131或us2004132667中公开的任何合适的载体。
[0204]
合适的粘合剂的实例包括但不限于淀粉、明胶、天然糖如葡萄糖、无水乳糖、自由流动乳糖、β
‑
乳糖、玉米甜味剂、天然和合成树胶如阿拉伯胶、黄蓍胶或海藻酸钠、羧甲基纤维素和聚乙二醇以及us2014120131或us2004132667中公开的任何合适的粘合剂。
[0205]
合适的润滑剂的实例包括但不限于油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠和氯化钠以及us2014120131或us2004132667中公开的任何合适的润滑剂。
[0206]
载体可以是本领域已知的或在us2014120131或us2004132667中公开的任何合适的载体。在一些实施方案中，载体可以包括但不限于液体，如水、油或表面活性剂，包括来源于石油、动物、植物或合成的那些，聚合物、油(如花生油、矿物油、蓖麻油、大豆油)、醇、聚山梨醇酯、脱水山梨醇酯、醚硫酸盐(ether sulfates)、硫酸盐，甜菜碱、糖苷、麦芽糖苷(maltosides)、脂肪醇、壬苯醇醚、泊洛沙姆、聚氧乙烯、聚乙二醇、右旋糖、甘油或洋地黄皂苷。应该理解，载体将是皮肤病学可接受的。优选的载体含有乳剂，例如水包油、油包水、水包油包水和硅酮包水包油乳剂。乳剂还可含有乳化剂和/或消泡剂。
[0207]
在本发明的一个实施方案中，局部组合物还可包含一种或多种附加成分。本发明的局部组合物可与一种或多种其它附加试剂连续地、同时地或相继地施用。这种附加成分可以是包含在局部组合物中有益处，或者取决于局部组合物的预期用途有益处的那些。附加成分可以是活性的或功能性的或兼具活性和功能性。
[0208]
这种附加成分的实例包括但不限于清洁剂、调节剂、防晒剂、色素(pigment)、保湿剂、增稠剂、胶凝剂、精油、收敛剂、颜料(pigments)、抗凝剂、消泡剂、粘合剂、添加剂、缓冲剂、螯合剂(chelating agents)、外用止痛剂、成膜剂或材料、填充剂、聚合物、乳浊剂、ph调
节剂、推进剂、还原剂、螯合剂(sequestrants)、皮肤增白剂和提亮剂、皮肤调理剂、芦荟、康复剂、舒缓剂、滑爽剂、泛酸、处理剂、增稠剂、维生素、着色剂、药物、防腐剂、消泡剂、缓冲剂、收敛剂、聚合物、ph调节剂、除臭剂或任何其它皮肤病学可接受的载体或表面活性剂中的一种或多种。
[0209]
应该理解，列出的附加成分可以提供不只一种益处。本文给出的分类仅仅是为了清楚和方便，并非旨在将附加成分局限于列出的特定应用或类别。
[0210]
任何附加成分应该适合施用于皮肤而没有异常毒性、不相容性和/或过敏反应。
[0211]
在一些实施方案中，附加成分具有葡萄糖转运活性或者有助于葡萄糖转运活性。在一些实施方案中，附加成分具有抗炎活性或有助于抗炎活性。在一些实施方案中，附加成分具有抗老化活性或有助于抗老化活性。在一些实施方案中，附加成分用于角质层健康和/或发育、皮肤健康和/或发育，和/或肌肉健康、恢复和/或发育。活性剂可以是药理学增强剂。这种活性剂是已知的并且在市场上可得到。在这种情况下，本发明的局部组合物可与一种或多种其它活性剂连续地、同时地或相继地施用。
[0212]
在一些实施方案中，附加成分可以是法尼醇([2e,6e],
‑
3,7,11,
‑
三甲基
‑
2,6,10,十二碳三烯
‑1‑
醇)(farnesol([2e,6e],
‑
3,7,11,
‑
trimethyl
‑
2,6,10,dodecatrien
‑1‑
ol))、植烷三醇(3,7,11,15,四甲基十六烷
‑
1,2,3,
‑
三醇)(phytantriol(3,7,11,15,tetramethylhexadecane
‑
1,2,3,
‑
triol))、脱屑活性物、酶、酶抑制剂、酶激活剂、植物源提取物和海洋提取物、抗痤疮活性物、抗皱纹或抗萎缩活性物、抗氧化剂/自由基清除剂、螯合剂、类黄酮、抗炎剂、消脂剂、局部麻醉剂、晒黑活性物(tanning actives)、皮肤提亮剂、皮肤修复剂、甜没药醇、抗微生物或抗真菌活性物、防晒活性物、颗粒物质、调理剂、结构化剂、增稠剂。
[0213]
脱屑活性物可以是增强皮肤外观或皮肤纹理的任何合适的试剂，并且如us2014120131或us2004132667中所公开的。
[0214]
抗痤疮活性物的实例如us2014120131或us2004132667中所公开的，并包括间苯二酚、水杨酸、红霉素、锌、硫、过氧化苯甲酰。
[0215]
增稠剂的实例如us2014120131或us2004132667中所公开的，并且包括羧酸聚合物、交联聚丙烯酸酯聚合物、聚丙烯酰胺聚合物、多糖。
[0216]
调理剂的实例如us2014120131或us2004132667中所公开的，并且包括保湿剂、润肤剂或皮肤调理剂。
[0217]
结构化剂的实例如us2014120131或us2004132667中所公开的，并包括为组合物提供流变特性并有助于组合物的稳定性的任何试剂。
[0218]
可以使用任何合适的抗微生物或抗真菌活性物，并且实例如us2014120131或us2004132667中所公开的。这些活性物能够破坏微生物，防止微生物的生长或作用。实例包括但不限于β
‑
内酰胺药物、喹诺酮药物、四环素、红霉素、硫酸链霉素、水杨酸、过氧化苯甲酰。
[0219]
颗粒材料的实例包括金属氧化物。消脂剂的实例包括黄嘌呤剂。晒黑活性物的实例包括1,3
‑
二羟基
‑2‑
丙酮和us2014120131或us2004132667中公开的那些。局部麻醉剂的实例包括苯佐卡因、利多卡因和布比卡因以及us2014120131或us2004132667中公开的那些。
[0220]
皮肤提亮剂的实例包括本领域已知的任何试剂，如曲酸、抗坏血酸和us2014120131或us2004132667中公开的那些。
[0221]
防晒活性物的实例包括任何合适的有机或无机防晒活性物。实例包括金属氧化物、2
‑
乙基己基
‑
对甲氧基肉桂酸酯和us2014120131或us2004132667中公开的那些。
[0222]
皮肤修复剂的实例包括如us2014120131或us2004132667中公开的泛酸。
[0223]
抗炎剂的实例包括增强皮肤外观、肤色或颜色的任何试剂，包括但不限于皮质类固醇、氢化可的松，非甾体剂，如布洛芬和阿司匹林，以及us2014120131或us2004132667中公开的那些。
[0224]
类黄酮的实例包括黄烷酮、甲氧基黄酮、未取代的查耳酮及其混合物以及us2014120131或us2004132667中公开的那些。
[0225]
酶的实例包括脂肪酶、蛋白酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、淀粉酶、过氧化物酶、葡糖醛酸糖苷酶、神经酰胺酶、透明质酸酶。酶抑制剂的实例包括胰蛋白酶抑制剂、鲍曼比尔克抑制剂(bowmann birk inhibitors)、糜蛋白酶抑制剂、植物提取物、类黄酮、槲皮素查耳酮以及us2014120131或us2004132667中公开的那些及其混合物。酶激活剂的实例包括辅酶a、q10(泛醌)、甘草甜素、小檗碱、白杨素和us2014120131或us2004132667中公开的那些及其混合物。
[0226]
抗皱纹或抗萎缩活性物的实例包括含硫的d和l氨基酸，特别是n
‑
酰基衍生物，如n
‑
乙酰基
‑
l
‑
半胱氨酸、羟基酸、植酸、硫辛酸、溶血磷脂酸、皮肤剥离剂、维生素b3、类维生素a和us2014120131或us2004132667中公开的那些及其混合物。
[0227]
抗氧化剂/自由基清除剂可以是可用于提供防紫外线辐射或其它可能引起皮肤损伤的环境试剂的任何试剂，例如us2014120131或us2004132667中公开的那些。抗氧化剂/自由基清除剂的实例包括抗坏血酸，其盐和衍生物(维生素c)、生育酚及其盐和衍生物(维生素e)、丁基化羟基苯甲酸及其盐、过氧化物、没食子酸和烷基酯、山梨酸、硫辛酸、胺、氧脯氨酸甜菜碱(lycine pidolate)、精氨酸氧脯氨酸(arginine pilolate)、去甲二氢愈创木酸、生物类黄酮、姜黄素、赖氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、超氧化物歧化酶、水飞蓟素、茶提取物及其混合物。
[0228]
螯合剂的实例包括edta、nta、异羟肟酸(hydoxamic acid)、植酸、乳铁蛋白和us2014120131或us2004132667中公开的那些及其混合物。螯合剂是指能够通过形成配合物来去除金属离子使得金属离子不能参与化学反应或催化化学反应的试剂。螯合剂可用于防止紫外线辐射或可能导致皮肤损伤的其它环境因素。
[0229]
应该理解，可以添加多种附加成分。附加成分的量可为组合物的重量的约0.001至约50％，优选为约0.01％至约20％，优选为约0.1％至约10％，约0.5％至约10％，约1％至约5％，优选为组合物的重量的2％。包含的附加成分的量将取决于许多因素，包括所用的附加成分的类型、附加成分的性质、局部组合物的成分、局部组合物中的活性物或肽的量和/或局部组合物的预期用途。任何附加成分的性质和量不应不可接受地改变本发明的肽的益处。
[0230]
局部组合物可以是不含醇的。
[0231]
在本发明的一些实施方案中，除了本发明的肽(还称为组合物的活性物)之外，组合物还包含一种或多种附加活性剂。此外或可备选地，组合物可以与一种或多种其它附加
活性剂一起施用。通常所述附加活性剂仅以痕量存在。在一些实施方案中，组合物中可能不存在附加活性剂。包含的附加活性剂的量将取决于许多因素，包括所用的附加活性剂的类型、附加活性剂的性质、局部组合物的成分、局部组合物中的活性物或肽的量和/或局部组合物的预期用途。任何附加活性剂的性质和量不应不可接受地改变本发明的肽的益处。
[0232]
应该理解，在一种产品中被认为是“活性”成分的成分可能是另一种中的“功能”或“赋形剂”成分，且反之亦然。还应理解的是，一些成分发挥活性成分和功能成分或赋形剂成分的双重作用。
[0233]
附加活性剂的实例包括葡萄糖转运促进药物、皮肤补充剂、皮肤治疗和/或护理剂、抗炎剂、抗老化剂、细胞生长促进剂和药理学增强剂。这种试剂是本领域熟知的，并且可以理解，可以使用任何合适的附加活性剂。用于治疗和/或护理皮肤的附加活性剂可包括胶原蛋白合成剂、类维生素a、去角质剂、消脂剂、弹性蛋白酶抑制剂、黑素合成刺激或抑制剂、仿晒剂(self
‑
tanning agents)、抗衰老剂、抗微生物剂、抗真菌剂、抑真菌剂、杀菌剂和修复剂。活性剂还包括抗炎剂。
[0234]
任何附加活性剂应该适合施用于皮肤而没有异常毒性、不相容性和/或过敏反应。
[0235]
应当理解，本文给出的分类仅仅是为了清楚和方便，并非旨在将附加成分、赋形剂或活性物局限于列出的特定应用或类别。
[0236]
在特别优选的实施方案中，本发明的方法和用途包括将本发明的肽或组合物与一种或多种其它活性剂(例如，市场上可获得的现有生长促进药或药理学增强剂)组合施用。在这种情况下，本发明的组合物可与一种或多种其它活性剂连续地、同时地或相继地施用。
[0237]
本发明的效果通过将本文所述的本发明的局部组合物的局部应用或施用至需要治疗或护理的人、动物或患者来实现。局部递送优选意指递送至角质层，如皮肤、毛发和/或指甲，但还可以意指递送至衬有上皮细胞的体腔，例如肺或气道、胃肠道、颊腔。效果可以局限于皮肤表面或可以在皮肤内或皮肤表面和皮肤内均可。
[0238]
以美容或药学上有效的量施用本发明的局部组合物。换言之，以无毒但足以提供期望效果的量。应该理解，本领域技术人员将能够确定施用本发明的局部组合物的合适剂量，而无需过多的实验。可选地，医师将根据待治疗或护理的特定病况、疾病或病症以及个体的年龄、体重和/或健康状况来确定最适合于患者的实际剂量。这将取决于多种因素，包括所采用的具体化合物的活性、该化合物的代谢稳定性和作用时间、年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、施用方式和时间、排泄速率、药物组合、特定病况的严重程度以及正在接受治疗的个体。当然可以存在个别情况(其中更高或更低的剂量范围是合适的)，并且这些也在本发明的范围之内。例如，可以0.01至50mg/kg体重，例如0.1至30mg/kg，更优选为0.1至20mg/kg体重，更优选为0.1至10mg/kg体重，优选为0.1至5mg/kg体重的剂量施用组合物。在一个示例性实施方案中，10至300毫克/天，或更优选为10至150毫克/天的一个或多个剂量将施用给患者。用量和频率最适合于目的。根据每个受试者的需要，应用或施用的频率可以变化很大，并且推荐的应用或施用范围从每月一次到每天十次，优选为每周一次到每天四次，更优选为从每周三次到每天三次，甚至更优选为每天一次或两次。
[0239]
在优选的实施方案中，提供了局部组合物的重复使用。
[0240]
可通过但不限于摩擦或按摩到待治疗或护理的角质组织、皮肤或身体区域中以施用局部组合物。在一些实施方案中，组合物留在身体的区域上或不从身体的区域去除。在其
它实施方案中，在一段时间之后，例如但不限于约2分钟至60分钟、约5分钟至约30分钟，优选为约10分钟至约20分钟之后去除组合物。施用后可立即去除组合物。在本发明的一些实施方案中，本发明的组合物可以通过使本发明的组合物和/或肽获得更大渗透的手段而施用于待治疗的区域，例如但不限于离子电渗疗法、超声电泳、电穿孔、微电贴片、机械压力、渗透压梯度、闭塞性固化、借助于压力的微注射或无针注射，诸如通过氧压注射，或其任何组合。
[0241]
本发明的肽以美容或药学上有效的浓度用于本发明的局部用化妆品或药物组合物以达到期望的效果；在关于组合物的总重量的优选形式中，为0.00000001％(以重量计)至20％(以重量计)；优选为0.000001％(以重量计)至15％(以重量计)，更优选为0.0001％(以重量计)至10％(以重量计)，且甚至更优选为0.0001％(以重量计)至5％(以重量计)。
[0242]
在本发明的一些实施方案中，组合物可以经由脂质体、混合脂质体、油质体、泡囊(niosomes)、醇质体、微胶囊、胶囊、大胶囊、纳米胶囊、纳米结构化脂质载体、海绵、环糊精、囊泡、胶束、表面活性剂的混合胶束、表面活性剂
‑
磷脂混合胶束、微球、球、脂质球、颗粒、纳米球、纳米颗粒、微粒、固体纳米颗粒以及微乳液(包括具有反胶束的内部结构的油包水微乳液和纳米乳液微球、微颗粒)中的任一种递送。
[0243]
多种方法可用于制备脂质体。参见例如，szoka等人，ann.rev.biophys.bioeng.9:467(1980)，美国专利号4,186,183、4,217,344、4,235,871、4,261,975、4,485,054、4,501,728、4,774,085、4,837,028、4,235,871、4,261,975、4,485,054、4,501,728、4,774,085、4,837,028、4,946,787、pct公开号wo 91/17424，deamer&bangham、biochim.biophys.acta 443:629
‑
634(1976)；fraley等人，pnas 76:3348
‑
3352(1979)；hope等人，biochim.biophys.acta 812:55
‑
65(1985)；mayer等人，biochim.biophys.acta 858:161
‑
168(1986)；williams等人，pnas 85:242
‑
246(1988)；liposomes(ostro(编辑),1983,第1章)；hope等人，chem.phys.lip.40:89(1986)；gregoriadis,liposome technology(1984)and lasic,liposomes:from physics to applications(1993))。合适的方法包括例如，超声处理、挤出、高压/均质化、微流化、洗涤剂透析、钙诱导的小脂质体载体的融合和醚融合方法，所有这些都是本领域熟知的。
[0244]
这些递送系统可以适合于实现本发明的化合物和/或肽的更大渗透。这可以改善药代动力学和药效学性质。递送系统可以是缓释系统，其中本发明的化合物或肽在一段时间内逐渐释放并且优选地在一段时间内具有恒定的释放速率。通过本领域已知的方法制备递送系统。包含在缓释系统中的肽的量将取决于组合物将被递送到何处和释放的持续时间以及待治疗或护理的病况、疾病和/或病症的类型。
[0245]
本发明的局部组合物可以用于人类或兽医学用途的人类或动物。
[0246]
本发明的局部组合物可以用于药物、个人护理和/或美容用途。
[0247]
组合物可用于治疗或护理皮肤的任何疾病、病症或病况，包括但不限于银屑病、皮炎、过敏性皮炎、湿疹、海绵层水肿、水肿、皮肤癌、溃疡、痤疮、疤痕、蜂窝织炎、弹性组织变性、角化病、红斑痤疮、静脉曲张、炎性疾病。
[0248]
局部组合物可用于治疗或护理可见的老化迹象，包括但不限于皱纹、妊娠纹和黑眼圈、干燥、细纹、老年斑、红斑、皮肤下垂以及由日晒(包括晒伤)、压力、污染和/饮食引起的病况。局部组合物也可以用于延缓、减缓或抑制皮肤或老化的发生。可通过医疗器械，如
本文所述的石膏或贴剂施用组合物。
[0249]
局部组合物可用于治疗或护理哺乳动物的伤口。在另一个实施方案中，局部组合物用于治疗或预防特征在于受损的上皮细胞或组织，和/或受损的真皮或上皮细胞或组织的疾病或病况。疾病可以是但不限于癌症和创伤。
[0250]
局部组合物可用于治疗或护理任何肌肉病况、改善哺乳动物的肌肉状态、通常在锻炼之后促进肌肉的恢复、维持或恢复哺乳动物的肌肉健康(例如，瘦肉组织克数)、增强身体活动能力、治疗或预防特征在于嗜睡或低能量的疾病或病况。
[0251]
局部组合物可用于促进组织生长、促进上皮组织生长、促进皮肤生长、促进器官生长、促进生物体生长。皮肤可以具有正常病理和/或异常病理。
[0252]
局部组合物也可以用于治疗或护理任何炎性病症。
[0253]
本发明的其它方面涉及一种药物组合物，其包含与一种或多种的药学上可接受的稀释剂、赋形剂或载体混合的本发明的肽或本发明的肽的组合物。尽管本发明的肽和组合物可以单独施用，但它们通常与药物载体、赋形剂或稀释剂混合施用，特别是针对人类治疗。药物组合物可以用于人类或兽医学用途的人类或动物。用于本文所述的各种不同形式的药物组合物的这种合适的赋形剂的实例可在“由a wade和pj weller编的药用赋形剂，第2版，(1994)(handbook of pharmaceutical excipients,2
nd edition,(1994))”中获悉。特别地，用于局部递送的制剂在由david osborne和antonio aman,taylor&francis编的局部药物递送制剂(topical drug delivery formulations)中进行了描述，其全部内容通过引用并入本文。用于治疗用途的可接受的载体或稀释剂在制药领域中是熟知的，并且在例如，雷明顿的药物科学，马克出版社(a.r.gennaro编辑，1985)(remington’s pharmaceutical sciences,mack publishing co.(a.r.gennaro edit.1985))中进行了描述。合适的载体的实例包括乳糖、淀粉、葡萄糖、甲基纤维素、硬脂酸镁、甘露醇、山梨醇等。合适的稀释剂的实例包括乙醇、甘油和水。药物载体、赋形剂或稀释剂的选择可以根据预期的施用途径和标准药学实践进行选择。药物组合物可以包含，例如或除载体、赋形剂或稀释剂之外的任何合适的粘合剂、润滑剂、悬浮剂、包衣剂、增溶剂。合适的粘合剂的实例包括淀粉、明胶、天然糖(如葡萄糖、无水乳糖、自由流动乳糖、β
‑
乳糖、玉米甜味剂)、天然和合成树胶(如阿拉伯胶)、黄蓍胶或海藻酸钠、羧甲基纤维素和聚乙二醇。合适的润滑剂的实例包括油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠等。
[0254]
可以在药物组合物中提供防腐剂、稳定剂、染料和甚至调味剂。防腐剂的实例包括苯甲酸钠、山梨酸和对羟基苯甲酸的酯。还可以使用抗氧化剂和悬浮剂。
[0255]
本发明的肽或组合物可适用于局部、口服、直肠、肠胃外、肌内、腹膜内、动脉内、支气管内、皮下、皮内、静脉内、鼻、阴道、颊或舌下施用途径。对于口服施用，特别使用压缩片剂、丸剂、片剂、凝胶剂、滴剂和胶囊剂。优选地，这些组合物每剂含有1
‑
250mg，且更优选为10
‑
100mg的活性成分。其它施用形式包括可静脉内、动脉内、皮下、皮内、腹膜内或肌内注射的溶液剂或乳剂，并且该溶液剂或乳剂由无菌或可灭菌的溶液制备。本发明的药物组合物也可以是栓剂、阴道环、子宫托、悬浮剂、乳剂、洗剂、软膏剂、乳膏剂、凝胶剂、喷雾剂、溶液剂或扑粉剂的形式。本发明的组合物可以配制用于局部递送。局部递送通常意指递送至皮肤，但还可以意指递送至衬有上皮细胞的体腔，例如肺或气道、胃肠道、颊腔。特别地，用于局部递送的制剂在由david osborne和antonio aman,taylor&francis编的局部药物递送
制剂(topical drug delivery formulations)中进行了描述，其全部内容通过引用并入本文。用于递送到气道的组合物或制剂在o’riordan等人的(呼吸护理，2002，11月.47)(respir care,2002,nov.47)、ep2050437、wo2005023290、us2010098660和us20070053845中进行了描述。用于将活性剂递送至回肠，特别是近端回肠的组合物和制剂包括微粒和微胶囊，其中活性剂被包封在由聚合物或乳蛋白形成的保护基质内，该保护基质耐酸但易于溶解在回肠的更碱性的环境中。在ep1072600.2和ep13171757.1中描述了这种递送系统的实例。经皮施用的替代方法是通过使用皮肤贴剂。例如，可将活性成分掺入到由聚乙二醇或液体石蜡的含水乳液组成的乳膏中。还可以将活性成分以1至10wt.％的浓度(以重量计)掺入到由白蜡或白软石蜡基质以及可能需要的这种稳定剂和防腐剂组成的软膏剂中。
[0256]
可注射形式每剂可包含10
‑
1000mg，优选为10
‑
250mg的活性成分。
[0257]
可以以单位剂型形式，即以含有单位剂量或多个或亚单位的单位剂量的离散部分(discrete portions)的形式配制组合物。
[0258]
本领域普通技术人员可以容易地确定待施用给受试者的本发明组合物之一的合适剂量，而无需过多的实验。通常，医师将确定最适合于个体患者的实际剂量，并且这将取决于多种因素，包括所使用的具体化合物的活性、该化合物的代谢稳定性和作用时间、年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、施用方式和时间、排泄率、药物组合，特定病况的严重程度以及正在接受治疗的个体。本文公开的剂量是平均案例的示例。当然可以有个别情况(其中更高或更低的剂量范围是合适的)，并且这些也在本发明的范围之内。根据需要，可以0.01至30mg/kg体重，例如0.1至10mg/kg，更优选为0.1至1mg/kg体重的剂量施用药剂。在一个示例性实施方案中，为了治疗炎性疾病，10至300毫克/天，或更优选为10至150毫克/天的一个或多个剂量将施用给患者。
[0259]
在特别优选的实施方案中，本发明的方法和用途包括将本发明的肽或组合物与一种或多种其它活性剂(例如，市场上可获得的现有抗炎药或药理学增强剂)组合施用。在这种情况下，本发明的组合物可与一种或多种其它活性剂连续地、同时地或相继地施用。
[0260]
在本发明的一个实施方案中，可以以包含所述肽的缀合物的形式施用本发明的肽，并且本发明的肽可以任选地包含连接肽(linker)和配偶体分子，例如蛋白质，如旨在增加体内缀合物的半衰期的抗体分子。在一个实施方案中，所述肽可被修饰以采用用于连接配偶体分子的氨基酸替换一个或多个氨基酸。例如，为了缀合配偶体分子，如peg分子，可以用赖氨酸残基替换氨基酸。
[0261]
定义
[0262]
为了所有目的，本文提到的所有出版物、专利、专利申请和其它参考文献都通过引用全部并入本文，如同每个单独的出版物、专利或专利申请都被具体和单独地指示以通过引用并入并且其内容被完整引用一样。
[0263]
在本文中使用的情况下，除非另外明确指出，否则以下术语除了该术语在本领域可能具有的任何更宽(或更窄)的含义之外，还旨在具有以下含义：
[0264]
除非上下文另有要求，否则在本文单数的使用应理解为包括复数，且反之亦然。关于实体使用的术语“一(a)”或“一(an)”应被理解为是指一个或多个该实体。因此，术语“一(a)”(或“一(an)”)、“一个或多个(one or more)”和“至少一个(at least one)”在本文中可互换使用。
[0265]
如本文所用，术语“包括(comprise)”或其变型，如“包括(comprises)”或“包括(comprising)”应被理解为指示包括任何所述整体(例如，特征、要素、特性、性质、方法/过程步骤或限制)或整体组(例如，特征、要素、特性、性质、方法/过程步骤或限制)，但不排除任何其它整体或整体组。因此，如本文所用，术语“包括(comprising)”是包含性的或开放性的，并且不排除另外的未提及的整体或方法/过程步骤。
[0266]
如本文所用，术语“疾病”用于定义损害生理功能并与特定症状相关的任何异常病况。该术语广泛地用于涵盖其中不考虑病因的性质(或实际上是否确定疾病的病因学基础)而生理功能受损的任何病症、病患(illness)、异常、病理、生病(sickness)、病况或综合征。因此，它涵盖了由感染、创伤、损伤、手术、放射消融、中毒或营养缺陷引起的病况。
[0267]
如本文所用，术语“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”是指干预(例如，向受试者施用试剂)，其治愈、改善或减轻疾病的症状或消除其病因(或减轻其病因的影响)(例如，减少溶酶体酶的病理水平的积累)。在这种情况下，该术语与术语“治疗(therapy)”同义使用。
[0268]
此外，术语“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”是指干预(例如，向受试者施用试剂)，其预防或延迟疾病的发作或进展，或降低(或根除)其在受治疗人群中的发病率。在这种情况下，术语治疗与术语“预防(prophylaxis)”同义使用。
[0269]
如本文所用，药剂的有效量或治疗有效量定义了可与合理的利益/风险比相称的，可以施用于受试者而没有过度的毒性、刺激性、过敏反应或其它问题或并发症，但足以提供期望的效果，例如治疗或预防表现为受试者病况的永久或暂时改善的用量。用量因受试者不同而变化，其取决于个体的年龄和总体状况、施用方式和其它因素。因此，虽然不可能规定确切的有效量，但本领域技术人员能够使用常规实验和背景常识在任何个别情况下确定适当的“有效”量。在这种情况下的治疗结果包括根除或减轻症状、减轻疼痛或不适、延长存活、改善活动性和临床改善的其它标志。治疗结果不一定是完全治愈。
[0270]
术语“人或动物”应被理解为意指人或哺乳动物或非哺乳动物(如鱼)。
[0271]
术语“组合物”应被理解为意指由人手工制成的而不是天然存在的物质的组合物。示例性组合物包括食物组合物、饮料组合物、药物组合物、营养补充组合物、个人护理组合物和保健组合物。
[0272]
本文使用的术语“肽”是指通常通过肽键连接的由5至50个氨基酸单体组成的聚合物。作为本发明和用于本发明的肽(包括其片段和变体)可全部或部分地通过化学合成或通过从核酸表达来产生。例如，可以根据本领域已知的充分确认的标准液体，或优选为固相肽合成方法容易地制备本发明的肽和用于本发明的肽(参见例如，j.m.stewart和j.d.young，固相肽合成(第2版，皮尔斯化学公司，罗克福德，伊利诺斯州(1994)(j.m.stewart and j.d.young,solid phase peptide synthesis,2nd edition,pierce chemical company,rockford,illinois(1984))；在m.bodanzsky和a.bodanzsky中的肽合成，斯普林格出版社，纽约(1984)(m.bodanzsky and a.bodanzsky,the practice of peptide synthesis,springer verlag,new york(1984)))。必要时，本发明中使用的任何肽可以被化学修饰以增加它们的稳定性。经化学修饰的肽或肽类似物包括肽的任何功能化学等价物，其特征在于相对于本发明的实践其在体内或体外的稳定性和/或功效提高。术语肽类似物还指如本文所述的肽的任何氨基酸衍生物。可通过包括但不限于侧链的修饰，在肽合成过程中掺入
非天然氨基酸和/或其衍生物和使用交联剂以及在肽或其类似物上施加构象约束的其它方法的程序来制备肽类似物。侧链修饰的实例包括氨基的修饰，例如通过与醛反应，随后用nabh4还原进行还原烷基化；用乙酰亚胺酸甲酯(methylacetimidate)进行酰胺化；用乙酸酐进行乙酰化；用氰酸酯对氨基进行氨基甲酰化；用2,4,6
‑
三硝基苯磺酸(tnbs)对氨基进行三硝基苄基化(trinitrobenzylation)；用琥珀酸酐和四氢邻苯二甲酸酐对氨基进行烷基化；以及用吡哆醛
‑5’‑
磷酸酯(pyridoxa
‑
5'
‑
phosphate)对赖氨酸进行吡哆醛化(pyridoxylation)，随后用nabh4还原。精氨酸残基的胍基可以通过与试剂如2,3
‑
丁二酮、苯甲酰甲醛和乙二醛形成杂环缩合产物来修饰。羧基可以通过经由o
‑
酰基异脲(o
‑
acylisourea)形成的碳二亚胺活化，然后随后的衍生化(例如至相应的酰胺)来修饰。巯基可以通过，诸如与碘乙酸或碘乙酰胺的羧甲基化；过甲酸氧化成磺基丙氨酸；与其它硫醇化合物形成混合二硫化物；与马来酰亚胺、马来酸酐或其它取代的马来酰亚胺反应；使用4
‑
氯汞苯甲酸、4
‑
氯汞苯磺酸、氯化苯汞、2
‑
氯汞
‑4‑
硝基苯酚和其它汞制剂形成汞衍生物；在碱性ph下用氰酸酯进行氨基甲酰化的方法来修饰。色氨酸残基可通过，例如用n
‑
溴代丁二酰亚胺进行氧化或用2
‑
羟基
‑5‑
硝基苄基溴或磺酰卤对吲哚环进行烷基化来修饰。酪氨酸残基可以通过用四硝基甲烷硝化以形成3
‑
硝基酪氨酸衍生物来修饰。组氨酸残基的咪唑环的修饰可以通过用碘乙酸衍生物的烷基化或用焦碳酸二乙酯进行n
‑
乙酯基化(n
‑
carbethoxylation)来完成。在肽合成期间掺入非天然氨基酸和衍生物的实例包括但不限于使用正亮氨酸、4
‑
氨基丁酸、4
‑
氨基
‑3‑
羟基
‑5‑
苯基戊酸、6
‑
氨基己酸、叔丁基甘氨酸、正缬氨酸、苯基甘氨酸、鸟氨酸、肌氨酸、4
‑
氨基
‑3‑
羟基
‑6‑
甲基庚酸、2
‑
噻吩基丙氨酸和/或氨基酸的d
‑
异构体。肽结构修饰包括产生包含由d
‑
氨基酸编码的反向序列的逆反肽(retro
‑
inverso peptide)。
[0273]
术语“修饰肽”与术语肽的衍生物可互换使用。修饰肽包括已经被一个或多个如本文所定义的基团替换的肽。该修饰可以是任何修饰，其提供具有增加的穿透细胞的能力的本发明的肽和/或组合物。该修饰可以是增加本发明的组合物或肽的半衰期的任何修饰。在一个实施方案中，该基团是保护基团。保护基团可以是n
‑
末端保护基，c
‑
末端保护基或侧链保护基。肽可以具有一个或多个这些保护基团。本领域技术人员知道使氨基酸与这些保护基团反应的合适技术。这些基团可以通过本领域已知的制备方法来添加，例如us2014120141的[0104]至[0107]段中概述的方法。这些基团可以保留在肽上或可能被移除。保护基团可以在合成过程中加入。在本发明的一个实施方案中，肽可以被一基团取代，所述基团选自一个或多个直链或支链、长链或短链、饱和或不饱和的，被羟基、氨基、氨基酰基、硫酸根或硫化物基团取代的、或具有1至29个碳原子的未取代的基团。n
‑
酰基衍生物包括衍生自乙酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、辛酸、棕榈酸、硬脂酸、山嵛酸(behenic acid)、亚油酸、亚麻酸、硫辛酸、油酸、异硬脂酸、反油酸(elaidoic acid)、2
‑
乙基己酸(2
‑
ethylhexaneic acid)、椰子油脂肪酸、牛油脂肪酸、硬化牛油脂肪酸、棕榈仁脂肪酸、羊毛脂脂肪酸或类似的酸。这些可以是取代的或未取代的。当被取代时，它们优选被羟基或含硫基团取代，例如但不限于so3h、sh或s
‑
s。在本发明的一个实施方案中，肽是r1‑
x
‑
r2。r1和/或r2基团分别与肽序列的氨基末端(n
‑
末端)和羧基末端(c
‑
末端)结合。在一个实施方案中，肽是r1‑
x。可选地，肽是x
‑
r2。优选地，r1是h、c1‑4烷基、乙酰基、苯甲酰基或三氟乙酰基；x是本发明的肽；r2是oh或nh2。在一个实施方案中，r1选自由h、非环取代的或未取代的脂肪族基
团、取代的或未取代的脂环族、取代的或未取代的杂环基、取代的或未取代的杂芳基烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的芳烷基、叔丁氧基羰基、9
‑
芴基甲氧基羰基(fmoc)和r5‑
co
‑
形成的基团，其中r5选自由h、非环取代的或未取代的脂肪族基团、取代的或未取代的脂环族、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的芳烷基、取代的或未取代的杂环基，和取代的或未取代的杂芳基烷基组成的组；r2选自由
‑
nr3r4、
‑
or3和
‑
sr3组成的组，其中r3和r4独立地选自由h、非环取代的或未取代的脂肪族基团、取代的或未取代的脂环族、取代的或未取代的杂环基、取代的或未取代的杂芳基烷基、取代的或未取代的芳基，和取代的或未取代的芳烷基组成的组；并且条件是r1和r2不是α
‑
氨基酸。根据另一个优选的实施方案，r2为
‑
nr3r4、
‑
or3或
‑
sr3、其中r3和r4独立地选自由h、取代的或未取代的c1‑
c
24
烷基、取代的或未取代的c2‑
c
24
烯基、叔丁氧基羰基、9
‑
芴基甲氧基羰基(fmoc)、取代的或未取代的c2‑
c
24
炔基、取代的或未取代的c3‑
c
24
环烷基、取代的或未取代的c5‑
c
24
环烯基、取代的或未取代的c8‑
c
24
环炔基、取代的或未取代的c6‑
c
30
芳基、取代的或未取代的c7‑
c
24
芳烷基、3
‑
10元的取代的或未取代的杂环基环，以及2
‑
24个碳原子和1
‑
3原子(除碳之外)，其中烷基链具有1
‑
6个碳原子的取代的或未取代的杂芳基烷基组成的组。任选地，r3和r4可以通过饱和或不饱和的碳
‑
碳键键合，与氮原子形成环。更优选地，r2是
‑
nr3r4或
‑
or3，其中r3和r4独立地选自由h、取代的或未取代的c1‑
c
24
烷基、取代的或未取代的c2‑
c
24
烯基、取代的或未取代的c2‑
c
24
炔基、取代的或未取代的c3‑
c
10
环烷基、取代的或未取代的c6‑
c
15
芳基，和3
‑
10元的取代的或未取代的杂环基、具有3至10元的环和1至6个碳原子的烷基链的取代的或未取代的杂芳基烷基组成的组。更优选地，r3和r4选自由h、甲基、乙基、己基、十二烷基或十六烷基组成的组。甚至更优选地，r3是h，且r4选自由h、甲基、乙基、己基、十二烷基或十六烷基组成的组。根据甚至更优选的实施方案，r2选自
‑
oh和
‑
nh2。
[0274]
根据本发明的另一个实施方案，r1选自由h、乙酰基、月桂酰基、肉豆蔻酰基或棕榈酰基组成的组，且r2为
‑
nr3r4或
‑
or3，其中r3和r4独立地选自h、甲基、乙基、己基、十二烷基和十六烷基，优选地r2是
‑
oh或
‑
nh2。更优选地，r1是乙酰基或棕榈酰基，并且r2是
‑
nh2。在一个优选的实施方案中，酰基与肽的至少一个氨基酸的n
‑
末端键合。在本发明的一个实施方案中，肽被修饰以包含侧链保护基。侧链保护基可以是包含苄基或基于苄基的基团、基于叔丁基的基团、苄氧基
‑
羰基(z)基团和烯丙氧基羰基(allyloxycarbonyl)(烯丙氧基羰基(alloc))保护基中的一种或多种。侧链保护基可以衍生自非手性氨基酸，如非手性甘氨酸。非手性氨基酸的使用有助于稳定所得的肽，并且还有利于本发明的简易合成路线。优选地，肽还包含修饰的c
‑
末端，优选为酰胺化的c
‑
末端。非手性残基可以是α
‑
氨基异丁酸(甲基丙氨酸(methylalaine))。应该理解，所使用的特定侧链保护基将取决于肽的序列和所使用的n
‑
末端保护基的类型。
[0275]“缀合物”：在本发明的一个实施方案中，肽与结合配偶体缀合、连接或融合，例如一种或多种聚乙二醇聚合物或其它化合物，如分子量增加的化合物或亲脂性基团。分子量增加的化合物是将所得缀合物的分子量增加通常为10％至90％，或20％至50％的任何化合物，并且可具有200至20,000，优选为500至10,000的分子量。分子量增加的化合物可以是peg、任何水溶性(两亲性或亲水性)聚合物部分、peg的均聚物或共聚物、peg(mpeg)和聚氧乙烯甘油(pog)的单甲基亚取代的聚合物、聚氨基酸(如聚赖氨酸、聚谷氨酸、聚天冬氨酸)，特别是l构型的那些，药理学无活性的蛋白质(如白蛋白)、明胶、脂肪酸、多糖、脂质氨基酸
和葡聚糖。聚合物部分可以是直链或支链的，并且其可以具有500至40000da、5000至10000da、10000至5000da的分子量。化合物(结合配偶体)可以是任何合适的细胞穿透化合物，如穿膜肽(tat peptide)、穿膜肽(penetratin)、pep
‑
1肽。化合物(结合配偶体)可以是抗体分子。
[0276]
化合物(结合配偶体)可以是亲脂性部分或聚合物部分。亲脂性取代基和聚合物取代基是本领域中已知的。亲脂性取代基包括形成酯、磺酰酯、硫酯、酰胺或磺酰胺的一部分的酰基、磺酰基、n原子、o原子或s原子。亲脂性部分可以包括具有4至30个c原子，优选为8至12个c原子的烃链。它可以是线性的或支链的、饱和的或不饱和的。烃链可被进一步取代。它可以是环烷烃或杂环烷烃。该肽可以在n
‑
末端、c
‑
末端或两者上被修饰。聚合物或化合物(结合配偶体)优选与氨基、羧基或硫基连接，并且可以通过任何氨基酸残基的侧链的n
‑
末端或c
‑
末端连接。聚合物或化合物(结合配偶体)可以与任何合适的残基的侧链缀合。聚合物或化合物(结合配偶体)可以通过间隔物(spacer)缀合。间隔物可以是天然或非天然氨基酸、琥珀酸、赖氨酰、谷氨酰、天门冬氨酰、甘氨酰、β
‑
丙氨酰、γ
‑
氨基丁酰。聚合物或化合物(结合配偶体)可以通过酯、磺酰酯、硫酯、酰胺、氨基甲酸酯、脲、磺酰胺缀合。本领域技术人员知道制备所述缀合物的合适方法。
[0277]“片段”意指选自sequence id no:1至14的蛋白质的片段，该片段的长度通常为7至37个连续的氨基酸并且通常具有
‑
9至 3的电荷；通常不是半胱氨酸(c)或蛋氨酸(m)的c
‑
末端氨基酸，和通常不是半胱氨酸(c)、组氨酸(h)、脯氨酸(p)或苏氨酸(t)的n
‑
末端氨基酸。使用cameselle,j.c.,ribeiro,j.m.和sillero,a.(1986)的方法测定肽、片段或区域的电荷。推导和使用公式来计算酸碱化合物的净电荷。它适用于氨基酸、蛋白质和核苷酸，见生物化学教育，14，131
‑
136(biochem.educ.14,131
‑
136)。
[0278]
应用于肽的术语“天然”意指一种肽，其包括(a)植物蛋白质的片段，通常为大米或豌豆蛋白质、或豌豆蛋白质的变体(包括小扁豆、甜豌豆或鹰嘴豆)，或大米蛋白质的变体(包括燕麦、草、玉米、野生稻和香蕉)，或(b)植物蛋白质的片段的变体，例如植物蛋白质的同源物的片段。本发明的肽或片段可从植物蛋白质分离或使用本领域技术人员已知的和本文所述的方法合成制备。
[0279]
应用于片段的“c
‑
末端结构域”意指片段的c
‑
末端处的前三个氨基酸。
[0280]
应用于片段的“n
‑
末端结构域”意指片段的n
‑
末端处的最后三个氨基酸。
[0281]
应用于肽或片段的“生物活性”意指当施用给哺乳动物时具有健康促进作用，例如葡萄糖转运促进、抗细菌、抗炎，或促进细胞生长或增殖中的一种或多种。在一个实施方案中，术语“生物活性”意指细胞生长促进。
[0282]
应用于肽或片段的“生长促进”或“生长促进活性”意指能够增加使用20μm的在以下测定中描述的肽或片段的溶液处理的人类皮肤的弹性蛋白产生或细胞增殖的肽或片段。
[0283]
应用于肽或变体或片段的“葡萄糖转运促进”或“葡萄糖转运促进活性”意指当在以下体外测定中以2μm的浓度使用时，与未处理对照相比，能够增加glut4易位至骨骼肌中的肽、变体或片段。在10％的fbs和2μg/ml的杀稻瘟菌素中生长l6
‑
glut4myc细胞。在24
‑
孔板中在2％的fbs中以每孔15,000个细胞接种之前，将细胞生长48
‑
72小时，并在实验之前使其分化6至8天。在分别使用100nm的胰岛素孵育30分钟，或者使用200、20、2.0和0.2μm的sp以及2、1、0.5和0.25mg/ml的肽/肽组合物孵育3小时之前，使l6
‑
glut4myc细胞血清饥饿
(serum
‑
starved)3小时。基于先前的发现，选择3小时的孵育期，确定了使用含有二肽的支链氨基酸孵育3小时增加了l6肌管1中的葡萄糖摄取。为了确定在同一时间点的glut4myc易位，将处理交错(staggered)。通过抗体偶联比色测定法(antibody
‑
coupled colorimetric assay)测量细胞表面上的myc标记的glut4的量。简略地，在分别使用胰岛素孵育30分钟或合成肽或肽组合物3小时后，通过使用3％的多聚甲醛(pfa)孵育固定l6
‑
glut4myc细胞。然后，加入0.1m的甘氨酸溶液以淬灭pfa，并用5％的山羊血清阻断细胞。将肌管单层暴露于抗myc抗体(anti
‑
myc antibody)，然后使用过氧化物酶缀合的驴抗小鼠igg孵育。向每个孔中加入1ml的邻苯二胺二盐酸盐(opd)试剂，并通过加入250μl/孔的3m的hcl终止该反应。为了测定glut4易位至细胞表面，使用492nm处的吸光度，在酶标仪上通过分光光度法测定各个条件的测量的等分试样。优选地，与未处理的对照相比，肽或片段能够将glut4易位增加至少50％(即，glut4易位的相对单位增加1％至1.5％)。
[0284]
应用于肽或片段的“抗细菌”或“抗细菌活性”意指在以下基于琼脂板的生长抑制测定中，能够可见地抑制细菌生长的肽或片段：溶于dmso中的肽储液＝5mg/ml。将细菌接种物调整至mcfarland 0.5标准，并将mha板擦拭。将空白盘置于板中，并加入10μl的每种化合物(在64μg/ml
‑
最大测试浓度下)。将板在37℃下孵育16
‑
18小时。还进行了适当的对照(dmso；单独的水解酪蛋白(mueller
‑
hinton)培养基；以及两种抗生素片
‑
环丙沙星和四环素)。
[0285]
应用于肽或片段的“抗炎性”意指当用100μm的肽或片段处理巨噬细胞时，通过lps刺激的j774.2巨噬细胞(与未处理的lps刺激的j774.2巨噬细胞相比)能够显著减少tnfα分泌的肽或片段。将j774.2巨噬细胞用100μm的合成肽处理24小时，然后用(a)lps(10ng/ml)刺激5小时，或(b)lps(10ng/ml)刺激5小时，然后用atp(5mm)刺激1小时。收集上清液并通过elisa测定tnfα的水平。
[0286]
应用于本发明组合物的“富含具有小于10kd的分子量的肽”意指分子量小于10kd的组合物中的肽的干重百分比大于分子量为10kd或更高的组合物中的多肽/蛋白质的干重百分比。
[0287]
参考蛋白质的“同源物”应该被理解为意指来自不同种类植物的蛋白质与参考蛋白质具有至少60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同源性。因此，例如，豌豆蛋白质p13918的同源物包括：
[0288]
>gi|137584|sp|p08438.1|vcl_vicfa recname：完整＝豌豆球蛋白；标志：前体[蚕豆]
[0289]
>gi|22057|emb|caa68559.1|豌豆球蛋白[小蚕豆(vicia faba var.minor)]>gi|383931031|gb|afh56916.1|豌豆球蛋白[蚕豆]
[0290]
>gi|502105533|ref|xp_004492829.1|预测的：豌豆球蛋白样亚型x1[鹰嘴豆(cicer arietinum)]鹰嘴豆(chickpea)
[0291]
>gi|29539109|emb|cad87730.1|过敏原len c 1.0101[兵豆(lens culinaris)]小扁豆(lentil)
[0292]
生长促进片段的“变体”应被认为意指具有与参考生长促进片段基本相同的氨基酸序列的片段，并且其具有如上定义的生长促进活性。因此，例如，该术语应该被认为包括相比于一个或多个氨基酸残基被改变的片段。优选地，这种改变只涉及插入、添加、缺失和/
或替换5个或更少的氨基酸，更优选为4个或更少，甚至更优选为3个或更少，最优选为1或2个氨基酸。设想用天然和修饰的氨基酸插入、添加和替换。该变体可具有保守氨基酸变化，其中被引入的氨基酸在结构上、化学上或功能上类似于被替换的氨基酸。通常，变体与参考生长促进片段具有至少70％的氨基酸序列同源性，优选为至少80％的序列同源性，更优选为至少90％的序列同源性，并且理想地为至少95％、96％、97％、98％或99％的序列同源性。
[0293]
在本说明书中，术语“序列同一性”应理解为包含序列同一性和相似性二者，即与参考序列共享70％的序列同一性的变体(或同源物)是其中变体(或同源物)的任何70％的比对残基在序列的整个长度上与参考序列中的相应残基相同或保守替换的变体(或同源物)。序列同一性是两个不同序列之间完全匹配的性状的量。因此，缺口不计算在内，并且测量与两个序列中较短的一个相关。就“序列同源性”而言，该术语应被理解为意指当变体(或同源物)的比对残基的百分比与参考序列中的相应残基相同或保守替换时并且在变体(或同源物)与参考序列共享相同的功能的情况下，与参考序列共享限定的百分比相似性或同一性的变体(或同源物)。该比对和百分比同源性或序列同一性可以使用本领域已知的软件程序来确定，例如，一个比对程序是使用默认参数的blast。这些程序的详细信息可以在以下internet网址获悉：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi。
[0294]
sequence id no:448(qsfllsgnq)的变体
[0295]
以下提供sequence id no:448(qsfllsgnq)的变体，其包括具有1或2个保守氨基酸替换，1、2至3个非保守氨基酸替换，1
‑
2个氨基酸添加，1、2或3个氨基酸缺失的变体。
[0296]
一个保守的氨基酸替换：
[0297]
qsfilsgne、esfllsgnq、qsyllsgnq、qsfllsgdq(seq id no 418
‑
421)
[0298]
两个保守氨基酸替换：
[0299]
qsyllsgne、esfllsgne、esyllsgnq、qsfllsgde、qsyllsgdq(seq id no 422至426)
[0300]
一个非保守氨基酸替换
[0301]
qsfrlsgnq、qsfllsynq、qffllsgnq、qsfllsgaq、qsfllsgnp(seq id no 427至431)
[0302]
两个非保守氨基酸替换
[0303]
qsfrrsgnq、qsfllsyiq、qffllsgnl、qsfllsgaq、qsfllsgnp(seq id no 432至436)
[0304]
一个或两个氨基酸添加
[0305]
qsfllsgnqq、qsflllsgnq、aqsfgllsgnq、rqsfllisgnq、qsfllsgnqk(seq id no 437至441)
[0306]
一个、两个或三个氨基酸缺失
[0307]
qfllsgnq、sfllsgnq、qsfllsgn、qsfllgnq、qsflsgnq、qsllsgnq、sfllsgnq、qsfllsgn、sfllsgn、qsfsgnq(seq id no 442至451)
[0308]
术语“变体”还包括本发明的肽的片段。“本发明的肽的片段”或“肽片段”意指本发明的其中一种肽的片段，其具有至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22个氨基酸并且通常具有生物活性，例如抗炎活性、抗衰老活性、葡萄糖转运促进活性或抗细菌活性的。在一个实施方案中，片段由至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的参考序列组成。因此，本发明还提供了本发明的肽的生物活性片段，以及包含一个或多个这些片段的肽。在一个实施方案中，片段是生物活性的。在一个实施方案中，片段是细胞生长或增殖促进片段。在sequence id no 494至524中提供了本发明的肽的片段的实例。
[0309]“抗衰老”意指抑制或减缓人类皮肤衰老的出现和/或逆转衰老的面容。“减缓或抑制皮肤衰老”意指减缓或抑制皮肤中的衰老过程和/或逆转衰老的面容。
[0310]“特征在于真皮或上皮细胞或组织损伤的疾病或病况”意指导致真皮或上皮组织或细胞或器官受损的任何病况或疾病。一个实例是通常导致皮肤受损的创伤。另一个实例是炎性皮肤病况，例如通常导致皮肤受损的银屑病或湿疹。另一个实例是小肠的炎症性病症，这可能导致衬在小肠内的上皮细胞/组织受损。另一个实例是由于摄入有毒或有害物质(例如，有毒化学物质或药物)而造成衬在小肠内的上皮细胞/组织受损。另一个实例是癌症，例如肠癌，其可能导致肠中的上皮组织受损。另一种病况是外周炎性病症，例如特应性皮炎，其可导致人类皮肤损伤。
[0311]“炎性病症”意指影响人类的免疫介导的炎性病况并且通常特征在于一种或多种细胞因子的异常表达(dysregulated expression)。炎性病症的实例包括皮肤炎性病症、关节炎性病症、心血管系统的炎性病症、某些自身免疫病、肺和气道炎性病症、肠道炎性病症。皮肤炎性病症的实例包括皮炎，例如特应性皮炎和接触性皮炎、寻常痤疮和银屑病。关节炎性病症的实例包括类风湿性关节炎。心血管系统炎性疾病的实例是心血管疾病和动脉粥样硬化。自身免疫疾病的实例包括1型糖尿病、格雷夫斯病、格林
‑
巴利病、狼疮、银屑病关节炎和溃疡性结肠炎。肺和气道炎性病症的实例包括哮喘、囊性纤维化、copd、肺气肿和急性呼吸窘迫综合征。肠道炎性病症的实例包括结肠炎和炎性肠病。其它炎性病症包括癌症、枯草热、牙周炎、过敏、超敏反应、缺血、抑郁症、全身性疾病、感染后炎症和支气管炎。本发明还涉及一种用于治疗哺乳动物的炎性病症的本发明的肽或组合物。
[0312]“代谢紊乱”应被理解为包括前期糖尿病、糖尿病；1型糖尿病；2型糖尿病；代谢综合征；肥胖；糖尿病血脂异常；高脂血症；高血压；高甘油三酯血症；高脂肪酸血症(hyperfattyacidemia)；高胆固醇血症(hypercholerterolemia)；高胰岛素血症和mody。本发明还涉及一种用于治疗哺乳动物的代谢紊乱的本发明的肽或组合物。
[0313]“特征在于真皮或上皮细胞或组织损伤的疾病或病况”意指导致真皮或上皮组织或细胞或器官受损的任何病况或疾病。一个实例是通常导致皮肤受损的创伤。另一个实例是炎性皮肤病况，例如通常导致皮肤受损的银屑病或湿疹。另一个实例是小肠的炎症性病症，这可能导致衬在小肠内的上皮细胞/组织受损。另一个实例是由于摄入有毒或有害物质(例如，有毒化学物质或药物)而造成衬在小肠内的上皮细胞/组织受损。另一个实例是癌症，例如肠癌，其可能导致肠中的上皮组织受损。另一种病况是外周炎性病症，例如特应性皮炎，其可导致人类皮肤损伤。
[0314]“特征为细菌感染的疾病或病况”意指特征为具有由细菌生长或细菌感染引起的病理的任何病况或疾病，包括例如mrsa、沙门氏菌、李斯特菌、细菌性肺炎、葡萄球菌食物中毒、细菌性脑膜炎(bacterial memingitis)。以下网址https://en.wikipedia.org/wiki/list of infectious diseases提供了具体实例。
[0315]
应用于可食产品的“人造”应被理解为意指由人类制造且于自然界中不存在。
[0316]“维持或恢复肠道健康”意指减少和/或调节肠道中的促炎反应，且更具体地为上皮细胞。健康的微生物组提供抵御致病病毒和细菌的一定的保护，并且需要它们的存在以引导我们的免疫系统的发展。已经表明，这些细菌可以对压力、生病或年龄的人体信号作出反应，这些信号可以通过炎症表现出来，并因此开启它们致病基因并导致或促成疾病。具有
减少和维持在健康水平的能力，炎症反应可以帮助维护健康细菌。消化问题包括北美洲的头号健康问题，近年来似乎更频繁地出现。维持消化系统健康的一个方法是维持适当的炎症和肠道菌群。
[0317]“改善肌肉状态”意指改善肌肉健康，例如促进骨骼肌肉蛋白质合成、骨骼葡萄糖吸收、改善治疗或非治疗情况下的瘦肉组织克数，通常在活动锻炼之后促进肌肉恢复，或改善肌肉性能。该方法或用途可以是治疗性或非治疗性的。术语“改善瘦肉组织克数状态”应被理解为意指增加瘦肉组织克数，或者抑制或防止瘦肉组织克数降低的速率。
[0318]“促进肌肉恢复”意指与未处理的骨骼肌相比，骨骼肌中的葡萄糖吸收增加。
[0319]“特征在于嗜睡或低能量的疾病或病况”意指特征在于感觉或疲倦或低能量的任何病况或疾病。实例包括过敏、哮喘、贫血、癌症及其治疗、慢性疼痛、心脏病、感染、抑郁症、进食障碍、悲痛、睡眠障碍、甲状腺问题、药物副作用、酒精使用或药物使用。
[0320]“维持或恢复肌肉健康”意指帮助保持或恢复运动过程中所造成的损伤所引起的哺乳动物肌肉健康。通过促进骨骼肌中的葡萄糖转运，肽促进运动后恢复，并减轻与锻炼有关的肌肉酸痛/疼痛和损伤。它们还可以用来减少和防止肌肉痉挛，并允许从肌肉痉挛快速恢复。痉挛可能是由躯体应激、心理应激和/或重复性压迫损伤应激造成的。通过促进葡萄糖转运，肽有助于减少肌肉肌病，并有助于预防哺乳动物的肌肉减少症，促进运动过程中的损伤恢复，并减轻肌肉酸痛/运动相关的疼痛和损伤。本发明还涉及一种用于维持或恢复哺乳动物的肌肉健康的本发明的肽或组合物。
[0321]
在本说明书中，应用于肽列表的术语“基本上全部”应被理解为意指肽的至少60％、70％、80％、90％或95％。
[0322]
应用于可食产品的“人造”应被理解为意指由人类制造且在自然界中不存在。
附图说明
[0323]
图1至100：本发明的合成肽对人真皮成纤维细胞(human dermal fibroblasts)(hdf)的增殖的影响。
[0324]
图101：本发明的合成肽(seq id 42)对人真皮成纤维细胞(hdf)的弹性蛋白合成的影响。
[0325]
图102：本发明的合成肽(seq id 42)对人真皮成纤维细胞(hdf)的胶原合成的影响。
[0326]
图103：本发明的合成肽(seq id 701)对人真皮成纤维细胞(hdf)的弹性蛋白合成的影响。
[0327]
图104：本发明的合成肽(seq id 701)对人真皮成纤维细胞(hdf)的胶原合成的影响。
[0328]
图105：本发明的合成肽(seq id 246)对人真皮成纤维细胞(hdf)的弹性蛋白合成的影响。
[0329]
图106：本发明的合成肽(seq id 246)对人真皮成纤维细胞(hdf)的胶原合成的影响。
[0330]
图107：本发明的合成肽(seq id 284)对人真皮成纤维细胞(hdf)的弹性蛋白合成的影响。
[0331]
图108：本发明的合成肽(seq id 245)对人真皮成纤维细胞(hdf)的弹性蛋白合成的影响。
[0332]
图109：本发明的合成肽(seq id 245)对人真皮成纤维细胞(hdf)的胶原蛋白合成的影响。
[0333]
图110.示出了测定系统的完整性控制和可行性控制。
[0334]
图111.对于肽p1、p2和p3，与对照组(水或dmso)相比，浅表性真皮中弹性蛋白表达的百分比
[0335]
*
表示浅表性和中层真皮(middle dermis)中的弹性蛋白表达的显著增加。
[0336]
图112.对于肽p1、p2和p3，与对照组(水或dmso)相比，中层真皮的弹性蛋白表达的百分比
[0337]
*
表示浅表性和中层真皮的弹性蛋白表达的显著增加。
[0338]
图113.对于肽p6和p8以及肽组合物p9和p10，与对照(水或dmso)相比，在表皮基底层中的细胞增殖百分比
[0339]
*
表示显著的增加。
[0340]
图114.弹性纤维( 儿茶素，x200)的组织学分析。
[0341]
图115.有丝分裂指数的免疫组织化学评价(ki67，x400)。
具体实施方式
[0342]
实施例1
‑
细胞增殖测定
[0343]
将brdu掺入到新合成的活性增殖细胞的dna链中。
[0344]
在双链dna部分变性后，免疫化学检测brdu允许评估正在合成dna的细胞群体。
[0345]
在含有10％的胎牛血清(fcs)、1％的青霉素/链霉素(pen/strep)、1％的l
‑
谷氨酰胺的dmem中，将人真皮成纤维细胞(hdf
‑
sigma 10605a)以10,000个细胞/孔接种在96孔板中并保持(adhere)24小时。
[0346]
在最初的24小时孵育之后，将细胞分别与5μg/ml、0.5μg/ml或0.05μg/ml合成肽一起孵育24小时。
[0347]
与合成肽孵育18小时后，将20μl的brdu试剂加入到每个孔中。
[0348]
在24小时孵育中，将细胞固定，并使用brdu细胞增殖测定法测量2
‑
dg6p的量，所有步骤均根据制造商的说明书进行。
[0349]
结果以未处理的对照组的百分比形式计算。光密度读数的增加表明brdu的掺入更大，并增加细胞增殖。
[0350]
结果示于图1
‑
100和下表1中。
[0351]
表1
[0352]
[0353][0354]
实施例2
‑
胶原蛋白生产测定
[0355]
组织制剂中的羟脯氨酸是胶原蛋白存在的量的直接量度。firelisa人羟脯氨酸elisa试剂盒测定(firelisa human hydroxyproline elisa kit assay)被设计用于测量组织或肽组合物中的羟脯氨酸。
[0356]
在含有10％的胎牛血清(fcs)、1％的青霉素/链霉素(pen/strep)、1％的l
‑
谷氨酰胺的dmem中，将人真皮成纤维细胞(hdf
‑
sigma 10605a)以50,000个细胞/孔接种在24孔板中并使保持24小时。
[0357]
在最初的24小时孵育之后，将细胞分别与5μg/ml、1μg/ml或0.1μg/ml合成肽一起孵育96小时。
[0358]
处理后，在液氮中使用4次冻融循环将细胞裂解。将裂解的细胞离心，并使用firelisa人羟脯氨酸elisa试剂盒测定50μl/ml的每种上清液。所有步骤均按照制造商的说明进行。
[0359]
结果以未处理的对照组的百分比形式计算。光密度读数的增加表明胶原蛋白含量增加。
[0360]
结果示于图102、104、106和109中。
[0361]
实施例3
‑
弹性蛋白生产测定
[0362]
弹性蛋白是结缔组织中的高度弹性的蛋白质，并允许身体中的许多组织在伸展或收缩后恢复它们的形状。firelisa人弹性蛋白elisa试剂盒测定(firelisa human elastin elisakit assay)被设计用于测量组织或蛋白质/肽组合物中的弹性蛋白。
[0363]
在含有10％的胎牛血清(fcs)、1％的青霉素/链霉素(pen/strep)、1％的l
‑
谷氨酰胺的dmem中，将人真皮成纤维细胞(hdf)以50,000个细胞/孔接种在24孔板中并保持24小时。
[0364]
在最初的24小时孵育之后，将细胞分别与5μg/ml、1μg/ml或0.1μg/ml合成肽一起孵育96小时。
[0365]
处理后，在液氮中使用4次冻融循环将细胞裂解。将裂解的细胞离心，并使用firelisa人弹性蛋白elisa试剂盒测定50μl/ml的每种上清液。所有步骤均按照制造商的说明进行。
[0366]
结果以未处理的对照组的百分比形式计算。光密度读数的增加表明胶原蛋白含量增加。
[0367]
结果示于图101、103、105、107、108和109中。
[0368]
实施例4
‑
弹性蛋白和细胞增殖测定
[0369]
表2.测试项目.橙色带对应于溶于0.3％的dmso的样品而不是溶于水的样品。
[0370][0371]
设备
[0372]
孵化器、流式层流室、无菌抛光塑料棒、移液器、维持培养基、6孔板、24孔板。
[0373]
试剂
[0374]
mtt、pbs、sds、甲醛、二甲苯、无水乙醇、dulbecco磷酸盐缓冲液(dpbs)、金属增强dab底物试剂盒(metal enhanced dab substrate kit)、abc过氧化物酶染色试剂盒、柠檬酸、2n的氢氧化钠、30％的过氧化氢、抗丝聚蛋白(anti
‑
filaggrin)、抗
‑
兔igg
‑
生物素(anti
‑
rabbit igg
‑
biotin)、吐温20。
[0375]
测试系统
[0376]
性质：人类皮肤组织5mm直径
[0377]
批号：exp004050b009和exp004050b011
[0378]
供应商：biopredic国际实验室
‑8‑
18
‑
鲁佩克尔街
‑
35000雷恩
‑
法国(laboratoire biopredic international
‑8‑
18rue jean pecker
‑
35000rennes france).电话： 33(0)2.99.14.36.14
‑
传真： 33(0)2.99.54.44.72。
[0379]
分析证明见附件1。
[0380]
两个批次用于测定。批次exp004050b005用于实验第1天，批次exp004050b006用于实验第5天。
[0381]
维持培养基
[0382]
维持培养基：批号：mil 218c
[0383]
供应商：biopredic国际实验室
‑8‑
18
‑
鲁佩克尔街
‑
35000雷恩
‑
法国测试的肽
[0384]
p1:seq id no:283
[0385]
p2:seq id no:246
[0386]
p3:seq id no:284
[0387]
p4:rpyysnapqeif
[0388]
p5:vlleqqeqepqh
[0389]
p6:seq id no:245
[0390]
p7:qqygiaaspflqsaa
[0391]
p8:seq id no:42
[0392]
测试的组合物
[0393]
p9(14
‑
chl
‑
0723
‑
09)是豌豆组合物(seq id no:50、85、74、140、82、136、189、77、169、149、171、178、143、127、190、141、147、133、186、125、122、119、87、90、86、89、138、129、123、120、117、113、110、121、105、98、55、161、19、317、135、130、146、177、160、170、188、83、78、36、96、159、26、330、168、148、184、151、151、165、114、284)
[0394]
p10(14
‑
chl
‑
0723
‑
010)是大米组合物(seq id no:245、246、263、250、257、259、276、255、251、264、256、266、274、270、269、356、245、380、262、258、356、218、252、358、271、253、344、275、272、226、224、220、248、261、265、373、375、247、249、363、273、343、273、362)
[0395]
应用方法
[0396]
从腹部整形手术制备皮肤外植体。将一些外植体用酒精脱脂以获得脱水皮肤。
[0397]
将这些外植体培养在供应商biopr
é
dic international提供的维持培养基中5天。测试项目每天施用两次，其中每个外植体5μl。
[0398]
在测试结束时，在两个外植体上用mtt实现活力对照，将第三外植体固定在4％的甲醛中用于组织学分析和细胞染色。
[0399]
对于每次分析(d1和d5)，对脱脂外植体、用测试项目处理的外植体、dmso 0.3％对
照组和水对照组进行组织学分析。
[0400]
在实验室收到之后，在3小时期间用5μl的酒精将维持培养基中的每个皮肤外植体脱脂。
[0401]
3小时后，将所有皮肤外植体每天用测试项目处理两次，并将它们在37℃
±
2℃，5％的co2下孵育1天或5天。
[0402]
在第1天和第5天使用具有mtt的活力对照实现系统的完整性。
[0403]
免疫染色
[0404]
由实验室gredeco实现组织学，并由同一实验室实现弹性蛋白和ki67的免疫染色。由实验室intertek实现丝聚蛋白的免疫染色。
[0405]
使用免疫过氧化物酶技术两层(abc试剂盒，vector实验室)进行弹性蛋白(兔单克隆抗体，克隆p 15502，lsbio)的检测，并通过aec(3
‑
氨基
‑9‑
乙基咔唑)显示。使用半定量组织学评分(semi
‑
quantitative histological score)评估弹性纤维中的免疫组织化学染色强度。
[0406]
使用抗ki67抗体通过免疫组织化学分析上皮细胞增殖。使用间接免疫过氧化物酶技术三层进行免疫检测，并通过aec(3
‑
氨基
‑9‑
乙基咔唑)扩增(dako试剂盒)和显示。计数标记细胞(表皮基底层的角质形成细胞)的数量并提供基底细胞的总数以计算标记细胞的百分比。
[0407]
使用免疫过氧化物酶染色进行丝聚蛋白的特异性染色(abc试剂盒,fisher)。相对于溶剂的阴性对照(水或dmso 0.3％)评估表皮中的免疫组织化学标记的强度。
[0408]
c：结果
[0409]
活力对照
[0410]
图1示出了完整性控制和活力对照。这些控制确实允许验证测定系统。测试项目的活力是>50％，并且根据测试，它们不显示细胞毒性。
[0411]
免疫染色
[0412]
弹性蛋白表达
[0413]
通过用儿茶素染色显示真皮的弹性纤维，并通过计算机辅助图像分析进行形态学定量。在真皮和平均浅表性真皮中，计算真皮中的弹性纤维占据的面积百分比。结果示于表1、图2和图3中。
[0414]
表3.浅表性真皮(％)和中层真皮的弹性纤维的形态学量化，橙色带对应于溶于0.3％的dmso的样品而不是溶于水的样品。
[0415][0416]
在本研究的实验条件下，与水对照组相比，0723
‑
1和0723
‑
3样品显示浅表性真皮中的弹性纤维增加两倍(图)，与d5的水对照组相比，中层真皮增加。
[0417]
与水对照组相比，在第1天，0723
‑
2样品显示中层真皮增加了两倍，在第5天有增加。
[0418]
ki67表达
[0419]
ki67的免疫组织化学分析结果在表中报告并表示为在表皮的基底层处标记的百分比。该图显示了与阴性对照(水或dmso)相比，ki67细胞的百分比。表4中示出有丝分裂活性的免疫组织化学分析，提示每种分析条件的平均值。
[0420]
表4.表皮基底层中ki67阳性细胞的百分比，橙色带对应于溶于0.3％的dmso的样品而不是溶于水的样品。
[0421][0422]
在研究的实验条件下，与第1天的egf相比，测试项目0723
‑
06、0723
‑
08、0723
‑
09和0723
‑
010显示出有丝分裂细胞的数目增加。对于所有的分析条件，与第1天相比，在第5天观察到有丝分裂指数的降低。
[0423]
第5天这种细胞染色的减少是由模型引起的。实际上，在约3天后，这个模型上的细胞更新停止。
[0424]
本发明不限于前面描述的实施方案，在不脱离本发明的精神的情况下，其可以在结构和细节上进行改变。
[0425]
[0426]
[0427]
[0428]
[0429]
[0430]
[0431]
[0432]
[0433]
[0434]
[0435]
[0436]
[0437]
[0438]
[0439]
[0440]
[0441]
[0442]
[0443]
[0444]
[0445]
[0446]
[0447]