玉米抗旱基因ZmMYBR38及其应用的制作方法

玉米抗旱基因zmmybr38及其应用
技术领域
1.本发明涉及植物基因工程领域，具体涉及一种玉米抗旱基因zmmybr38及其应用。


背景技术：

2.玉米是我国主要粮食作物之一，其种植区多与我国干旱和半干旱地区重叠。日益频繁的极端气候引发大面积干旱严重威胁我国玉米产量，制约我国农业发展，威胁农民利益和国家粮食安全。利用分子生物学和遗传学手段进行玉米品种的培育和改良，有望增强玉米在干旱下的耐受能力，达到使玉米在干旱胁迫下保持稳产和高产的目的。
3.为了更好的适应环境，植物形成了复杂的干旱应答网络。植物可以通过感受脱落酸等信号分子，调节体内干旱应答转录因子的表达水平，进而调控下游基因参与干旱应答。myb转录因子家族是植物中一个庞大的基因家族，许多报道表明myb转录因子家族成员参与植物的干旱等非生物胁迫应答，如在玉米中过表达水稻myb基因osmyb55可以提高植株的耐热性和抗旱性，在拟南芥中过表达小麦myb基因tamyb31可以提升植物的抗旱性。因此，该家族成员在作物抗逆遗传改良和育种中有着潜在的应用价值。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种玉米抗旱基因zmmybr38及其应用。
5.为实现上述目的，本发明所涉及一种玉米抗旱转录因子zmmybr38蛋白，其氨基酸序列为：
6.(1)由seq id no.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或
7.(2)与序列seq id no.2限定的氨基酸序列同源性在95
‑
100％编码相同功能蛋白质的氨基酸序列。
8.(3)seq id no.2所示的氨基酸序列经增加、缺失或替换一个或多个氨基酸且具有同等活性的由(1)衍生的蛋白。
9.本发明利用数据库中的参考序列和反转录pcr技术相结合，获得了玉米抗旱基因zmmybr38全长为2277bp的cds序列，其核苷酸序列如seq id no.1所示。该基因编码的蛋白共有758个氨基酸，其氨基酸序列如seq id no.2所示。
10.应该明确的是，本领域技术人员可根据本发明公开的氨基酸序列，在不影响其蛋白生物活性的前提下，对其实施取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸，蛋白质序列比对同源性在90％以上，所得到所述蛋白的突变体序列。因此，本发明还包括对seq id no.2所示氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸，得到的高同源性且具有生物活性的衍生蛋白。
11.本发明包括编码上述所述蛋白的核苷酸序列。
12.此外，应当理解，鉴于密码子兼并性及物种具有密码子偏好性的特点，本领域技术人员，可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。
13.编码上述玉米抗旱转录因子zmmybr38的zmmybr38基因，其核苷酸序列如seq id no.1所示。该基因编码的蛋白共有758个氨基酸，其氨基酸序列如seq id no.2所示。
14.本发明的基因和蛋白质可以从玉米自交系b73中克隆或分离得到，或者通过序列化学合成的方法得到。
15.本发明还提供了一种用于获得上述zmmybr38基因的引物对，所述引物对为：
16.引物f：5
’‑
atggcagctgcggcgccgg
‑3’
，
17.引物r：5
’‑
ctattgcctggctgctgctgctggcag
‑3’
。
18.本发明还提供了一种玉米zmmybr38过表达载体，所述玉米zmmybr38过表达载体为含有权利要求2所述zmmybr38基因的过表达载体，即命名为zz0153
‑
ubip
‑
zmmybr38
‑
3ha，其中，所述过表达载体为：zz0153
‑
ubip
‑
3ha。
19.本发明还提供了一种拟南芥zmmybr38超表达载体，所述拟南芥zmmybr38超表达载体为含有权利要求2所述zmmybr38基因的超表达载体，即命名为pcambia1305
‑
zmmybr38
‑
3ha，其中，所述超表达载体为：pcambia1305
‑
3ha。
20.本发明还提供了一种含有上述玉米zmmybr38过表达载体或上述拟南芥zmmybr38超表达载体的宿主细胞，所述宿主细胞为大肠杆菌dh5α。
21.下述各项之一在提高作物抗旱性中的应用，其中，
22.(1)上述的zmmybr38基因；
23.(2)上述的玉米zmmybr38过表达载体；
24.(3)上述的拟南芥zmmybr38超表达载体；
25.(4)上述的宿主细胞。
26.本发明的有益效果：
27.本发明验证了玉米抗旱基因zmmybr38在玉米抗旱性的功能，为通过分子育种方式进行玉米抗旱品种的培育提供了有价值的资源。
28.本发明将玉米抗旱基因zmmybr38导入拟南芥和玉米，转基因植株的抗旱表型得到显著提高，表明zmmybr38基因可用于提高作物抗旱性。
附图说明
29.图1为玉米过表达载体zz0153
‑
ubip
‑
zmmybr38
‑
3ha构建示意图(通用载体图谱，无中文注释)；
30.图2为拟南芥过表达载体pcambia1305
‑
zmmybr38
‑
3ha构建示意图(通用载体图谱，无中文注释)；
31.图3为转基因玉米和拟南芥植株在干旱下zmmybr38表达量鉴定。
32.图4为拟南芥转基因植株抗旱表型分析；
33.图5为玉米转基因植株抗旱表型分析。
具体实施方式
34.下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述，以便本领域技术人员理解。
35.实施例1 zmmybr38基因获得
36.通过预测分析，发现zmmybr38可能参与玉米的抗旱应答，然后通过玉米的参考基
因组序列，设计引物对：
37.引物f：5
’‑
atggcagctgcggcgccgg
‑3’
，
38.引物r：5
’‑
ctattgcctggctgctgctgctggcag
‑3’
；
39.并以玉米基因组为模板，进行pcr扩增；得到pcr产物，测序得到zmmybr38基因(zmmybr38的全长cds序列)，其核苷酸序列如seq id no.1所示。
40.实施例2玉米zmmybr38过表达载体构建
41.以表达载体zz0153
‑
ubip
‑
3ha为基础，通过同源重组将zmmybr38的cdna片段插入到ubi启动子下游和3ha标签中间，由ubi启动子表达(图1)；电泳检测及测序分析表明成功得到了玉米zmmybr38过表达载体，即命名zz0153
‑
ubip
‑
zmmybr38
‑
3ha，具体实验步骤如下：
42.1.zmmybr38基因扩增：
43.根据zmmybr38的cdna序列设计一对同源重组引物进行pcr扩增。引物序列如下：
44.zmmybr38
‑
f0：
[0045]5’‑
cgacaaacgcactagtatcccgggatggcagctgcggcgccgg
‑3’
，
[0046]
zmmybr38
‑
r0：
[0047]5’‑
catttggcgcgccttcccctattgcctggctgctgctgctggcag
‑3’
；
[0048]
使用vazyme phanta max super
‑
fidelity dna polymerase进行基因扩增，得到pcr产物，其反应体系如下(总体积20ul)：
[0049]
2x phanta buffer10uldntp0.4ulzmmybr38
‑
f00.8ulzmmybr38
‑
r00.8ulphanta max0.4ulcdna(玉米)1.5ulddh2o6.9ul
[0050]
反应程序为：95℃3min；95℃15s；60℃30s；72℃60s；72℃5min；35循环；
[0051]
2.线性化载体制备：使用限制性内切酶xmai单酶切zz0153
‑
ubip
‑
3ha载体，使环状载体线性化；
[0052]
3.pcr产物与载体酶切产物的检测与回收：琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物与载体酶切产物。使用omega bio
‑
tek gel extraction kit回收目的片段；
[0053]
4.胶回收产物重组：使用vazyme clonexpress ii one step cloning kit进行同源重组；反应体系如下：
[0054]
线性化载体200ng插入片段120ng5x ce ii buffer4ulexnase ii2ulddh2oto 20ul
[0055]
使用移液器轻轻吸打混匀，经短暂离心后将反应液收集至离心管管底；37℃水浴30min，放置冰上静置至室温；
[0056]
5.重组产物转化：重组产物转化dh5α感受态细胞，参照分子克隆实验指南。
[0057]
6.测序鉴定：经菌落pcr和质粒pcr,测序分析表明：成功得到了玉米zmmybr38过表达载体zz0153
‑
ubip
‑
zmmybr38
‑
3ha；pcr及测序引物如下：
[0058]
0153
‑
f：5
’‑
gcaggtcgacaaacgcacta
‑3’
[0059]
3ha
‑
r：5
’‑
tactgagcagcgtagtctgg
‑3’
。
[0060]
实施例3拟南芥mybr38超表达载体构建
[0061]
以pcambia1305
‑
3ha载体为基础，通过同源重组将zmmybr38的cdna片段插入到35s启动子下游和3ha标签中间，由35s启动子表达(图2)。电泳检测及测序分析表明：成功得到了拟南芥mybr38超表达载体，即命名为pcambia1305
‑
zmmybr38
‑
3ha，具体实验步骤如下：
[0062]
1.zmmybr38基因扩增
[0063]
根据zmmybr38的cdna序列设计一对同源重组引物进行pcr扩增，引物序列如下：
[0064]
zmmybr38
‑
f1：5
’‑
ctgcaggcatgcaagcttatggcagctgcggcgccgg
‑3’
，
[0065]
zmmybr38
‑
r1：
[0066]5’‑
aacatcgtatgggtaaagctattgcctggctgctgctgctggcag
‑3’
；
[0067]
使用vazyme phanta max super
‑
fidelity dna polymerase进行基因扩增，得到基因pcr产物，其反应体系如下(总体积20ul)：
[0068]
2x phanta buffer10uldntp0.4ulzmmybr38
‑
f00.8ulzmmybr38
‑
r00.8ulphanta max0.4ulcdna1.5ulddh2o6.9ul
[0069]
反应程序为：95℃3min；95℃15s；60℃30s；72℃60s；72℃5min；35循环；
[0070]
2.线性化载体制备：使用限制性内切酶hindiii单酶切pcambia
‑
1305
‑
3ha载体，使环状载体线性化。
[0071]
3.基因pcr产物与载体酶切产物的检测与回收：琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物与载体酶切产物，使用omega bio
‑
tek gel extraction kit回收目的片段。
[0072]
4.胶回收产物重组：使用vazyme clonexpress ii one step cloning kit进行同源重组，反应体系如下：
[0073]
线性化载体200ng插入片段120ng5x ce ii buffer4ulexnase ii2ulddh2oto 20ul
[0074]
使用移液器轻轻吸打混匀，经短暂离心后将反应液收集至离心管管底；37℃水浴30min，放置冰上静置至室温。
[0075]
5.重组产物转化：重组产物转化农杆菌感受态细胞，参照分子克隆实验指南；
[0076]
6.测序鉴定：经菌落pcr和质粒pcr,测序分析表明：成功得到了拟南芥zmmybr38超表达载体pcambia1305
‑
zmmybr38
‑
3ha；pcr及测序引物为：
[0077]
1305
‑
f：5
’‑
tcatttggagagaacacggg
‑3’
[0078]
3ha
‑
r：5
’‑
aggatgagaccaagcgtaat
‑3’
。
[0079]
实施例4转基因拟南芥及玉米株系获得
[0080]
将实施例2所得玉米zmmybr38过表达载体zz0153
‑
ubip
‑
zmmybr38
‑
3ha送江苏未米生物科技有限公司进行转化，转化背景为玉米自交系kn5585。从公司获得的t0代转基因种子栽培获得t1代，通过涂抹除草剂筛选t1阳性植株并收获种子，栽培获得t2代。继续对t2代植株进pcr检测，确定目的基因未发生遗传分离丢失，最终获得两个含有zmmybr38稳定遗传的阳性纯合转基因玉米家系和对应的阴性分离材料。pcr检测引物同实施例2.6。
[0081]
利用农杆菌浸染转化法将实施例3所得拟南芥mybr38超表达载体pcambia1305
‑
zmmybr38
‑
3ha转入盛花期的col
‑
0拟南芥(让拟南芥的花芽完全浸入农杆菌中1min后拿出)，将用农杆菌处理的拟南芥用黑色塑料袋盖上，避光生长24h，然后将其放在光照培养室生长3
‑
4周收种。将t0代种子点播在含有潮霉素抗性的ms培养基上，放置22℃光照培养箱生长一周，将可以在抗性ms皿上正常生长的植株移栽至装有营养土的钵子中种植收获，同时利用实施例3.6中的引物确定zmmybr38的表达。
[0082]
实施例5 zmmybr38转基因拟南芥和玉米植株的表达量检测
[0083]
1.分别种植zmmybr38拟南芥过表达材料及col，取生长两周的拟南芥叶片，使用trizol法提取rna，将提取的rna经dnasei消化后使用promega mlv逆转录酶进行反转录，使用提取的cdna进行rt
‑
pcr检测。拟南芥actin7基因用作对照。
[0084]
检测结果表明：zmmybr38基因成功转入拟南芥。
[0085]
2.分别种植zmmybr38过表达玉米材料及野生型，取生长三周的玉米叶片，使用trizol法提取rna，将提取的rna经dnasei消化后使用promega mlv逆转录酶进行反转录，使用提取的cdna进行rt
‑
pcr检测，玉米actin基因用作对照。
[0086]
检测结果表明zmmybr38基因成功转入玉米(图3)。
[0087]
检测过程中所用引物如下：
[0088]
qmybr38
‑
f：5
’‑
acacgcctctgttggctcag
‑3’
，
[0089]
qmybr38
‑
r：5
’‑
cagtgccggtgccagtgaag
‑3’
；
[0090]
qzmactin
‑
f：5
’‑
gctggatcttgctggccgtg
‑3’
，
[0091]
qzmactin
‑
r：5
’‑
aggcgccacgaccttgatct
‑3’
；
[0092]
atactin
‑
f：5
’‑
ggccgatggtgaggatattcagccacttg
‑3’
，
[0093]
atactin
‑
r：5
’‑
tcgatggacctgactcatcgtactcactc
‑3’
。
[0094]
实施例6 zmmybr38转基因拟南芥的抗旱表型检测
[0095]
zmmybr38的拟南芥过表达植株与野生型col
‑
0植株的种子均在4℃黑暗条件下处理三天，随后在ms培养皿上于22℃培养箱中生长。一周后将过表达植株和野生型植株在方形花盆中对半种植，并放置在22℃培养室中正常浇水生长两周。随后停止浇水，待植株出现严重萎蔫后复水，并在复水三天后进行zmmybr38过表达材料和野生型材料的存活率。
[0096]
结果表明：zmmybr38的过表达材料存活率显著高于野生型材料，说明zmmybr38转基因拟南芥植株具有更强的抵抗干旱胁迫能力(图4)。
[0097]
实施例7 zmmybr38转基因玉米植株的抗旱表型检测
[0098]
将zmmybr38阳性转基因材料和阴性分离材料同时种植在30cm
×
40cm
×
15cm规格
的方盒中，左右对半种植。植株生长于温度为28℃的温室中，在正常状态下生长至四叶期时停止浇水进行干旱处理。干旱处理10天后植物呈现明显的萎蔫状态时进行复水，复水7天后统计每个方盒中阳性转基因材料和阴性分离材料的植株存活率。
[0099]
结果表明：zmmybr38的过表达材料存活率显著高于阴性分离材料，说明zmmybr38转基因玉米具有更强的抵抗干旱胁迫能力(图5)。
[0100]
其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。