一种检测恶臭假单胞菌的引物和方法及其应用与流程

1.本发明属于微生物检测技术领域。更具体地，涉及一种检测恶臭假单胞菌的引物和方法及其应用。


背景技术：

2.水牛是分布在我国南方的一种重要经济畜牧品种，随着生产资料的不断进步，新世纪水牛已逐渐转变成“乳用为主、肉役为辅”的发展趋势，水牛乳业已成为一项新兴产业。水牛乳以奶质优良而著称，营养全面，固形物含量高，乳香浓稠，其富含锌、铁、钙等矿物质元素，易于吸收，被誉为“奶中之王”。
3.假单胞菌被认为是危害原料乳及其制品的主要嗜冷菌，在低温储藏过程中仍能生长繁殖，其分泌的胞外蛋白酶具有耐热性，甚至能在超高温灭菌处理后仍有活性残留，使乳制品出现腐臭、苦味，粘度增加，形成凝胶、沉淀等现象，严重影响原料乳及其制品的质量，使得灭菌乳的货架期减短。但由于假单胞菌的种类众多，菌株形态以及生化性质之间差异性小，导致假单胞菌的分型困难。特别是分子分型方法出现后，许多从原料乳中发现的假单胞菌其实并不属于荧光假单胞，导致荧光假单胞菌的危害性可能被高估。因此，建立更加可靠的分子分型方法，对准确评估假单胞菌中不同菌种的危害潜力非常重要。有学者从中国地区不同原料乳中分离鉴定出67种假单胞菌，其中荧光假单胞菌、恶臭假单胞菌、莓实假单胞菌和隆德假单胞菌等都是常见的菌种。
4.中国专利cn 103898221a公开了恶臭假单胞菌的pcr检测用引物及检测方法，其目的在于检测进口环保微生物菌剂的恶臭假单胞菌，增加进口环保微生物菌剂的质量安全，保护我国自然环境不受外来细菌的破坏，但该pcr检测引物的灵敏度不高，仅2.36
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‑2μg/ml。因此，建立一种特异性更强，灵敏度更高的恶臭假单胞菌的pcr检测方法，对保障水牛乳的质量安全具有重要意义。


技术实现要素：

5.本发明要解决的技术问题是克服现有上述技术的缺陷和不足，提供一种检测恶臭假单胞菌的引物和方法及其应用。
6.本发明的目的是提供一种检测恶臭假单胞菌的引物。
7.本发明的另一目的是提供一种检测恶臭假单胞菌的方法。
8.本发明的再一目的是提供一种检测恶臭假单胞菌的试剂盒。
9.本发明上述目的通过以下技术方案实现：
10.本发明首先提供了一种检测恶臭假单胞菌的pcr引物，包括上游引物pp1和下游引物pp2，其序列依次如seq id no.1～2所示。
11.上述pcr引物是以genebank上恶臭假单胞菌的gyrb基因序列为靶基因进行设计，通过实验筛选得到。实验表明，本发明设计筛选得到的pcr引物pp1和pp2(seq id no.1～2)可特异性扩增恶臭假单胞菌上的目的片段，可用于检测或鉴定恶臭假单胞菌。
12.因此，本发明申请保护seq id no.1～2所示引物在检测/鉴定恶臭假单胞菌中的应用。
13.本发明还申请保护seq id no.1～2所示引物在制备检测/鉴定恶臭假单胞菌的产品中的应用。
14.优选地，seq id no.1～2所示引物可用于检测水牛乳中的恶臭假单胞菌或用于制备检测水牛乳中的恶臭假单胞菌的产品。
15.本发明还提供一种检测/鉴定恶臭假单胞菌的pcr方法，其包含以下步骤：
16.s1.提取待测样品中的细菌基因组dna；
17.s2.以步骤s1所得dna为模板，用seq id no.1～2所示pcr引物进行扩增；
18.s3.pcr产物进行凝胶电泳检测，若出现大小为241bp的单一条带，则表明所测样本中含有恶臭假单胞菌或所测样本为恶臭假单胞菌。
19.具体地，步骤s1中，使用天根公司的细菌基因组dna提取试剂盒或使用ctab/蛋白酶k法提取细菌基因组dna。
20.优选地，若所检测样品为牛乳，则使用ctab/蛋白酶k法提取细菌基因组dna。
21.具体地，步骤s2中，pcr扩增体系为：2
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taq master mix 12.5μl，浓度为10μm的引物各0.5μl，模板dna1μl，加ddh2o补至25μl。
22.具体地，步骤s2中，pcr反应程序为：94℃预变性2min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；再72℃延伸5min。
23.本发明还提供一种检测/鉴定恶臭假单胞菌的pcr试剂盒，其含有seq id no.1～2所示pcr引物。
24.优选地，所述试剂盒还包含pcr扩增反应所需试剂。
25.本发明申请保护所述试剂盒在检测/鉴定恶臭假单胞菌中的应用。
26.本发明还申请保护所述试剂盒在检测水牛乳中恶臭假单胞菌中的应用。
27.本发明具有以下有益效果：
28.本发明提供了一种检测恶臭假单胞菌的pcr引物pp1和pp2，并利用该引物建立了恶臭假单胞菌的pcr检测方法。本发明所述引物pp1和pp2的特异性好，灵敏度高，其最低核酸检测量为198.0
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‑5ng/μl，所述pcr检测方法的操作简单，结果可靠，适用于恶臭假单胞菌的鉴定，以及对水牛乳中恶臭假单胞菌的快速检测。
附图说明
29.图1为恶臭假单胞菌的pcr检测结果，其中泳道1～3为恶臭假单胞菌阳性样本，泳道4为空白对照。
30.图2为pcr引物的特异性检测结果，其中泳道1为阴性对照，泳道2所对应的模板为恶臭假单胞菌，泳道3～13所对应的模板依次为莓实假单胞菌、隆德假单胞菌、荧光假单胞菌、铜绿假单胞菌、斡氏假单胞菌、盖氏假单胞菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、发酵乳杆菌、单增李斯特菌和伤寒沙门氏菌。
31.图3为pcr引物的灵敏度检测结果，其中泳道1～10对应的dna稀释浓度依次为100～10
‑9ng/μl，泳道11为阴性对照。
32.图4为水牛乳中人工污染恶臭假单胞菌的pcr检测结果，其中泳道1为恶臭假单胞
菌的阳性对照，泳道2为阴性对照，泳道3为人工污染的水牛乳样品。
33.图5为生水牛乳中恶臭假单胞菌的pcr检测结果，其中泳道1为阴性对照，泳道2为阳性对照，泳道3～17为采集的15个生水牛乳样品。
具体实施方式
34.以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
35.除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
36.实施例1 pcr引物的设计及检测
37.1、pcr引物的设计
38.本发明以genebank上恶臭假单胞菌的gyrb基因序列为靶基因(基因登录号为nc_021505.1)进行引物设计，先设计筛选出了7对评分较高的pcr引物，再通过实验从中筛选最优的一对，所设计的7对引物的序列如表1所示：
39.表1 pcr引物信息
[0040][0041]
筛选实验发现，第4对pcr引物的特异性是最好的，故选择第4对pcr引物进行后续实验，并将其命名为引物pp1和pp2，拟扩增片段大小为241bp。
[0042]
pp1(seq id no.1)：agacaaagaacgcaacgtatgg
[0043]
pp2(seq id no.2)：acgcttggtggtctcattcat
[0044]
2、细菌基因组dna的提取
[0045]
使用天根公司的细菌基因组dna提取试剂盒(货号：dp302)，参照试剂盒说明书提取恶臭假单胞菌的基因组dna。
[0046]
3、pcr检测方法
[0047]
以提取的恶臭假单胞菌的基因组dna为模板，用pcr引物pp1和pp2进行扩增，pcr反应所用酶为康为世纪公司的taq酶，pcr扩增体系如表2所示：
[0048]
表2 pcr反应体系
[0049][0050]
pcr扩增程序为：94℃预变性2min；94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸30s，共30个循环；72℃延伸5min，最后4℃保存。
[0051]
本发明还对pcr引物pp1和pp2的退火温度进行了优化，所选择的退火温度范围为50～65℃，共设12个温度梯度，选择其中最亮的条带所对应的温度为最佳退火温度，结果表明60℃为最佳退火温度。
[0052]
进行上述pcr反应时，同时以ddh2o为模板设置空白对照，待pcr反应结束后，用1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，取5μl的pcr扩增产物上样，以100bpdnaladder和空白阴性对照为参照，3～5v/cm电泳40～50min。检测结果如图1所示，其中泳道1～3为恶臭假单胞菌阳性样本，泳道4为空白对照。由图1可知，阳性样本均扩增出了大小约为241bp的单一条带，表明设计筛选得到的pcr引物pp1和pp2可成功扩增出恶臭假单胞菌的目的片段，可将该引物于检测或鉴定恶臭假单胞菌。
[0053]
4、pcr引物的特异性检测
[0054]
为检测设计筛选所得pcr引物pp1和pp2的特异性，本发明分别以荧光假单胞菌、恶臭假单胞菌、铜绿假单胞菌、莓实假单胞菌、隆德假单胞菌、盖氏假单胞菌、嗜热乳酸杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌和伤寒沙门氏菌，共11种水牛乳中常见污染菌的基因组dna为模板，用pcr引物pp1和pp2进行了扩增反应。结果如图2所示，其中m为100bp dna ladder，泳道1为阴性对照，泳道2所对应的模板为恶臭假单胞菌，泳道3～13所对应的模板依次为莓实假单胞菌、隆德假单胞菌、荧光假单胞菌、铜绿假单胞菌、斡氏假单胞菌、盖氏假单胞菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、发酵乳杆菌、单增李斯特菌和伤寒沙门氏菌。由图2可知，本发明所述pcr引物pp1和pp2仅能扩增出恶臭假单胞菌的目的片段，对其他菌株均无扩增，表明所述引物的特异性强。
[0055]
5、pcr引物的灵敏度检测
[0056]
以提取的恶臭假单胞菌基因组dna为模板并测定其浓度，经测定，dna模板的起始浓度为198.0ng/μl，将基因组dna进行10倍梯度稀释，以不同浓度的恶臭假单胞菌基因组
dna为模板，用pcr引物pp1和pp2进行扩增。结果如图3所示，其中m为100bp dna ladder，泳道1～10对应的dna稀释浓度依次为100～10
‑9ng/μl，泳道11为阴性对照。由图3可知，恶臭假单胞菌的最低核酸检测量为198.0
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‑5ng/μl，表明本发明设计筛选所得pcr引物pp1和pp2的检测灵敏度高。
[0057]
本发明在多次pcr实验过程发现pcr引物pp1和pp2的检测重复性也很好。
[0058]
实施例2实际样品的检测
[0059]
为检测设计筛选所得引物pp1和pp2在实际样品中的检测效果，本发明通过在灭菌水牛乳中分别添加恶臭假单胞菌、莓实假单胞菌和隆德假单胞菌，获得了嗜冷菌污染的水牛乳，用于模拟实际样品用于检测。取20ml灭菌水牛乳，分别添加恶臭假单胞菌、莓实假单胞菌和隆德假单胞菌的菌液各1ml，充分混匀。
[0060]
因水牛乳中含有大量的蛋白质、脂肪等物质，不宜直接使用普通的细菌基因组提取试剂盒提取其中的微生物dna，而商品化的牛奶微生物基因组提取试剂盒，不仅价格贵且提取效率不高，故本发明使用改良过的ctab/蛋白酶k法提取水牛乳中的细菌基因组dna，参照实施例1的pcr检测方法，对提取到的基因组dna进行检测。检测结果如图4所示，其中m为100bp dna ladder，泳道1为恶臭假单胞菌的阳性对照，泳道2为阴性对照，泳道3为人工污染的水牛乳样品。由图4可知，仅恶臭假单胞菌阳性对照和人工污染的水牛乳样品扩增出了大小与预期相符的单一条带，表明本发明所构建的pcr检测方法适用于实际牛乳样本中恶臭假单胞菌的检测。
[0061]
本发明同时采集了广西不同地区的15份新鲜生水牛乳样品，按照上述方法进行了恶臭假单胞菌的pcr检测。检测结果如图5所示，其中泳道1为阴性对照，泳道2为阳性对照，泳道3～17为15个生水牛乳样品。由图5可知，15份样品中生水牛乳中，有8份样品扩增出了大小为241bp左右的单一条带，表明本发明所构建的pcr检测方法适用于实际牛乳样本中恶臭假单胞菌的检测。
[0062]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。