一种肺腺癌细胞系及其应用的制作方法

1.本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种肺腺癌细胞系及其应用。


背景技术：

2.肺癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率均居于首位，严重威胁着人类的健康，然而其发病机制仍然不够明确，迫切需要大量的临床前实验研究，备受研究人员的广泛关注。肺癌主要分为小细胞癌和非小细胞癌，非小细胞癌占肺癌的80
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85％，其中肺腺癌是非小细胞癌中最常见的病理类型。
3.肺癌pdx模型是将肺癌患者的肿瘤组织移植到免疫缺陷鼠上，构建异源移植性肿瘤模型。该模型能高度保留人源肿瘤微环境中的肿瘤细胞、浸润淋巴细胞、成纤维细胞、细胞外间质和微血管等，是目前模拟人体肿瘤微环境最理想的模型之一，是研究肿瘤发生与转移机制、筛选和评价抗肿瘤药物的最有力工具。根据移植部位的不同，可将肺癌pdx模型分为原位pdx模型和异位pdx模型，其中异位模型只要是将肿瘤细胞移植于小鼠的皮下。pdx模型获得的移植瘤具有与人原发肿瘤组织相同的组织学形态、起源、免疫组织化学及基因表型等特征，因此肺癌pdx模型是肿瘤治疗过程筛选新型药物的优势模型，为肺癌患者精准的个性化治疗提供了可能途径；同时，也是耐药基因筛选的有效平台，能有效指导临床前用药。然而，pdx模型的构建所需成本较高，同时该模型的建模时间较长，从接种、移植、传代到药效学评估，整个实验过程耗时在2
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16个月左右，不排除个别肿瘤成瘤率较低或无法成瘤的问题。以上问题限制了临床工作中肺癌 pdx模型的广泛应用。
4.肺癌细胞系在肺癌致病、侵袭转移和耐药等分子机制、生物学特征研究以及新药开发方面，具有重要的理论探究与临床指导价值。利用pdx模型的肿瘤组织构建一种新的肺腺癌细胞系，可充分利用pdx模型资源，同时丰富了可用于肺癌研究的细胞系，在新药筛选上具有重要的应用价值。


技术实现要素：

5.为了克服背景技术中提到的至少一种技术缺陷，本发明首先提供了一种肺腺癌细胞系。
6.本发明所要解决的上述技术问题，通过以下技术方案予以实现：
7.本发明的第一方面，提供一种肺腺癌细胞系，该肺腺癌细胞系命名为人源肺癌细胞lung(116)
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clone 1；保藏编号为gdmcc no:61576。该肺腺癌细胞系已于2021年3月22日保藏在广东省微生物菌种保藏中心(保藏编号为gdmccno:61576)，保藏地址：中国广东。
8.本发明所述的肺腺癌细胞系是从腺癌pdx模型中构建得到。
9.本发明从腺癌pdx模型中构建肺腺癌细胞系的难点在于：并不是所有构建出来的肺腺癌细胞系都具有较高的成瘤率高；也并不是所有构建出来的肺腺癌细胞系成瘤后，其成瘤组织能保持与原始肺腺癌肿瘤和pdx模型肿瘤具有相同的病理特征。然而，构建出来的肺腺癌细胞系不能成瘤或成瘤率不高，并不产生肿瘤组织，是无法应用于后期的抗肺腺癌
药物评估以及致病机理方面的研究的；若成瘤后其成瘤组织不能保持与原始肺腺癌肿瘤或pdx模型肿瘤具有相同的病理特征，则无法精准的用于后期抗肺腺癌药物评估以及致病机理方面的研究。
10.本发明经过大量的实验研究，构建得到的人源肺癌细胞lung(116)
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clone 1，其具有较高的成瘤率，其f25代细胞成瘤时间短，成瘤率可达100％；此外，本发明构建得到的人源肺癌细胞lung(116)
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clone 1，还保持了与原始肺腺癌肿瘤以及pdx模型肿瘤具有相同的病理特征。
11.本发明的第二方面，提供上述肺腺癌细胞系在制备肺癌肿瘤动物模型中的应用。
12.本发明的第三方面，提供上述肺腺癌细胞系在筛选抗肺癌药物中的应用。
13.本发明的第四方面，提供上述肺腺癌细胞系在研究肺癌肿瘤细胞增殖机制中的应用。
14.本发明的第五方面，提供上述肺腺癌细胞系在研究肺癌肿瘤细胞耐药机理中的应用。
15.本发明的第六方面，提供上述肺腺癌细胞系在开发肺癌肿瘤药物靶点中的应用。
16.有益效果：本发明提供了一种全新的肺腺癌细胞系；研究表明，本发明所述的肺腺癌细胞系能够稳定传代、具有较高的成瘤率，其能保证在制备肺癌肿瘤动物模型时能够顺利成瘤，得到成瘤组织；且所述的肺腺癌细胞系成瘤后，其成瘤组织与原始肺腺癌肿瘤和pdx模型肿瘤具有相同的病理特征，较好地保有原始肺腺癌肿瘤以及pdx模型肿瘤的生物学特征；因此可以将其用于筛选抗肺癌药物，用于研究肺癌肿瘤细胞增殖机制、研究肺癌肿瘤细胞耐药机理，以及用于开发肺癌肿瘤药物靶点。由于所述的肺腺癌细胞系与pdx模型肿瘤具有相同的病理特征，因此，该肺腺癌细胞系在实际应用中可以替代pdx模型；克服了背景技术中提到的pdx模型构建成本高、建模时间长以及无法大规模推广应用的问题。此外，本发明所述的肺腺癌细胞系能够表达epcam、nse、cea三种肺腺癌标志物；因此，本发明所述的肺腺癌细胞系可以用作以epcam、nse、cea 为靶标的肺癌靶向药物研究。
附图说明
17.图1为本发明肺腺癌细胞系在光学显微镜下的细胞形态图。
18.图2为本发明肺腺癌细胞系在nsg小鼠皮下成瘤及肿瘤组织解剖图。
19.图3为本发明肺腺癌细胞系在nsg小鼠皮下成瘤组织的生长曲线图。
20.图4为本发明肺腺癌细胞系上epcam,nse,cea三种标志物免疫荧光表达情况图。
21.图5为患者来源的肺腺癌组织、pdx模型成瘤组织和本发明肺腺癌细胞系成瘤组织的病理图。图中，lung(116)f0表示患者来源的肺腺癌组织；lung (116)f2表示pdx模型成瘤组织；lung(116)clone 1表示本发明肺腺癌细胞系成瘤组织。
具体实施方式
22.以下结合具体实施例来进一步解释本发明，但实施例对本发明不做任何形式的限定。
23.实施例1本发明肺腺癌细胞系的构建
24.本实施例对一例肺腺癌pdx模型的成瘤组织(f2代)，进行消化、分选培养、单克隆
挑选、扩增传代，获得一株稳定传代的肺腺癌细胞系，命名为人源肺癌细胞lung(116)
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clone 1。具体方法如下：
25.(1)配置培养基：500ml dmem/f12，1
×
双抗，10％fbs，20ng/ml egf， 10ng/ml bfgf，5ng/ml tgfb。
26.(2)配置肿瘤组织消化液：使用macs试剂盒(order no.130
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095
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929)，过滤、避光。
27.(3)取材、消化：将小鼠安乐死后，浸泡在75％酒精内，准备两副灭菌的镊子和剪刀，第一副用来将小鼠皮下肿瘤组织剪开，利用钝性分离皮肤和肿瘤组织。将离体的组织放入盛放1
×
双抗的预冷pbs的无菌皿中，换新的灭菌镊子和剪刀去除肿瘤组织的脂肪、表皮血管、纤维和局部坏死区域。将修剪好的组织放入新的无菌皿内，用1
×
双抗的预冷pbs漂洗后，放入新的无菌皿内，将组织修剪成小块，并换无菌的手术刀将组织剁碎后，加入配好的配置肿瘤组织消化液中，用锡箔纸包裹避光后，放入37℃摇床内消化30分钟，手动颠倒混悬后继续消化 30分钟。
28.(4)分选培养：将消化完全的组织，用70um过滤筛过滤，对过滤细胞进行200g
×
7min的离心处理，吸走上清后用1
×
红细胞裂解液(ack)作用10min， 300g
×
5min离心收集上清。配置dnase消化液(0.2mg dnase 5ml dmem/f12)，重悬细胞作用5min后，300g
×
5min离心收集上清。用预冷的pbs洗涤细胞，台盼蓝染色计数。根据细胞数量，配置磁珠混合液(本次实验，使用cd133磁珠进行肺癌干性细胞的阳性选择)。根据磁珠使用说明书进行分选后，对获得的细胞进行台盼蓝染色计数、接种细胞培养基。
29.(5)初代培养过程，避免频繁移动培养基，待3
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5天，贴壁后，进行传代，稀释培养获得单克隆团。对克隆团进行分离传代。本次发明肺腺癌细胞系第一次克隆团见图1。
30.如图1所示，本发明所述的肺腺癌细胞系的细胞形态如下：光镜下肿瘤细胞形态多数呈均一的梭形或卵圆形，极少数呈多边型，细胞两极尖细。对数生长期的细胞铺展，多为椭圆形上皮样细胞，形态规则。
31.实施例2本发明肺腺癌细胞系致瘤实验
32.传代至第六代的本发明所述的肺腺癌细胞(f6)，形态单一、增殖状态良好。以4.4
×
10^5cell/只鼠的剂量接种到三只nsg鼠皮下，未成瘤。对f15代肺腺癌细胞，以8.8
×
10^6cell/只鼠的剂量接种到5只nsg鼠皮下，其中4只小鼠顺利成瘤，成瘤率为80％；荷瘤鼠及其解剖组织见图2，4只成瘤小鼠的成瘤曲线见图3。对f25代肺腺癌细胞，以8.6
×
10^6cell/只鼠的剂量接种到9只nsg鼠皮下，成瘤时间显著提前，成瘤率为100％。
33.实施例3本发明肺腺癌细胞系生物学特征的鉴定
34.利用间接免疫荧光技术，对f26代肺腺癌细胞进行epcam、nse、cea三种肺腺癌生物学指标检测，结果显示为均一的阳性表达(见图4)。epcam(小鼠克隆抗体ber
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ep4)是上皮细胞黏附分子，表达于大多数正常组织和肿瘤组织的上皮细胞膜表达，是上皮源细胞特有分子，成纤维细胞及血管内皮细胞均不表达该分子，本发明所述的肺腺癌细胞完全均一地呈现出epcam的细胞膜表达，即表明本发明所述的肺腺癌细胞系是完全上皮来源，不含有成纤维及血管内皮细胞。结合两种肺癌常用的肿瘤标志物nse和cea的完全阳性表达结果，充分说明本发明的细胞系是形态单一的肺腺癌细胞。此外，通过str检测技术，再次确定该细胞株为单一来源人源细胞，无交叉污染，是完全单一的人源肺腺癌细胞株(结果见附件“lung(116)
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clone 1str检测报告”)。
35.实施例4肺腺癌细胞系成瘤组织与原肺腺癌pdx组织的病理比对分析
36.利用he染色实验，对fo代患者来源的肺癌肿瘤组织(患者手术切除组织) 和在nsg小鼠皮下移植传代的f2代肿瘤组织(pdx肿瘤组织)以及本发明构建得到的肺腺癌细胞系的成瘤组织病理结果进行分析，发现肿瘤细胞的核变明显，具备肺腺癌特征。利用肺腺癌的肿瘤标志物nse和常用的癌肿物标志物ki67鉴定出三种肿瘤组织均存在普遍阳性表达，且表达特征一致(见图5)，这说明本发明新建的肺腺癌细胞系确实是肺腺癌细胞株，其具备了肿瘤细胞的一般特性，其成瘤组织能较好地保持患者来源的肺癌肿瘤和pdx模型肿瘤的病理特征，能应用到后期肺腺癌相关研究中。