非受体酪氨酸激酶TNK2蛋白在防治流感病毒感染中的应用的制作方法

非受体酪氨酸激酶tnk2蛋白在防治流感病毒感染中的应用
技术领域
1.本发明涉及生物医药技术领域，是一种抗流感病毒感染的新靶点及应用。


背景技术：

2.流感病毒引起严重的呼吸道疾病，危害公共环境和生命安全，90年代至今已经造成四次全球性流感大流行，危害性极大。尽管成功的疫苗研发，已经可以有效预防流感病毒感染，但是由于流感病毒具有高度变异性，导致疫苗效果达不到理想状态。根据流感病毒感染宿主的特性，我们发现宿主因子广泛的参与病毒复制周期中，并且宿主因子具有明显的广谱特性，因此，利用宿主因子作为药物靶点在抗流感病毒感染中具有重要的作用。非受体酪氨酸激酶tnk2蛋白属于非受体酪氨酸激酶家族成员之一，其含有多个结构域，包括一个sam区、一个酪氨酸激酶催化区、一个cdc42/rac结合区以及一个泛素结合区等，并且其能够定位于细胞内多个组分，导致赋予其功能多样性的特性，例如调控细胞生长周期、调节egfr内吞、泛素化以及细胞内信号转导等；此外，研究发现，tnk2也参与多种肿瘤的发生发展过程中，tnk2可以通过egfr持续表达促进乳腺癌细胞的迁移，通过调控组蛋白修饰影响前列腺癌等。因此，tnk2在癌症早期筛查、靶向治疗和预后评价中具有重要的作用。
3.crispr/cas9 技术是基于广泛存在于细菌及古细菌中的一种获得性免疫防疫机制，后期经由人工改造开发而建立，通过导向 rna序列在靶标基因特定位点进行切割引起dna双链断裂，进而诱发细胞内的非同源末端修复，造成碱基缺失、插入，进而实现基因功能敲除的目的。该技术使用方便，操作简单，成本低，为基因组定向改造、调控与应用等带来突破性革命。目前，crispr/cas9 技术已广泛应用于特定基因敲除功能研究，以及敲除基因的动物模型构建等领域，对深入挖掘基因功能、精准治疗方面具有广阔的前景。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种抗流感病毒感染的新靶点。
5.本发明的另一目的在于提供非受体酪氨酸激酶tnk2蛋白的新用途，特别是在抗流感病毒感染中的应用。
6.本发明的第三目的在于提供抑制或阻碍非受体酪氨酸激酶tnk2蛋白分子表达的grna。
7.本发明的主要技术方案是：本发明，以人肺上皮细胞（a549）作为靶细胞，采用crispr/cas9基因编辑技术抑制或阻碍宿主蛋白的表达，来挖掘可有效抑制流感病毒感染的宿主因子，从而保护机体免受侵害的功能。本实验发现非受体酪氨酸激酶tnk2蛋白在流感病毒感染人肺上皮细胞（a549）中发挥着重要作用，利用设计的人和猪的tnk2 grna抑制或阻碍tnk2蛋白表达，并通过分子生物学和免疫实验，来观察对流感病毒感染的影响。结果发现抑制或阻碍tnk2蛋白表达能显著抑制流感病毒感染。
8.本发明的第一方面，提供了非受体酪氨酸激酶tnk2作为一种抗流感病毒感染的新
靶点。
9.本发明的第二方面，提供了非受体酪氨酸激酶tnk2在制备预防或治疗流感病毒感染药物中的应用。
10.进一步地，本发明还提供非受体酪氨酸激酶tnk2在制备预防或治疗流感药物中的应用。
11.本发明所述的非受体酪氨酸激酶tnk2在制备预防或治疗流感病毒感染药物药物中的应用，该药物具体是指能够抑制或阻碍tnk2表达的试剂。
12.所述的抑制或阻碍tnk2表达的试剂可以是grna 或者是包含grna的重组载体等。
13.本发明的第三方面，本发明提供了抑制或阻碍tnk2表达的双grna在制备预防或治疗流感病毒感染药物中的应用，或tnk2在制备预防或治疗流感药物中的应用，所述的药物为tnk2 grna,其序列如下：所述tnk2
‑
grna1的靶向序列为: tggcaggaataggggacgt所述tnk2
‑
grna2的靶向序列为: ctcatcattctgactaccg。本发明的有益技术效果：本发明利用利用全基因遗传筛选技术鉴定到tnk2是流感病毒感染的关键宿主蛋白，并进一步通过构建靶向tnk2基因的特异性双grna，利用 crispr/cas9基因编辑技术获得不表达tnk2蛋白的单克隆细胞系，然后利用免疫荧光和病毒滴度检测技术观察了抑制或阻碍tnk2分子表达，能够显著抑制流感病毒蛋白的表达，并且能显著抑制不同种属流感病毒（包括猪和禽流感病毒）的复制，表面抑制tnk2表达可能展现出广谱的抗病毒效果。本发明为抗流感病毒的治疗提供了新的候选靶点，扩展了传统抗病毒治疗的手段，为临床预防和治疗因流感病毒感染所导致的生理疾病提供了新的治疗方案。因此具有非常好的应用价值。
附图说明
14.图1 为本发明实施例1提供的pu6grna_pb_bbsi载体骨架图谱；图2 为本发明实施例1提供的重组表达载体靶向切割检测(pcr检测)；图3 为本发明实施例1提供的重组表达载体靶向切割检测(sanger测序检测)；图4 为本发明实施例2提供的单克隆细胞tnk2表达检测(western blooting检测结果);图5 利用免疫荧光实验证实抑制或阻碍tnk2表达后人流感病毒蛋白表达下降;图6 利用空斑实验证实抑制或阻碍tnk2表达后能降低人流感病毒(h1n1)的滴度;图7 利用免疫荧光实验证实抑制或阻碍tnk2表达后禽流感病毒(h9n2)复制减少;图8 利用tcid
50
实验证实抑制或阻碍tnk2表达后能降低猪流感病毒(h1n1)的滴度。
具体实施方式
15.以下将结合附图对本发明各实施例的技术方案进行清晰、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例；基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施例，都属于本发
明所保护的范围。
16.实施例1人tnk2基因被敲除所需的双grna质粒载体构建及检测(1)人tnk2基因双grna质粒载体构建从ensembl数据库获得人tnk2（ensg00000061938）的基因序列，然后针对敲除tnk2第一个外显子来设计特异性的上下游敲除位点，综合软件系统评分获得两条最佳的靶序列tnk2
‑
sgrna1（靶向序列为:tggcaggaataggggacgt）和tnk2
‑
sgrna2（靶向序列为:ctcatcattctgactaccg）。根据bbsi限制性内切酶在sgrna的两端设计酶切位点，在grna的5'端加上caccg，3'端加上gt;反向互补序列的5'端加上taaaac,设计2对sgrna寡核苷酸链，对应的序列如下:tnk2
‑
sgrna1oligo1:5'
‑
caccgtggcaggaataggggacgtgt
‑
3';tnk2
‑
sgrna1oligo2:5'
‑
taaaacacgtcccctattcctgccac
‑
3';tnk2
‑
sgrna2oligo1:5'
‑
caccgctcatcattctgactaccggt
‑
3';tnk2
‑
sgrna2oligo2:5'
‑
taaaaccggtagtcagaatgatgagc
‑
3'；然后将oligo1和oligo2混合到10mmtris
‑
hcl(ph8.0)和5mmmgcl2的缓冲液中，在95
°
c孵育5分钟，然后冰上冷却，形成双链；双链grnas再分别克隆至酶切后的grna克隆载体pklv
‑
flipedu6grna_ccdb_pb_bbsi_pgkpuro2abfp中，并转化大肠杆菌top10,挑单克隆菌株，提取质粒。
17.(2)人tnk2基因双grna在靶细胞中的效果鉴定 本发明以人非小细胞肺癌细胞系a549作为靶细胞。将提前构建后的稳转cas9的a549细胞(cas9
‑
a549)复苏，在转染前将cas9
‑
a549细胞接种到12孔板，然后将构建好的重组质粒tnk2
‑
grna1和tnk2
‑
grna2，各1μg与lipofectamine3000，4μl(按照比例1μg：2μl)加至50μl的opti
‑
mem中，静止5min后将两者混合。将四种脂质体
‑
质粒dna混合物静置15min后直接加至细胞培养基中。将细胞重新置于37℃、5％co2培养箱中培养48h。然后用含有嘌呤霉素的培养基继续培养细胞7
‑
14天，获得阳性单克隆细胞。提取基因组dna，利用pcr技术和sanger测序鉴定是否敲除tnk2基因。
18.实例2转染tnk2双grna后，获得的单克隆a549细胞中tnk2蛋白表达检测将实例1中筛选获得的单克隆细胞系，接种至6孔板扩大培养，将转染前cas9
‑
a549细胞设为对照，待细胞长满后，收取细胞放置冰上,加入适量sds
‑
page上样缓冲液充分搅拌裂解，金属浴放置10min变性，离心后，取上清进行sds
‑
page。电泳后通过湿转法转移至pvdf膜，转印后使用5％的脱脂奶粉封闭，然后孵育兔抗人tnk2抗体（1:1000，abcam），羊抗兔igg(igg
‑
hrp)为二抗，进行抗原抗体复合物检测，对tnk2基因敲除的a549单克隆细胞系在蛋白表达水平进行验证。实验结果如图4所示，在野生型的细胞中检测到清晰的tnk2蛋白条带，而转染tnk2的双grna的单克隆细胞系中没有检测到tnk2蛋白条带。
19.实例3tnk2敲除后对流感病毒感染的影响利用获得稳定敲除tnk2的单克隆细胞系，被分别感染人、猪和禽流感病毒，感染相应时间就，利用免疫荧光、病毒滴度检测技术检测抑制或阻碍tnk2表达对流感病毒感染的影响。
20.免疫荧光的具体方法如下：敲除tnk2的单克隆细胞系和野生型细胞感染流感病毒相应时间后，吸除上清液，以pbs快洗两次；用4％的多聚甲醛固定细胞10分钟后，弃去固定液，pbs洗3次；加入0.2％triton
‑
x100室温放置5分钟，增加细胞膜的通透性；弃去triton
‑
x100，1
×
pbs洗3次；加汉10％bsa的pbs，放置于水平摇床上封闭30分钟；孵一抗：
按抗体说明书推荐的浓度，用含10％bsa 的pbs稀释，4度孵育过夜；然后pbs洗3次，每次10分钟；孵二抗：按推荐浓度，用含10％bsa pbs稀释，孵二抗后所有过程开始需要避光，室温孵育一个小时；pbs洗3次，每次10分钟，避光；dapi染核，10分钟，避光；pbs洗3次，每次10分钟，避光；用抗荧光衰减封片剂将盖玻片封于载玻片上；荧光显微镜下观察拍照。
21.病毒滴度的具体检测方法：1. 空斑实验（plaque assay）: mdck细胞平铺到12孔板中，24小时后，病毒原液以汉克缓冲液 (hank's solution) 做十倍连续稀释，由10
‑1稀释至10
‑7；把单层细胞的上清液吸掉后，加上病毒稀释液400ul，并放置在37 ℃温箱一小时，其间每十五分钟摇动一次，使病毒可充分与细胞接触；二倍的无血清dmem液与2.5%的avecil等量混合，每一孔内加1ml。放37 ℃温箱培养，并含二氧化碳5 %。48～96小时，去除上清液后，用pbs缓冲液洗2次，以1 % 结晶紫染液染色10分钟，再以自来水冲洗染液，直至无染料洗出为止；自然干燥后，便显出无色的不规则空洞。
22.2. 半数组织培养感染剂量（tcid
50
）: 单层细胞制备, mdck细胞于96孔中37℃培养24h，待生成单层后备用。病毒液稀释，病毒液作10倍稀释，先将稀释液分装于10个试管中，每管0.9ml，取0.1ml病毒悬液加入第一管中，摇匀后为10
‑1，换一支吸管，在10
‑
1病毒液中吸放3～4次，取0.1ml放入第二管中摇匀后为10
‑2........，如此稀释至10
‑
10
。病毒接种，取细胞培养板，用多道加样器吸去96孔板中的培养液，用pbs缓冲液洗2次, 然后将稀释好的病毒液加到96孔板上，每孔100ul，37℃培养1小时后，取出培养板中的病毒液，加入含有0.2%bsa的培养液继续在37℃ co2培养箱中培养。每天观察细胞病变情况，7天后统计观察结果，利用reed
‑
muench方法，找出能引起半数细胞感染的病毒稀释倍数，并按照公式: [(高于50%病变率的百分数
‑
50%)/(高于50%病变率的百分数
‑
低于50%病变率的百分数)]x稀释度对数之间的差 高于50%病变率的稀释度的对数；计算出病毒液的tcid
50
.实验结果发现与对照组相比，tnk2敲除的细胞系有较强的抵抗病毒特性，提示敲除tnk2基因能够降低流感病毒感染。
[0023]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。