一种可同时鉴别3种实蝇的方法及试剂盒与流程

1.本发明属于昆虫分子生物学领域，具体涉及可同时鉴别3种实蝇的试剂盒及方法。


背景技术：

2.实蝇类害虫隶属于双翅目diptera实蝇科tephritidae，其种类繁多，涵盖至少500个属4500余种，其中约250种实蝇对农业生产造直接损失，是一类主要危害瓜果蔬菜等经济作物的重要害虫及检疫性害虫。实蝇雌成虫喜产卵于瓜果表皮下，卵在果实内部孵化后幼虫于果内蛀蚀果肉，使果实腐烂、脱落、变质等，给农业生产带来了巨大损失。对上述三种实蝇进行精准防控，于实蝇定居或爆发之前将其彻底根除或加以封锁，以达最大防控效果，对提高农业生产力和保障农民经济收入具有重大意义。
3.害虫检测监测是害虫综合防治过程中重要环节之一，及时检测害虫发生种类，监测害虫发生规律，可以适当了解害虫发生种类、成灾规律等，可有效的制定合理的、针对性的害虫防治方案，从而避免不必要的防治和经济损失，提高防治效率。长期以来实蝇的种类检测鉴定主要通过直接捕捉成虫或将幼虫饲养至成虫，然后根据成虫外部形态特征进行鉴定，此方法操作简便，较为直观，但由于对样本虫体的完整性、虫态及鉴定人员经验要求较高，一般非专业人员难以通过形态学进行鉴定，另外亲缘关系较近的复合种和隐种间在形态学上仍然难以区分。随着分子生物学技术的快速发展，限制性片段长度多态性(rflp)、微卫星技术ssr、pcr技术、随机扩增多态性dna技术(rapd)、扩增片段长度多态性技术(aflp)、核酸序列分析等分子技术广泛应用于实蝇类害虫的分类鉴定中。各种分子生物学技术在为实蝇类害虫的检疫检测提供更高效快速的鉴定手段的同时，也存在着自身的缺点，如ssr技术不同物种间保守性较差，引物筛选过程复杂，不利于大量样本检测；aflp技术分析成本高、对样本dna质量要求较高等。因此综合利用各种鉴定技术，针对实蝇建立一套省时、准确的鉴定技术，且在保证鉴定准确的情况下减少费用及鉴定程序成为迫切需求。
4.限制性片段长度多态性(rflp，restriction fragment length polymorphism)是利用限制性内切酶切割不同目的dna，通过电泳分离被限制性内切酶切割的dna片段序列，然后根据dna酶切位点数目和位置，以及片段数目和大小变化变化差异来进行分析的方法。
5.线粒体dna细胞色素氧化酶亚基i因子(cytochrome oxidasei，coi)是线粒体基因的一种，具有结构简单，分子量小，严格的执行母系遗传，进化快，无重组，检测方便等优点，可作为有效的分子标记。因此，它已被广泛用于动物的系统发育，物种鉴定和群体遗传多样性，利用线粒体细胞色素氧化酶亚基i因子(coi)基因序列在不同实蝇间存在序列差异可以准确识别不同实蝇类害虫种类，而且不受虫体和虫态的限制。相比采用mtco1基因直接测序，较为省时。
6.限制性核酸内切酶是可以识别并附着特定的脱氧核苷酸序列，并对每条链中特定部位的两个脱氧核糖核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一类酶，简称限制酶。利用coi基因在不同生物型中的序列差异，利用不同限制酶对coi片段进行酶切，使其分割为不同大小的片段，最后通过凝胶电泳分析dna片段大小，是简单有效的鉴定方法。


技术实现要素：

7.本发明的目的是针对目前国内瓜果蔬菜上发生危害严重的瓜实蝇、南亚果实蝇橘小实蝇的幼虫难以区分鉴定的问题，提出一种不受虫态和虫体限制，操作简单的快速鉴定瓜实蝇、南亚果实蝇和橘小实蝇的试剂盒及方法。本发明解决了瓜果蔬菜上发生危害严重，且难以区分的瓜实蝇、橘小实蝇和南亚果实蝇快速识别鉴定的问题，建立了基于coi基因的pcr
‑
rflp鉴定技术。
8.本发明采用限制性核酸内切酶对实蝇mtcoi基因片段进行酶切，通过酶切后mtcoi基因片段大小来快速鉴定3种实蝇，成功建立一套成熟的pcr
‑
rflp鉴定技术。本发明解决的技术问题是提供一种可同时区分瓜实蝇、南亚果实蝇和橘小实蝇的方法及试剂盒，本发明方法能准确的将3种不同实蝇区分开来，具有很高的时效性和良好的重复性，在保证鉴定结果准确度的同时，更高效快捷，大幅节约了鉴定时间。
9.本发明提供的技术方案是：一种同时鉴别瓜实蝇、南亚果实蝇和橘小实蝇3种实蝇的方法，包括如下步骤：
10.1)实蝇基因组dna的提取；
11.2)pcr扩增mtcoi基因片段：取得到的实蝇dna为模板，采用下述通用型引物进行pcr扩增：
12.lco1490:5
′‑
ggtcaacaaatcataaagatattg
‑3′
13.hco2198:5
′‑
taaacttcagggtgaccaaaaaatca
‑3′
14.3)dna质量检测：利用琼脂糖凝胶电泳检测第2步所得pcr产物片段是否存在dna条带及dna条带大小。
15.4)限制性核酸内切酶鉴定：分别采用限制性核酸内切酶sapⅰ、bsmⅰ和sacⅰ对pcr产物进行酶切。
16.所述方法步骤中的实蝇总dna提取方法如下：
17.参照de barro和driver(1997)和frohlich(1999)等烟粉虱总dna提取方法，并略作改动来提取实蝇总dna。具体方法如下：实蝇样品用75％酒精保存，取单头实蝇，用ddh2o清洗后，用滤纸吸干放入1.5ml离心管中，加入一粒直径2mm的研磨株，最后加入60ul的dna提取混合液,将离心管放入研磨器中研磨(70hz，60
‑
90s)。研磨后8000rpm短暂离心1min，将上清液转入pcr管中，放入pcr仪中进行酶促反应。
18.pcr反应程序：75c
°
蛋白酶裂解10分钟，95c
°
灭活酶5分钟。
19.上述反应产物即可作为分析鉴定实蝇种类的pcr模板，置于
‑
20c
°
冰箱长期保存。
20.dna提取混合液：使用kapa express extract dna extraction kit提取实蝇的总dna，反应体系为60μl：
21.表1 dna提取混合液反应体系
[0022][0023]
所述方法中pcr扩增mtcoi基因片段的pcr反应体系如下：
[0024]
表2 pcr反应体系
[0025][0026]
所述方法中pcr扩增mtcoi基因片段的pcr反应程序如下：
[0027]
表3 pcr反应程序
[0028][0029][0030]
所述方法步骤中的实蝇dna质量检测方法如下：
[0031]
利用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测第2步所得pcr产物片段是否存在dna条带及dna条带大小。电泳电压为150v，电泳时间为25min左右，琼脂糖在凝胶成像系统上检测是否存在dna条带以及dna条带大小，三种实蝇mtcoi基因目的dna片段长度约700bp(图1)。
[0032]
所述方法中限制性核酸内切酶鉴定，酶切反应体系如下：
[0033]
表4酶切反应体系
[0034][0035]
用sapⅰ于37℃条件下进行酶切1min30sec小时，或sacⅰ于37℃条件下进行酶切1min30sec小时，或用bsmⅰ于65℃条件下进行酶切1min30sec小时，通过琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物片段的大小来鉴定实蝇种类。
[0036]
所述方法中，所述3种实蝇按下述标准区分
[0037]
表5三种实蝇的电泳检测酶切产物片段大小
[0038][0039][0040]
本发明还同时提供一种引物对在制备同时鉴别瓜实蝇、南亚果实蝇和橘小实蝇的试剂中的应用，其中，所述引物对为：
[0041]
lco1490:5
′‑
ggtcaacaaatcataaagatattg
‑3′
[0042]
hco2198:5
′‑
taaacttcagggtgaccaaaaaatca
‑3′
[0043]
进一步地，本发明还提供用于同时鉴别瓜实蝇、南亚果实蝇和橘小实蝇3种实蝇种类试剂盒，其包含通用引物对：
[0044]
lco1490:5
′‑
ggtcaacaaatcataaagatattg
‑3′
[0045]
hco2198:5
′‑
taaacttcagggtgaccaaaaaatca
‑3′
；
[0046]
实蝇dna的提取试剂；以及限制性内切酶sapⅰ、bsmⅰ和sacⅰ。优选地，还包括用于酶切的相关试剂，进一步还包括进行电泳检测的试剂。
[0047]
本发明方法相对于其他实蝇鉴定方法的优势如下：
[0048]
实蝇类害虫主要以雌成虫产卵于新鲜瓜果表皮下，对果实造成机械损伤，有利于病原菌侵入，卵在果实内部孵化后幼虫于果内蛀蚀果肉，使果实腐烂、脱落、变质等，造成严重危害。实蝇成虫和幼虫之间都极为相似，传统形态学鉴定方法只能通过对外表特征的分析鉴定成虫，受虫态及虫体完整性限制，且一般非专业人士难以区分，容易出现偏差；利用基因组测序鉴定花费时间成本经济成本都较高，难以推广等。本发明人首先利用线粒体细
胞色素氧化酶亚基i因子(coi)基因序列在不同实蝇间存在序列差异，进而利用限制性内切酶识别特异性酶切位点可以将瓜实蝇、南亚果实蝇和橘小实蝇3种实蝇的coi基因片段切割为大小不同的片段，最后经由琼脂糖凝胶电泳可以快速的对3种实蝇进行识别鉴定。本发明方法基于coi基因在不同实蝇体内的特异性，利用三种不同的限制性内切酶准确的将3种不同实蝇区分开来，具有高效、快速、准确和重复性好等特点。此外本发明方法所用到的限制性内切酶用量非常少，约0.1μl/头，在保证鉴定结果准确度的同时，更高效快捷，大幅节约了鉴定时间(4h可完成鉴定)和成本，具有很好的应用前景。
附图说明
[0049]
图1本发明方法中瓜实蝇、南亚果实蝇和橘小实蝇的线粒体coⅰ基因序列pcr扩增产物电泳图谱，其中，m2：分子质量标准dna ladder makerⅱ；1、2：bactrocera cucurbitae(瓜实蝇)；3、4：bactrocera tau(walker)(南亚果实蝇)；5、6：bactrocera dorsalis(hendel)(橘小实蝇)。
[0050]
图2为本发明方法中sapⅰ酶切不同实蝇的mtcoⅰpcr产物后琼脂糖凝胶电泳图谱，其中，m2：分子质量标准dna ladder makerⅱ；1、2：bactrocera cucurbitae(瓜实蝇)；3、4：bactrocera tau(walker)(南亚果实蝇)；5、6：bactrocera dorsalis(hendel)(橘小实蝇)。
[0051]
图3为本发明方法中bsmⅰ酶切不同实蝇的mtcoⅰpcr产物后琼脂糖凝胶电泳图谱，其中，m2：分子质量标准dna ladder makerⅱ；1、2：bactrocera cucurbitae(瓜实蝇)；3、4：bactrocera tau(walker)(南亚果实蝇)；5、6：bactrocera dorsalis(hendel)(橘小实蝇)。
[0052]
图4为本发明方法中sacⅰ酶切不同实蝇的mtcoⅰpcr产物后琼脂糖凝胶电泳图谱，其中，m2：分子质量标准dna ladder makerⅱ；1、2：bactrocera cucurbitae(瓜实蝇)；3、4：bactrocera tau(walker)(南亚果实蝇)；5、6：bactrocera dorsalis(hendel)(橘小实蝇)。
具体实施方式
[0053]
下面通过具体实施方式的详细描述来进一步阐明本发明。
[0054]
实蝇类害虫隶属于双翅目diptera实蝇科tephritidae，是一类主要危害瓜果蔬菜等经济作物的重要害虫。其种类繁多，涵盖至少500个属4500余种，其中约250种实蝇可造成农业生产上的经济损失，且多种实蝇还是海关口岸的重要检疫性害虫。
[0055]
瓜实蝇俗称“针蜂”，广泛分布于亚热带和热带地区，在我国分布于江苏、福建、广东、贵州、北京、河北等省区，是我国二类检疫害虫，可危害125多种蔬菜和水果，主要危害西葫芦、苦瓜、甜瓜、黄瓜、菜豆和番茄等葫芦科作物和茄科植物。
[0056]
南亚果实蝇称为南瓜实蝇和南亚寡鬃实蝇，主要分布于旧大陆的亚洲热带、亚热带和温带地区，在我国于1849年在福建省首次发现并记载，广泛分布于浙江、湖北、江西、福建、海南、云南等省区。南亚果实蝇是一种世界性入侵害虫，最早在我国南方发生危害，是我国检疫性害虫之一。该虫寄主广泛，可危害16科80多种作物，主要寄主为甜瓜、苦瓜、丝瓜、南瓜等葫芦科以及茄科作物，主要以幼虫潜居果内危害为主。
[0057]
橘小实蝇又名东方果实蝇，该虫现主要分布于亚洲、南太平洋热带和暖温带地区及夏威夷群岛一带。在我国，1911年首次于台湾发现，1937年首次在大陆发现并记载，主要分布于我国南方，如广西、云南、四川、福建等省区。橘小实蝇是一种世界性检疫害虫，其繁
殖能力强、食性杂、寄主广，可危害40多科250余种水果和蔬菜，主要寄主为柑橘类、番石榴、茄子、辣椒、瓜类等，主要以幼虫危害为主，被称为世界果蔬的“头号杀手。
[0058]
实验材料和方法
[0059]
供试昆虫
[0060]
瓜实蝇、南亚果实蝇和橘小实蝇样本均由华南农业大学植物保护学院昆虫系教授何余容老师提供。
[0061]
供试试剂
[0062]
kapa express extract dna extraction kit(kk7103)(北京普凯瑞生物科技有限公司)；2
×
taq pcr预混试剂ⅱ(kt211)(天根生化科技(北京)有限公司)；dna markerⅱ分子量标准(天根生化科技(北京)有限公司)；dd h2o；限制性内切酶sapi(r0569s)(北京百灵克生物科技有限公司)；限制性内切酶bsmi(r0134s)(北京百灵克生物科技有限公司)；限制性内切酶saci(r3156s)(北京百灵克生物科技有限公司)；琼脂糖(北京擎科)。其它实验室常用化学试剂(分析纯)均为市售。引物(上游lco1490；下游hco2198，序列见下文)，均由北京擎科生物技术公司进行合成。
[0063]
主要器材
[0064]
1.5ml离心管；研磨珠；pcr仪(bio
‑
rad s1000)；离心机(eppendorf 5417r)；水浴锅(北京六一制造厂)；电泳仪和凝胶成像系统(bio
‑
rad)；恒温箱和高压灭菌锅(sanyo)；组织研磨仪(上海净信科技)；移液器(eppendorf)；超纯水仪(zmq55voti mini q)。
[0065]
1.实蝇总dna的提取
[0066]
使用kapa express extract dna extraction kit提取实蝇总dna，具体步骤如下：
[0067]
1)实蝇样品用75％酒精保存，取单头实蝇成虫或幼虫，用ddh2o清洗后，用滤纸吸干放入1.5ml离心管中。
[0068]
2)向实蝇样品中加入一粒直径2mm的研磨株和60ul的dna提取混合液，于预冷的组织研磨仪中研磨(70hz，60
‑
90s)，使其充分匀浆。
[0069]
3)研磨后8000rpm短暂离心30s，将上清液转入pcr管中，放入pcr仪中进行酶促反应。
[0070]
4)pcr反应程序：75c
°
蛋白酶裂解10分钟，95c
°
灭活酶5分钟。
[0071]
dna提取混合液：使用kapa express extract dna extraction kit提取实蝇总dna，反应体系为30μl：ddh2o(26.5μl)；buffer(3.0μl)；酶(0.5μl)。
[0072]
2.pcr扩增mtcoi基因片段
[0073]
mtcoi基因是一个线粒体基因，具有结构简单，分子量小，严格的执行母系遗传，进化快，无重组，检测方便等优点，可作为有效的分子标记。在实蝇中，不同种具有不同的coi基因序列。由此，本发明人针对该基因开展实蝇种类的鉴定实验。
[0074]
由于需同时鉴定瓜实蝇、南亚果实蝇和橘小实蝇这3种实蝇，则对于mtcoi基因片段的扩增，其引物需求较高，该引物对需能同时扩增出上述3种实蝇的mtcoi基因，因此，依据昆虫mtcoi条形码常用引物，并参考dna条形码coi基因的通用型引物(armstrong and ball,2005)，采用实蝇通用型引物对lco1490和hco2198，以提取的实蝇dna为模板进行pcr扩增，其中pcr反应体系见表2，pcr反应程序见表3，扩增mtcoi基因片段的pcr引物对，其序
列如下：
[0075]
lco1490:5
′‑
ggtcaacaaatcataaagatattg
‑3′
[0076]
hco2198:5
′‑
taaacttcagggtgaccaaaaaatca
‑3′
。
[0077]
3.dna质量检测：
[0078]
利用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测第2步所得pcr产物片段是否存在dna条带及dna条带大小。电泳电压为150v，电泳时间为25min左右，琼脂糖在凝胶成像系统上检测是否存在dna条带以及dna条带大小，三种实蝇mtcoi基因目的dna片段长度约700bp(图1)。
[0079]
4.限制性内切酶酶切
[0080]
将上一步得到的coi基因片段分别用sapi(酶切位点gctcttcn/)、bsmi(酶切位点gaatgcn/)、saci(酶切位点gagct/c)三种不同的限制性内切酶进行酶切，酶切体系见表4，sapi和saci在37c
°
条件下酶切1min30sec，bsmi在65c
°
条件下酶切1min30sec。酶切后利用凝胶电泳图谱来分析酶切产物片段大小，进而区分实蝇种类。
[0081]
4.凝胶电泳图谱鉴定实蝇生物型
[0082]
1)凝胶制备：取1.5g琼脂，加入100ml tbe缓冲液，微波炉加热5min，加入核酸染料混匀后，倒入制胶板中，制备1.5％的琼脂糖凝胶一块，tbe缓冲液配方如表6。20min后取出制备好的凝胶，放入加有tbe缓冲液的电泳仪中，以待点样。
[0083]
表6凝胶组成
[0084][0085][0086]
2)凝胶电泳：取5μl酶切产物按顺序进行点样，使用dna markerⅱ作为对照，设置电泳仪电压150v，时间25min，结束后取出凝胶。
[0087]
3)凝胶成像：取电泳结束后的凝胶，放入凝胶成像仪内，运行软件，在紫外下进行拍摄，不同实蝇生物型酶切后条带大小不一(表5)，依据电泳图谱可确定实蝇种类(图1
‑
4)。具体酶切步骤：
①
首先参考dna条形码coi基因的通用型引物(armstrong and ball,2005)进行pcr扩增对提取的实蝇dna模板进行pcr扩增，对实蝇样本dna的质量进行检测，琼脂糖凝胶电泳结果表明,实蝇dna均能扩增出单一且清晰的,长度约700bp的目标条带(图1)；
②
然后利用限制性内切酶sapi(酶切位点gctcttcn/)对3种实蝇进行酶切，将3种实蝇分为2类，第一类是瓜实蝇和南亚果实蝇，二者的特征条带为约550bp和150bp的两条带；第二类是橘小实蝇，特征条带为700bp左右的一条亮带(图2)；
③
然后利用限制性内切酶bsmi(酶切位点gaatgcn/)对第一类实蝇进行酶切区分，瓜实蝇可被酶切开，特征条带为约450bp和250bp的两条带，南亚果实蝇不能被bsmi酶切，特征条带为700bp左右的一条亮带(图3)；
④
最后利用限制性内切酶saci(酶切位点gagct/c)对第二类实蝇酶切鉴定，结果显示，橘小实蝇可被限制性内切酶saci酶切，特征条带为约450bp和250bp的两条带，瓜实蝇和南亚果实蝇不能被saci酶切，特征条带为700bp左右的一条亮带(图4)。
[0088]
两种实蝇鉴定方法的比较
[0089]
分别利用本发明方法和传统的直接测序鉴定法对3种实蝇进行鉴定，每个种群取10头实蝇。实验结果表明，两种鉴定方法鉴定实蝇准确度皆是100％，且本发明方法仅用时4h，所需时间相较测序鉴定大幅下降(测序鉴定所需时间需要依据测序花费时间来定，一般超过36h)。