一种DNA二代测序文库的构建方法与流程

一种dna二代测序文库的构建方法
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种dna二代测序文库的构建方法。


背景技术：

2.基因测序仪是测序产业链的起点，也是关键环节，它为整个中下游测序服务提供最基本的测序支撑，同时也是壁垒最高的部分，处于基因测序产业价值链顶端。
3.目前主要的测序上游供应商依然以海外为主，各巨头之间的竞争也异常激烈。在1986年applied biosystem公司第一台商用自动测序仪的发布吹响了抢占市场份额的号角。1986年至2005年间，测序仪市场竞争相对缓和，基本由abi公司占领市场，整体市场份额也相对较小，并未完全打开。2005年，454lifesciences公司推出454gs 20测序仪；2006年，illumina收购solexa；2006年，abi公司推出solid测序平台。二代测序仪逐步进入市场，迅速抢占市场份额的同时，也进一步提高需求量，扩大整体市场容量。随后的十年间，各大巨头争相并购优秀企业，逐步完善测序技术，产品推陈出新，市场规模被迅速扩大。
4.二代测序仪具有高通量、低成本、数据稳定可靠等优点，成为测序仪领域的主要贡献者。经过了十年左右的发展成熟，逐渐形成以illumina公司为领头羊，以thermo fisher和roche为主要玩家的市场格局，近几年，华大基因也推出自主研发的基因测序仪。由于测序仪技术壁垒极高，市场极度集中，这国内测序仪市场主要被以上几家公司占领，其中illumina公司产品独占鳌头，行业一致认为illumina占据了全球70－80％的市场份额。
5.不同的测序平台会在技术细节上有许多不同，但他们都有以下几个共同点：
6.1、文库建立：所有二代测序的平台都需要一个基因文库，这个基因文库包含通过引申或者连接自定义的接头序列。
7.2、测序仪器：每个文库片段在共阶吸附的dna连接因子的作用下，以文库适配序列为模版，在固体表面上进行扩增；这步扩增会产生许多dna蔟，每个来源于一个文库片段，每个基因蔟都会像独立的测序反应一样起作用。
8.3、数据输出：每个仪器都会在测序结束后给出原始数据。这个原始数据时每个基因蔟中形成的dna序列的集合。
9.制备测序基因文库是最初始的一步，文库就是一个包含你所要测序的所有基因序列的集合体。再将这些片段化后得到的所有短序列的两端加上接头，从而将要测序的序列制备成为一个有很多拥有相同双端序列，但内部序列不同的序列片段集合体。
10.以illumina平台为例，参阅附图1所示，现有常规建库流程包括如下步骤：
11.(1)首先将要测序的序列或者基因组等使用物理机械(超声波打断)或者或者是酶学方法处理，即可得到片段化后的dna序列，每个片段大概200－300bp。
12.(2)片段化后的序列很大几率是拥有末端凸出的序列，并不是完整的配对状态，因此需要使用酶将其末端补平。
13.(3)再使用酶在序列的平末端两端各加上一个a(腺嘌呤)尾。
14.(4)通过上一步加上的a尾，illumina公司制作的接头(adapter)很容易加在序列
的两端。
15.(5)通过上面的步骤，制作步骤就结束了。
16.上述常规步骤建库流程，需要提升测序序列的数量，从而提高测序的准确性，才能使得后续的序列拼接步骤较为方便。最后还需要进行pcr操作扩增基因文库中序列的数量；又由于每个序列的两端都有接头，且设计的引物只需要和接头配对即可。
17.上述二代测序建库技术对于长片段的片段处理，主要有机械打断和酶法打断，片段打断后再利用t4dna聚合酶将片段进行末端修复，产生平末端，利用t4pnk将5’端进行磷酸化，再利用taq dna聚合酶在3’端加上a(腺嘌呤)。但是，现有的二代测序文库构建中，片段化、末端修复和加a步骤无法一体化进行，或者可以一体化完成的又存在一定程度的模板量放大，缺少内标用于建库、测序环节的质控，以及对结果进行矫正等。因此，针对现有技术，开发一种简化的dna二代测序建库方法，实现对建库、测序环节进行质控和对结果进行矫正，将非常有实用价值。


技术实现要素：

18.基于上述问题，本发明所要解决的问题在于提供一种双酶切和末端修复一步反应的dna二代测序文库的构建方法。
19.本发明的技术方案如下：
20.一种dna二代测序文库的构建方法，包括如下步骤：
21.s1、基因组dna的酶切、末端修复和加a：首先，利用两种常见的限制性内切酶对基因组dna进行双酶切消化，得到酶切片段；接着，利用聚合酶对酶切片段进行末端修复和dna的3’端加a，得到dna加a产物；
22.s2、使用连接酶，将所述dna加a产物与dna的5’端带有突出t的接头连接在一起，得到含“接头－dna插入片段－接头”形式的dna片段；
23.s3、通过第一次纯化处理，将所述dna片段回收，得到目标dna片段；
24.s4、以回收的所述dna片段作为模板进行pcr扩增，以富集所述目标dna片段，构建并获得dna二代测序文库。
25.一实施例，所述构建方法的步骤s1中，两种所述限制性内切酶分别是vvn和t7。
26.一实施例，所述构建方法的步骤s1中，所述聚合酶为taq dna聚合酶。
27.一实施例，所述构建方法的步骤s1中，所述基因组dna的酶切反应温度为37℃，反应时间为20－30min；所述加a反应温度为65℃，反应时间为20－30min。
28.一实施例，所述构建方法的步骤s2中，所述连接酶为t4dna连接酶。
29.一实施例，所述构建方法的步骤s2中，所述接头连接的反应温度为20℃，反应时间为20－30min。
30.一实施例，所述构建方法的步骤s3中，所述第一次纯化处理包括如下步骤：
31.s31所述接头连接反应结束后，将所述dna片段置于离心管中，加入72μldna磁珠(0.9x)，吹打混匀或震荡低速混匀所述dna片段，低速离心甩掉离心管管壁和盖子上的液滴，使磁珠均匀分散在溶液中，室温反应5min，期间可轻弹管底使磁珠均匀分布；若液体弹到离心管管壁上，轻轻甩动离心管或低速离心，使液体处于离心管管底；
32.s32将ep管插入磁力架的管孔里，待磁珠吸附完全所述dna片段且溶液变澄清之
后，用中枪头吸去离心管中的溶液；注意不要吸到磁珠，ep管留在磁力架上。
33.s33吸取200μl 80v/v％的乙醇于ep管，期间轻轻旋动ep管两圈，每次半圈，使磁珠在离心管管壁上移动；吸去溶液时，注意不要吸到磁珠。
34.s34重复上一步骤s33；
35.s35快速离心数s，让离心管管壁液体甩到管底；将管子放回磁架管孔里，待磁珠吸附全后所述dna片段，用枪吸取溶液；
36.s36室温晾3min，让残留乙醇蒸发；注意：晾干时须常观察磁珠干湿程度，如磁珠过湿须延长空气烘干时间；避免磁珠过度干燥，磁珠干燥后表面无水渍，如磁珠有裂纹出现须盖好管盖，并立即进行下步实验操作；
37.s37吸取22μl dna洗脱液：从有磁珠一侧加入，将磁珠冲入离心管管底；然后反复吹打或震荡低速将磁珠混匀所述dna片段，室温反应5min；等待的同时，准备好下面步骤需要的pcr反应混合溶液，标记为mix3，并吸取50μl于各新的0.2ml的pcr管中；
38.s38将ep管插入磁力架的管孔里，待磁珠吸附完全所述dna片段且溶液变澄清之后，用移液枪吸取20μl于新的pcr管中(注意不能吸到磁珠)，获得纯化后的目标dna片段。
39.一实施例，所述构建方法的步骤s4中，所述pcr扩增处理包括如下步骤：
40.s41、往pcr管中加入pcr酶混合液、pcr引物混合液，进行dna片段的pcr扩增反应，以富集所述目标dna片段；
41.s42、待pcr扩增反应结束后，回收pcr扩增产物，对pcr扩增产物的dna片段进行选择和第二次纯化处理后，得到dna二代测序文库。
42.一实施例，所述构建方法的步骤s41中，所述pcr扩增反应中，根据反应阶段，其反应温度和反应时间如下：
43.1)预变性阶段：反应温度为95℃时，反应时间为3min；
44.2)变性阶段：反应温度为95℃时，反应时间为3min；
45.3)退火阶段：反应温度为58℃时，反应时间为20s；
46.4)延伸阶段：反应温度为72℃时，反应时间为20s
47.5)终延伸阶段：反应温度为72℃时，反应时间为5min；
48.6)保存阶段：反应温度为4℃；
49.其中；第2)至4)阶段，分别需要执行10－14个循环；第1)和第5)阶段，各执行1次。
50.一实施例，所述构建方法的步骤s42中，pcr扩增反应结束后，还包括对dna片段的选择和第二次纯化步骤如下：
51.s421反应结束后，补水至100μl，再加入80μl dna磁珠(0.8x)，吹打混匀或震荡低速混匀pcr扩增产物，低速离心甩掉离心管管壁和盖子上的液滴，使磁珠均匀分散在溶液中，室温反应5min，期间可轻弹离心管管底使磁珠均匀分布；若液体弹到离心管管壁上，轻轻甩动离心管或低速离心，使液体处于离心管管底；
52.s422将ep管插入磁力架的管孔里，待磁珠吸附完全pcr扩增产物且溶液变澄清之后，用中枪头转移溶液至含有40μl dna磁珠(0.4x)的低吸附管，吹打混匀或震荡低速混匀pcr扩增产物，低速离心甩掉离心管管壁和盖子上的液滴，使磁珠均匀分散在溶液中，室温反应5min；期间可轻弹管底使磁珠均匀分布，若液体弹到离心管管壁上，轻轻甩动离心管或低速离心，使液体处于离心管管底；
53.s423将ep管插入磁力架的管孔里，待磁珠吸附完全pcr扩增产物且溶液变澄清之后，弃上清，并加入200μl 80v/v％的乙醇于ep管，期间轻轻旋动ep管两圈，每次半圈，使磁珠在离心管管壁上移动；吸去溶液时，注意不要吸到磁珠；
54.s424重复上一步骤s423；
55.s425快速离心数s，让管壁液体甩到离心管管底；将管子放回磁架管孔里，待磁珠吸附全pcr扩增产物后，用枪吸取溶液；
56.s426室温晾3min，让残留乙醇蒸发；注意：晾干时须常观察磁珠干湿程度，如磁珠过湿须延长空气烘干时间；避免磁珠过度干燥，磁珠干燥后表面无水渍，如磁珠有裂纹出现须盖好管盖，并立即进行下步实验操作；
57.s427吸取22μl dna洗脱液：从有磁珠一侧加入，将磁珠冲入离心管管底；然后反复吹打或震荡低速将磁珠混匀pcr扩增产物，室温反应5min；
58.s428将ep管插入磁力架的管孔里，待磁珠吸附完全pcr扩增产物且溶液变澄清之后，用移液枪吸取20μl于新的ep管中(注意不能吸到磁珠)，得到dna二代测序文库。
59.本发明提供的dna二代测序文库构建方法，利用高通量测序技术的文库构建流程，以双酶切和末端修复一步反应工艺，使用vvn和t7将片段进行片段化处理，再利用taq dna聚合酶的聚合作用将5’突出补平，然后再3’加上a(腺嘌呤)，整合一步反应的实现构建dna二代测序文库。加a尾整合到一步反应，同时能够兼容连接反应体系，第一步反应结束无需进行磁珠纯化，使得构建工艺简单；该工艺制备中，对两种限制性内切酶没有编好性，可实现测序长片段。
附图说明
60.图1为现有常规dna建库工艺流程图；
61.图2为本发明的dna二代测序文库构建工艺流程图；
62.图3为本发明的dna插入片段接头结构示意图。
具体实施方式
63.下面结合附图，对本发明的较佳实施例作进一步详细说明。
64.高通量测序技术(high－throughput sequencing)又称“下一代”测序技术(＂next－generation＂sequencing technology)或二代测序，一次能并行对几十万到几百万条dna分子进行序列测定，一般读长较短。高通量测序技术应用流程主要包括样本准备，文库构建，测序反应和数据分析。
65.本发明的dna测序技术主要用于高通量测序技术的文库构建流程。一个完整的二代测序的文库就是含有双链dna(或cdna)的集合，其中每一段dna的5’－接头和3’－接头序列是固定的，而中间的插入片段(dna)是可以变化的。因此，本发明测序文库的构建主要是围绕如何给未知序列的上下游加上特定的接头序列，加入测序引物及标签序列(indexs)，并对其进行pcr(polymerase chainreaction，聚合酶链反应)富集的过程。
66.如图2所示，本发明提供的一种dna二代测序文库的构建方法，其工艺步骤如下：
67.s1、基因组dna的酶切、末端修复和加a。
68.该步骤中，具体操作如下：
69.s11、利用两种常见的限制性内切酶对基因组dna进行双酶切消化，得到限制性酶切片段；其中，两种常见的限制性内切酶分别为vvn和t7；
70.s12、利用聚合酶对酶切片段进行末端修复和dna的3’端接头加a(腺嘌呤)，得到限制性片段产物；其中，聚合酶为taq dna聚合酶；该聚合酶的作用就是先将dna的5’端突出部分补平，再dna的3’端接头加a(腺嘌呤)。反应体系和条件如表1
71.表1反应体系和条件
72.组分1
×
反应体积(μl)基因组dnax两种限制性内切酶4taq dna聚合酶(5u/μl)1无核酸酶水35－x5＊反应缓冲液10反应总量50
73.其中，基因组dna的酶切反应温度为37℃，反应时间为20－30min；加a反应温度为65℃，反应时间为20－30min。
74.s2、dna片段接头连接。
75.该步骤中，使用连接酶，如t4dna连接酶将步骤s1中得到的dna加a产物与dna的5’端带有突出t的接头连接在一起，得到含“接头－dna插入片段－接头”形式的dna片段，如图3所示。
76.dna片段接头连接过程的反应体系和条件如表2。
77.表2反应体系和条件
78.组分1
×
反应体积(μl)上一步产物50t4dna连接酶5接头54＊反应缓冲液20反应总量80
79.其中，接头连接的反应温度为20℃，反应时间为20－30min。
80.s3、第一次纯化dna片段。
81.该步骤中，通过进行第一次纯化处理，将dna片段回收，得到目标dna片段。具体工艺步骤如下：
82.s31、所述dna的5’端的a接头连接反应结束后，将所述dna片段置于离心管，如pcr管中，加入72μl dna磁珠(0.9x)，吹打混匀或震荡低速混匀所述dna片段，低速离心甩掉离心管管壁和盖子上的液滴，使磁珠均匀分散在溶液中，室温反应5min，期间可轻弹离心管管底使磁珠均匀分布，若液体弹到离心管管壁上，轻轻甩动离心管或低速离心，使液体处于离心管管底。
83.s32、将ep管插入磁力架的管孔里，待磁珠吸附完全所述dna片段且溶液变澄清之后，用中枪头吸去离心管中的溶液；注意不要吸到磁珠，ep管留在磁力架上。
84.s33、吸取200μl 80v/v％的乙醇于ep管，期间轻轻旋动ep管两圈，每次半圈，使磁
珠在离心管管壁上移动；吸去溶液时，注意不要吸到磁珠。
85.s34、重复上一步骤s33。
86.s35、快速离心数s，让离心管管壁液体甩到管底；将管子放回磁架管孔里，待磁珠吸附全所述dna片段后，用枪吸取溶液。
87.s36、室温晾3min，让残留乙醇蒸发。该步骤，注意项：晾干时须常观察磁珠干湿程度，如磁珠过湿须延长空气烘干时间；避免磁珠过度干燥，磁珠干燥后表面无水渍，如磁珠有裂纹出现须盖好管盖，并立即进行下步实验操作。
88.s37、吸取22μl dna洗脱液：从有磁珠一侧加入，将磁珠冲入离心管管底；然后反复吹打或震荡低速将磁珠混匀所述dna片段，室温反应5min；等待的同时，准备好下面步骤需要的pcr反应混合溶液，标记为mix3，并吸取50μl于各新的0.2ml的pcr管中。
89.s38、将ep管插入磁力架的管孔里，待磁珠吸附完全所述dna片段且溶液变澄清之后，用移液枪吸取20μl溶液至新的pcr管中。注意不能吸到磁珠；获得纯化后的目标dna片段。
90.s4、pcr扩增并富集dna片段。
91.该步骤中，以回收的所述dna片段作为模板进行pcr扩增，以富集所述目标dna片段，构建并获得dna二代测序文库。
92.具体工艺步骤中，pcr扩增处理包括如下步骤：
93.s41、往pcr管中加入pcr酶混合液、pcr引物混合液，进行dna片段的pcr扩增反应，以富集所述目标dna片段；
94.该步骤中，反应体系如表3。
95.表3反应体系
96.组分反应体积(μl)连接产物20pcr酶混合液25pcr引物混合液5反应体系总量50
97.其中，反应时，将pcr管放入pcr仪上，按以下条件进行反应：
98.1)预变性阶段：反应温度为95℃时，反应时间为3min；
99.2)变性阶段：反应温度为95℃时，反应时间为3min；
100.3)退火阶段：反应温度为58℃时，反应时间为20s；
101.4)延伸阶段：反应温度为72℃时，反应时间为20s
102.5)终延伸阶段：反应温度为72℃时，反应时间为5min；
103.6)保存阶段：反应温度为4℃；
104.其中；第2)至4)阶段，分别需要执行10－14个循环；第1)和第5)阶段，各执行1次。
105.s42、待pcr扩增反应结束后，回收pcr扩增产物，对pcr扩增产物的dna片段进行选择和第二次纯化处理后，得到dna二代测序文库。
106.该步骤中，具体工艺操作如下：
107.s421、反应结束后补水至100μl，再加入80μl dna磁珠(0.8x)，吹打混匀或震荡低速混匀pcr扩增产物，低速离心甩掉离心管管壁和盖子上的液滴，使磁珠均匀分散在溶液
中，室温反应5min；期间可轻弹管底使磁珠均匀分布，若液体弹到离心管管壁上，轻轻甩动离心管或低速离心，使液体处于离心管管底。
108.s422、将ep管插入磁力架的管孔里，待磁珠吸附完全pcr扩增产物且溶液变澄清之后，用中枪头转移溶液至含有40μl dna磁珠(0.4x)的低吸附管，吹打混匀或震荡低速混匀pcr扩增产物，低速离心甩掉离心管管壁和盖子上的液滴，使磁珠均匀分散在溶液中，室温反应5min；期间可轻弹管底使磁珠均匀分布，若液体弹到离心管管壁上，轻轻甩动离心管或低速离心，使液体处于管底；注意不要吸到磁珠，ep管留在磁力架上。
109.s423、将ep管插入磁力架的管孔里，待磁珠吸附完全pcr扩增产物溶液变澄清之后，弃上清，并加入200μl 80v/v％的乙醇于ep管，期间轻轻旋动ep管两圈，每次半圈，使磁珠在离心管管壁上移动；吸去溶液时，注意不要吸到磁珠。
110.s424、重复上一步骤s423。
111.s425、快速离心数s，让管壁液体甩到离心管管底；将管子放回磁架管孔里，待磁珠吸附全后pcr扩增产物后，用枪吸取溶液。
112.s426、室温晾3min，让残留乙醇蒸发；该步骤中，注意：晾干时须常观察磁珠干湿程度，如磁珠过湿须延长空气烘干时间；避免磁珠过度干燥，磁珠干燥后表面无水渍，如磁珠有裂纹出现须盖好管盖，并立即进行下步实验操作。
113.s427、吸取22μl dna洗脱液：从有磁珠一侧加入，将磁珠冲入离心管管底；然后反复吹打或震荡低速将磁珠混匀pcr扩增产物，室温反应5min。
114.s428、将ep管插入磁力架的管孔里，待磁珠吸附完全pcr扩增产物且溶液变澄清之后，用移液枪吸取20μl于新的ep管中(注意不能吸到磁珠)，得到dna二代测序文库。
115.应当理解的是，上述针对本发明较佳实施例的表述较为详细，并不能因此而认为是对本发明专利保护范围的限制，本发明的专利保护范围应以所附权利要求为准。