人类血清素神经元TPH2报告基因细胞系的构建方法及应用与流程

人类血清素神经元tph2报告基因细胞系的构建方法及应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，涉及一种血清素神经元tph2报告基因人多能干细胞系的构建方法与应用。


背景技术：

2.在中枢神经系统中，tph2基因在血清素(五羟色胺)神经元中特异表达，其编码的色氨酸羟化酶二是血清素合成的关键限速酶，在血清素的合成过程中负责催化色氨酸转变成五羟色氨酸，最后通过氨基酸脱羧反应生成五羟色胺。
3.脑内血清素神经元具有调控情绪和呼吸等功能，与重度抑郁症以及婴儿猝死综合等疾病息息相关，然而血清素神经元调控情绪以及呼吸的具体机制目前尚不明确。虽然体外诱导人多能干细胞可以分化得到血清素神经元，但是最终分化体系中非血清素神经元仍然占据较高比例，活细胞状态下研究血清素神经元的形态和功能也面临巨大挑战。
4.因此，建立荧光标记的血清素神经元的报告细胞系将有利于人类血清素神经元的相关研究，为重度抑郁症等疾病的药物筛选提供广阔的应用平台。


技术实现要素：

5.本发明旨在建立tph2基因的报告细胞系，来指针分化体系中的人类血清素神经元，解决分化体系中多种细胞混合条件下对血清素神经元进行研究的难题。
6.一方面，本发明提供了一种表达血清素神经元tph2报告基因的载体系统，所述的载体系统包括但不限于：
7.靶向人类血清素神经元tph2基因终止密码子附近的单链向导rna的向导载体，和
8.携带人类血清素神经元tph2基因终止密码子附近同源臂的供体载体。
9.本发明中，单链向导rna(sgrna)覆盖了tph2基因终止密码子，报告基因插入后可破坏原始单链向导rna识别序列，从而防止被cas9蛋白二次切割。
10.tph2基因终止密码子附近的单链向导rna是指tph2基因终止密码子上下游100bp以内tph2基因终止密码子附近同源臂是指距离终止密码子上下游各1500bp左右。
11.在本发明的一个实施例中，tph2基因终止密码子附近同源臂如seq id no 21或者seq id no 22所示。
12.较好的，靶向人类血清素神经元tph2基因终止密码子附近的单链向导rna的向导载体选自：px330
‑
sgt、px458
‑
sgt或者px459
‑
sgt。
13.在本发明的一个实施例中，px330
‑
sgt的序列如seq id no 19所示。
14.另一方面，本发明提供了一种稳定的血清素神经元tph2报告基因人多能干细胞系的构建方法，包括以下步骤：
15.(1)构建携带靶向tph2基因终止密码子附近的单链向导rna的向导载体px330
‑
sgt；
16.获得靶向人类tph2基因终止密码子附近的sgrna，合成两条寡聚核苷酸链，退火并
磷酸化后插入到px330的bbsi位点，重组载体转化大肠杆菌，挑取单克隆菌进行测序验证重组成功的质粒px330
‑
sgt；
17.(2)构建报告基因供体载体的工具载体puc19
‑
t2a
‑
egfp
‑
cmv
‑
puror；
18.从aavs1
‑
tre3g
‑
egfp中扩增出puromycin(嘌呤霉素)的抗性基因，克隆到flag
‑
ha
‑
pcdna3.1
‑
表达载体的cmv启动子后，得到pcdna3.1
‑
cmv
‑
puror
‑
polya载体，从此载体中扩增cmv
‑
puror
‑
polya序列，同时从px458中扩增t2a
‑
egfp，将扩增的两个片段重组到puc19载体的多克隆位点，得到工具载体puc19
‑
t2a
‑
egfp
‑
cmv
‑
puror；
19.(3)构建tph2报告基因的供体载体tph2
‑
t2a
‑
egfp；
20.从人的基因组中扩增tph2终止密码子前后1.5kb的左右同源臂，thl和thr，在工具载体的左右两侧的多克隆位点分别插入thl和thr，得到tph2报告基因供体载体tph2
‑
t2a
‑
egfp；
21.(4)tph2报告基因人多能干细胞系的构建；
22.将向导载体px330
‑
sgt和供体载体tph2
‑
t2a
‑
egfp电转到人多能干细胞h9，经puromycin筛选，获得抗性克隆后，提取细胞基因组进行pcr扩增鉴定插入片段，并测序，最终获得稳定的egfp标记的报告血清素神经元tph2基因的人多能干细胞系。
23.较好的，所述步骤1)中构建向导载体的工具载体包括但不限于：px330、px458或者px459中的一种或者几种。
24.较好的，所述步骤2)中用于构建打靶载体工具载体的报告基因元件包括但不限于tdtomato,yfp,rfp或者egfp中的一种或者几种。
25.较好的，所述步骤2)中用于构建打靶载体工具载体的抗性筛选元件包括但不限于puror,neor。
26.较好的，所述步骤3)是从工具载体puc19
‑
t2a
‑
egfp
‑
cmv
‑
puror出发，插入tph2基因的左右同源臂。
27.较好的，所述步骤4)中电转的人多能干细胞系包括但不限于人胚胎干细胞系或者诱导多能干细胞系(例如h1,rues1,rues2以及人体细胞重编程来源的多能干细胞)。
28.在本发明的优选实施例中，人类血清素神经元tph2报告基因稳定细胞系的构建方法如下：
29.1.1构建携带靶向tph2基因终止密码子附近的单一向导rna(single guide rna)的向导载体(例如，px459
‑
sgt或者px330
‑
sgt)；
30.1.2构建携带tph2基因终止密码子附近同源臂的供体载体(tph2
‑
t2a
‑
egfp)；
31.1.3将px459
‑
sgt和tph2
‑
t2a
‑
egfp载体电转到人多能干细胞系中，经puromycin抗性筛选得到稳定的egfp标记tph2基因的人多能干细胞系。
32.上述人类血清素神经元tph2报告基因稳定细胞系的构建方法中，所述步骤1.1中用于构建携带sgrna的打靶载体包括px330/px458/px459，优选px330。靶向tph2终止密码子附近的寡链核苷酸退火形成双链后,通过酶切连接插入到px330载体的bbsi位点，重组载体经大肠杆菌扩增获得无内毒素的px330
‑
sgt质粒，序列如表1seq id no 19所示。
33.所述步骤1.2中供体载体(tph2
‑
t2a
‑
egfp)的报告基因可选用mcherry,rfp,gfp,tdtomato等,本发明选用egfp。
34.供体载体的构建步骤分为两步，第一步构建报告基因的工具载体，第二步在工具
载体中插入tph2终止密码子前后各近1.5kb的同源臂。
35.较好的，报告基因的工具载体构建步骤如下：
36.1.从aavs1
‑
tre3g
‑
egfp(addgene#52343)扩增出puror，通过同源重组克隆到flag
‑
ha
‑
pcdna3.1
‑
(addgene#52535)的nhei和aflii酶切位点之间，同时去除nhei和aflii的酶切位点，得到pcdna3.1
‑
cmv
‑
puror
‑
polya,序列如表2所示。
37.2.从pcdna3.1
‑
cmv
‑
puror
‑
polya中扩增cmv
‑
puror
‑
polya
‑
aflii
‑
nhei，通过引物加入aflii和nhei两个酶切位点。
38.3.从px458(addgene#48138)中扩增t2a
‑
egfp序列。
39.4.将2,3步骤得到的两个片段同源重组到puc19(addgene#50005)的bamhi和kpni两个酶切位点之间，得到puc19
‑
t2a
‑
egfp
‑
cmv
‑
puror工具载体，序列如表三所示。
40.5.将人基因组中扩增的tph2终止密码子前后1.5kb左右的同源臂同源重组组装到工具载体puc19
‑
t2a
‑
egfp
‑
cmv
‑
puror的多克隆位点，重组载体经大肠杆菌扩增得到无内毒素的tph2
‑
t2a
‑
egfp质粒，序列如表四所示。
41.再一方面，本发明提供了使用上述血清素神经元tph2报告基因人多能干细胞系的构建方法获得的血清素神经元tph2报告基因人多能干细胞系。
42.较好的，所述的血清素神经元tph2报告基因人多能干细胞系源自h9。
43.再一方面，本发明还提供了上述血清素神经元tph2报告基因多能干细胞系的应用，包括所述的血清素神经元tph2报告基因人多能干细胞系在制备血清素神经元的定向分化药物、清素神经元的形态和功能研究方面、血清素神经元的定向分化药物筛选等方面的应用。
44.在本发明的另一个优选实施例中，人类血清素神经元tph2报告基因多能干细胞系的鉴定方法如下：
45.根据已发表的实验方案(pmid:26655496)体外诱导tph2基因报告人多能干细胞系分化得到血清素神经元，荧光显微镜下可见绿色荧光表达，可直观观察分化效率；细胞免疫荧光检测红色荧光标记血清素与绿色egfp荧光细胞共定位；记录绿色荧光标记的血清素神经元的电生理，提高了血清素神经元电生理检测效率和准确性。
46.本发明公开了一种人类血清素神经元tph2报告基因人多能干细胞系的构建方法以及应用。绿色荧光指示多能干细胞分化来源的人类血清素神经元，促进了活细胞状态下人类血清素神经元的形态和功能的研究，为重度抑郁症等疾病药物筛选提供精确且便利的平台。
附图说明
47.图1为报告基因工具载体图示。
48.图2为tph2报告基因载体图示。
49.图3为tph2报告基因人多能干细胞系的构建图示。
50.图4为细胞系鉴定pcr扩增图。
51.图5为血清素神经元与绿色荧光共定位图。
52.图6为绿色荧光标记的血清素神经元在电压刺激下的钠钾电流。
53.图7为绿色荧光标记的血清素神经元在电流刺激下诱发的动作电位和自发动作电
位。
具体实施方式
54.实施例1：构建含有报告基因和独立启动子启动的抗性筛选基因的工具载体
55.(1)从aavs1
‑
tre3g
‑
egfp(addgene#52343)质粒中扩增puromycin的抗性基因puror并纯化；
56.正向引物：5
’‑
gggagacccaagctgatgaccgagtacaagcccacgg
‑3’
(seq id no 1)
57.反向引物：5
’‑
gatcagcggtttaaatcaggcaccgggcttgcg
‑3’
(seq id no 2)
58.引物5’端划线小写字母标注的序列为同源臂序列。
59.(2)flag
‑
ha
‑
pcdna3.1
‑
(addgene#52535)载体nhei，aflii(neb)双酶切并纯化回收。
60.(3)使用同源重组试剂盒(近岸蛋白)将(1)中的puror序列重组到(2)中的酶切纯化的flag
‑
ha
‑
pcdna3.1
‑
载体的nhei和aflii之间，去除原载体上nhei和aflii的酶切位点，得到pcdna3.1
‑
cmv
‑
puror
‑
polya。
61.(4)从(3)中的载体pcdna3.1
‑
cmv
‑
puror
‑
polya中扩增cmv
‑
puror
‑
polya序列，并纯化；
62.正向引物：5
’‑
catgctggggaggccagatatacgcgttgac
‑3’
(seq id no 3)
63.反向引物：5
’‑
agtgaattcgagctcggtaccgcgcttaagccatagagcccaccgcatc
‑3’
(seq id no 4)
64.引物5’端划线小写字母标注的为同源臂序列，反向引物上携带aflii
‑
nhei酶切位点序列。
65.(5)从px458(addgene#48138)中扩增t2a
‑
egfp,并纯化；
66.正向引物：5
’‑
caggtcgactctagaggatccgagggcagaggaagtctgcta
‑3’
(seq id no 5)
67.反向引物：5
’‑
tatctggcctccccagcatgcctgctattc
‑3’
(seq id no 6)
68.引物5’端划线小写字母标注的序列为同源臂序列
69.(6)puc19(addgene#50005)bamhi,kpni酶切纯化回收；
70.(7)使用同源重组试剂盒(近岸蛋白)将(3)和(5)中扩增的cmv
‑
puror
‑
polya和t2a
‑
egfp两个片段连接到(6)中的puc19载体的bamhi和kpni之间，得到puc19
‑
t2a
‑
egfp
‑
cmv
‑
puror质粒。
71.实施例2：在实施例1中构建的工具载体中插入tph2基因的左右同源臂，构建tph2报告基因供体载体
72.(1)从h9中提取基因组dna，并以此作为模板扩增tph2终止密码子前后的左右同源臂片段并纯化。
73.左同源臂扩增引物：
74.正向引物：5
’‑
cttgcatgcctgcagtctctctgcctctctctccc
‑3’
(seq id no 7)
75.反向引物：5
’‑
acttcctctgccctcaatccccagatattggttcatttt
‑3’
(seq id no 8)
76.右同源臂扩增引物：
77.正向引物：5
’‑
ctatggcttaagcgctgatgcctggaactatgttgt
‑3’
(seq id no 9)
78.反向引物：5
’‑
agtgaattcgagctcgatttctgaccctttgtgggc
‑3’
(seq id no 10)
79.(2)puc19
‑
t2a
‑
egfp
‑
cmv
‑
puror使用kpni、nhei、sali、bamhi酶切纯化。
80.(3)分别将左右同源臂重组到puc19
‑
t2a
‑
egfp
‑
cmv
‑
puror的sali、bamhi和kpni nhei之间，转化dh5α感受态挑取单克隆菌落，测序验证重组成功的供体载体tph2
‑
t2a
‑
egfp。
81.实施例3：构建靶向tph2终止密码子附近的打靶载体px330
‑
sgt
82.(1)使用sgrna设计网站(网址：https://zlab.bio/guide
‑
design
‑
resources)获得一系列候选sgrna序列，选择覆盖tph2终止密码子且切割效率高、脱靶效率低的sgrna,具体序列如下：
83.sgt
‑
f:5
’‑
caccgatatctggggatttgatgcc
‑3’
(seq id no 11)
84.sgt
‑
r:5
’‑
aaacggcatcaaatccccagatatc
‑3’
(seq id no 12)
85.小写字母序列是bbsi位点酶切后互补的粘性末端，划线序列为终止密码子
86.(2)寡链退火并磷酸化形成双链sgt。
87.(3)将露出粘性末端的双链sgt通过酶切连接插入到px330(addgene#42230)的bbsi酶切位点，转化感受态挑取单克隆菌落，测序鉴定得到px330
‑
sgt载体。
88.实施例4：tph2
‑
egfp人多能干细胞系的构建
89.(1)使用tryple将人多能干细胞消化成单细胞
90.(2)1*106细胞重悬到400ul hepes电转缓冲液，加入5μg px330
‑
sgt和10μg tph2
‑
t2a
‑
egfp，并转移到宽度4mm的电击杯中，放入到伯乐电穿孔仪(biorad genepulser xcell)
91.(3)电转参数设置为：指数波，电压250v，电容500μf，执行电转程序
92.(4)按照8*103/cm2密度,将细胞种到提前铺了x射线处理的小鼠成纤维细胞的六孔板
93.(5)电转24小时后，经0.4μg/ml嘌呤霉素药筛一周
94.(6)电转后10
‑
17天挑取单克隆细胞，进行扩增
95.(7)提取细胞基因组dna，进行pcr扩增鉴定成功打靶的tph2
‑
egfp报告血清素神经元的细胞系。
96.(8)鉴定原理示意图如图3所示，若5tp和3tp有扩增产物，而tn在无扩增产物则左右同源臂之间的t2a
‑
egfp
‑
cmv
‑
puror序列完整插入到tph2基因的终止密码子5’端，且是纯合子；若5tp、3tp以及tn都有扩增产物，则只在一条染色体上插入，即为杂合子；若5tp、3tp无扩增产物，而tn有扩增产物则未插入；若5tp和3tp只有一条有扩增产物则为部分插入。tph2报告基因细胞系为杂合子，鉴定如图4所示。
97.(9)鉴定序列如下：
98.5tp序列扩增序列长度为1623bp；
99.5tp
‑
f：5
’‑
agacctggactaaagcccca
‑3’
(seq id no 13)
100.5tp
‑
r：5
’‑
tcgacgtcaccgcatgttag
‑3’
(seq id no 14)
101.3tp序列扩增序列长度为1848bp；
102.3tp
‑
f：5
’‑
cggtgcctgatttaaaccgc
‑3’
(seq id no 15)
103.3tp
‑
r：5
’‑
ctccctgatgtgtcttttagctct
‑3’
(seq id no 16)
ctttagattg atttaaaact tcatttttaa tttaaaagga tctaggtgaa gatccttttt gataatctca tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt tcttctagtg tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaact
118.对比例1：单链向导rna靶向序列未覆盖终止密码子导致cas9蛋白二次切割
119.(1)使用sgrna设计网站(网址：https://zlab.bio/guide
‑
design
‑
resources)获得一系列候选sgrna序列，选择距离终止密码子上游6bp且切割效率高、脱靶效率低的sgrna，具体序列如下：
120.sgt
‑
f1:caccgacaaaatgaaccaatatctg(seq id no 25)
121.sgt
‑
r1:aaaccagatattggttcattttgtc(seq id no 26)
122.划线序列是bbsi位点酶切后互补的粘性末端。
123.(2)根据实施例3所述的方法获得px330
‑
sgt1载体。
124.(3)根据实施例4所述的方法获得tph2
‑
egfp报告血清素神经元的细胞系，并进行鉴定。测序结果显示虽然在tph2终止密码子上游成功插入了报告基因，但是由于sgrna又重新识别靶向序列，引导cas9蛋白二次切割，导致tph2基因在该位点发生碱基缺失。本发明专利将sgrna序列覆盖tph2基因终止密码子，插入报告基因后原始sgrna识别序列被破坏，从而防止二次切割。
125.对比例2：tph2
‑
egfp人多能干细胞系的构建方法的优化
126.将质粒导入到细胞种常见的方法包括脂质体转染，pei转和电穿孔等，我们尝试并比较了脂质体转染，pei转和电穿孔方法的转染效率，发现电穿孔的效率更高。并对电穿孔的过程进一步优化，具体实施方法如下：
127.(1)根据实施例4所述的步骤(1)
‑
(4)获得电转的细胞，按照2*103/cm2、8*103/cm2、3.2*104/cm2的密度种到铺了x射线处理过的小鼠成纤维细胞的六孔板。
128.(2)根据实施例4所述的步骤(6)进行药筛，电转后10
‑
17天，2*103/cm2最终存活的克隆少，3.2*104/cm2接种密度最终克隆密度大，不方便挑取单克隆，8*103/cm2接种密度最为合适。
129.对比例3：tph2
‑
egfp人多能干细胞系的构建方法的优化
130.(1)根据实施例4所述的步骤(1)
‑
(4)获得电转后的细胞，分别在电转24小时后使用0.2μg/ml、0.3μg/ml、0.4μg/ml、0.5μg/ml嘌呤霉素药筛一周。
131.(2)根据实施例4所述的步骤(6)
‑
(9)挑取克隆进行验证，最终0.4μg/ml嘌呤霉素处理组的阳性克隆的概率最高。
132.对比例4：无荧光标记的血清素神经元的电生理检测
133.无荧光标记的分化来源的血清素神经元电生理检测，通常需要检测多个细胞，并给检测的细胞注入荧光染料，最终通过细胞免疫荧光检测血清素神经元标志物，两者共定位才能确定检测的神经元即为血清素神经元。本发明专利通过tph2
‑
egfp绿色荧光指示血
清素神经元，从而减少电生理检测过程的工作量，提高检测效率。
134.综上所述，本发明的tph2报告基因人多能干细胞系体外定向诱导分化来源的血清素神经元特异性表达绿色荧光蛋白，可以合成血清素神经递质并具有成熟的电生理功能。绿色荧光标记的血清素神经元有利于在混合的分化体系中指示出血清素神经元，从而有利于对人类血清素元形态和功能的研究，在重度抑郁症等疾病的药物筛选方面具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。
135.申请人声明，本发明通过实施例详细说明了tph2报告基因人多能干细胞系的构建方法以及应用，但本发明不局限于实施例所述的实验方法。对本发明的任何改进，包括对本发明内所使用的细胞系以及质粒的替换、具体实施方案等，均属于本发明的保护范围和公开范围之内。
136.上述相关说明以及对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和应用本发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些内容做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述相关说明以及对实施例的描述，本领域的技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。