一种DNA二代测序文库的构建方法与流程

技术特征：
1.一种dna二代测序文库的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：s1、基因组dna的酶切、末端修复和加a：首先，利用两种常见的限制性内切酶对基因组dna进行双酶切消化，得到酶切片段；接着，利用聚合酶对酶切片段进行末端修复和dna的3’端加a，得到dna加a产物；s2、使用连接酶，将所述dna加a产物与dna的5’端带有突出t的接头连接在一起，得到含“接头－dna插入片段－接头”形式的dna片段；s3、通过第一次纯化处理，将所述dna片段回收，得到目标dna片段；s4、以回收的所述dna片段作为模板进行pcr扩增，以富集所述目标dna片段，构建并获得dna二代测序文库。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤s1中，两种所述限制性内切酶分别是vvn和t7。3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤s1中，所述聚合酶为taq dna聚合酶。4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤s1中，所述基因组dna的酶切反应温度为37℃，反应时间为20－30min；所述加a反应温度为65℃，反应时间为20－30min。5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤s2中，所述连接酶为t4dna连接酶。6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤s2中，所述接头连接的反应温度为20℃，反应时间为20－30min。7.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤s3中，所述第一次纯化处理包括如下步骤：s31、所述接头连接反应结束后，将所述dna片段置于离心管中，加入72μl dna磁珠，吹打混匀或震荡低速混匀所述dna片段，低速离心甩掉离心管管壁和盖子上的液滴，使磁珠均匀分散在溶液中，室温反应5min；s32、将ep管插入磁力架的管孔里，待磁珠吸附完全所述dna片段且溶液变澄清之后，吸去离心管中的溶液；s33、吸取200μl 80v/v％的乙醇于ep管，期间轻轻旋动ep管两圈，每次半圈，使磁珠在离心管管壁上移动；s34、重复上一步骤s33；s35、快速离心数s，让离心管管壁液体甩到管底；待磁珠吸附全所述dna片段后，用枪吸取离心管中的溶液；s36、室温晾3min，让残留乙醇蒸发；s37、吸取22μl dna洗脱液：从有磁珠一侧加入，将磁珠冲入离心管管底；然后反复吹打或震荡低速将磁珠混匀所述dna片段，室温反应5min；s38、将ep管插入磁力架的管孔里，待磁珠吸附完全所述dna片段且溶液变澄清之后，用移液枪吸取20μl于新的pcr管中得到纯化后的目标dna片段。8.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤s4中，所述pcr扩增处理包括如下步骤：s41、往pcr管中加入pcr酶混合液、pcr引物混合液，进行dna片段的pcr扩增反应，以富
集所述目标dna片段；s42、待pcr扩增反应结束后，回收pcr扩增产物，对pcr扩增产物的dna片段进行选择和第二次纯化处理后，得到dna二代测序文库。9.根据权利要求8所述的构建方法，其特征在于，步骤s41中，所述pcr扩增反应中，根据反应阶段，其反应温度和反应时间如下：1)预变性阶段：反应温度为95℃时，反应时间为3min；2)变性阶段：反应温度为95℃时，反应时间为20s；3)退火阶段：反应温度为58℃时，反应时间为20s；4)延伸阶段：反应温度为72℃时，反应时间为20s；5)终延伸阶段：反应温度为72℃时，反应时间为5min；6)保存阶段：反应温度为4℃；其中；第2)至4)阶段，分别需要执行10－14个循环；第1)和第5)阶段，各执行1次。10.根据权利要求8所述的构建方法，其特征在于，步骤s42中，pcr扩增反应结束后，还包括对dna片段的选择和第二次纯化步骤如下：s421、反应结束后，补水至100μl，再加入80μl dna磁珠，吹打混匀或震荡低速混匀pcr扩增产物，低速离心甩掉离心管管壁和盖子上的液滴，使磁珠均匀分散在溶液中，室温反应5min，期间可轻弹离心管管底使磁珠均匀分布；s422、将ep管插入磁力架的管孔里，待磁珠吸附完全pcr扩增产物且溶液变澄清之后，转移溶液至含有40μl dna磁珠的低吸附管，吹打混匀或震荡低速混匀pcr扩增产物，低速离心甩掉离心管管壁和盖子上的液滴，使磁珠均匀分散在溶液中，室温反应5min；s423、将ep管插入磁力架的管孔里，待磁珠吸附完全pcr扩增产物且溶液变澄清之后，弃上清，并加入200μl 80v/v％的乙醇于ep管，期间轻轻旋动ep管两圈，每次半圈，使磁珠在离心管管壁上移动；s424、重复上一步骤s423；s425、快速离心数s，让离心管管壁液体甩到管底；待磁珠吸附全所述pcr扩增产物后，用枪吸取离心管中的溶液；s426、室温晾3min，让残留乙醇蒸发；s427、吸取22μl dna洗脱液：从有磁珠一侧加入，将磁珠冲入离心管管底；然后反复吹打或震荡低速将磁珠混匀pcr扩增产物，室温反应5min；s428、将ep管插入磁力架的管孔里，待磁珠吸附完全pcr扩增产物且溶液变澄清之后，用移液枪吸取20μl于新的ep管中，得到dna二代测序文库。

技术总结
本发明公开了一种DNA二代测序文库的构建方法，包括步骤：基因组DNA的酶切、末端修复和加A；DNA片段接头连接；接头连接后产物的磁珠纯化处理；DNA片段PCR扩增、PCR产物片段的选择与纯化处理。本发明提供的DNA二代测序文库构建方法，以双酶切和末端修复一步反应工艺，使用VVN和T7将片段进行片段化处理，再利用Taq DNA聚合酶的聚合作用将5’突出补平，然后再3’加上A(腺嘌呤)，整合一步反应的实现构建DNA二代测序文库，第一步反应结束无需进行磁珠纯化，使得构建工艺简单；该工艺制备中，两种限制性内切酶没有偏好性，可实现目标片段测序。可实现目标片段测序。可实现目标片段测序。


技术研发人员：梁志坤 蒋析文 温慧敏 吴轶兰
受保护的技术使用者：广州达安基因股份有限公司
技术研发日：2021.08.25
技术公布日：2021/10/18